Este protocolo descreve o isolamento semi-automatizado da fração vascular estromal (FVS) do tecido adiposo murino para obtenção de pré-adipócitos e diferenciação de adipócitos in vitro. O uso de um dissociador tecidual para digestão da colagenase reduz a variação experimental e aumenta a reprodutibilidade.
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Artigo de método
Isolamento Semi-Automatizado da Fração Vascular Estromal do Tecido Adiposo Branco Murino Usando um Dissociador de Tecido
Neste artigo
Resumo
Resumo
O estudo in vitro da diferenciação de adipócitos brancos, marrons e beges permite a investigação das funções autônomas celulares dos adipócitos e seus mecanismos. Linhagens celulares de pré-adipócitos brancos imortalizadas são publicamente disponíveis e amplamente utilizadas. No entanto, a emergência de adipócitos beges no tecido adiposo branco em resposta a pistas externas é difícil de recapitular em toda a extensão usando linhagens de células de adipócitos brancos disponíveis publicamente. O isolamento da fração vascular estromal (FVS) do tecido adiposo murino é comumente realizado para obtenção de pré-adipócitos primários e diferenciação de adipócitos. No entanto, a picagem e digestão manual do tecido adiposo pela colagenase pode resultar em variação experimental e é propensa à contaminação. Apresentamos um protocolo semi-automatizado modificado que utiliza um dissociador tecidual para digestão da colagenase para facilitar o isolamento da FVS, com o objetivo de reduzir a variação experimental, reduzir a contaminação e aumentar a reprodutibilidade. Os pré-adipócitos e adipócitos diferenciados obtidos podem ser utilizados para análises funcionais e mecanísticas.
Introdução
A biologia do tecido adiposo tem atraído cada vez mais atenção devido à crescente prevalência de obesidade e diabetes tipo 2 em todo omundo1. Os adipócitos armazenam energia em excesso na forma de gotículas lipídicas, que são liberadas após a fome. Além disso, o tecido adiposo mantém a homeostase energética sistêmica por servir como órgão endócrino e se comunicar com outros tecidos 2,3. Curiosamente, tanto o excesso de tecido adiposo (obesidade) quanto a perda adiposa (lipodistrofia) estão ligados à resistência à insulina e ao diabetes1. Os adipócitos são dividid....
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Protocolo
Todos os experimentos com animais descritos neste protocolo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Tóquio e realizados de acordo com as diretrizes institucionais da Universidade de Tóquio.
1. Preparação da solução enzimática e do meio
- Colocar ambos os lados do tecido adiposo branco inguinal (lado direito e esquerdo, aproximadamente 150 mg) de um camundongo de 7-8 semanas de idade e 2,5 mL de solução enzimática no tubo C do dissociador.
- Reconstituir a Enzima D com 3 mL de meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM)/F12 sem soro fetal bovino (SFB) ....
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Resultados
Este protocolo produz adipócitos totalmente diferenciados e carregados de lipídios 7 dias após a indução da diferenciação dos adipócitos. O grau de diferenciação dos adipócitos pode ser avaliado pela coloração vermelho óleo de triglicérides e lipídios (Figura 1A), ou análise da expressão de RNAm por meio de qPCR-RT de genes de adipócitos, como o regulador mestre da adipogênese Pparg e seu alvo Fabp4 (Figura 1B). Para induzir a diferenciação in .......
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Discussão
Neste trabalho, descrevemos um protocolo de isolamento da FVS do tecido adiposo murino para obtenção de pré-adipócitos e diferenciação de adipócitos in vitro. O uso de dissociador tecidual para digestão da colagenase diminuiu a variação experimental, diminuiu o risco de contaminação e aumentou a reprodutibilidade. Embora esse procedimento seja uma etapa crítica dentro do protocolo apresentado, o processo é altamente automatizado e a otimização não é necessária. No entanto, dependendo da idade do rato e do depósi.......
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Divulgações
Nenhum dos autores tem interesse financeiro concorrente relacionado a este trabalho.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer a Takahito Wada e Saiko Yoshida (Universidade de Tóquio, Tóquio, Japão) por sua assistência experimental. Este trabalho foi financiado pelas seguintes bolsas para Y.H.: bolsa de pesquisa do Programa de Jovens Pesquisadores Excelentes da Universidade de Tóquio; Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant-in-Aid for Early-Career Scientists, bolsa número 19K17976; bolsa para o Front Runner of Future Diabetes Research (FFDR) da Japan Foundation for Applied Enzymology, bolsa número 17F005; bolsa da Fundação de Pesquisa Farmacológica; bolsa da Fundação Memorial Mochida para Pesquisa Médica e Farmacêutica; bolsa da MSD Li....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Prato de 100 mm | Corning | 430167 | |
| prato de 12 poços | Corning | 3513 | |
| Prato de 60 mm | IWAKI | 3010-060 | |
| Kit de Dissociação de Tecido Adiposo, camundongo e rato | Miltenyi Biotec | 130-105-808 | conteúdo: Enzima D, Enzima R, Enzima A e Tampão A |
| Filtro de células 70 µ m | BD falcon | #352350 | |
| Pratos revestidos com colágeno, 100 mm | BD | #356450 | |
| Pratos revestidos com colágeno, 60 mm | BD | #354401 | |
| Microplaca de revestimento de colágeno I 6 poços | IWAKI | 4810-010 | |
| Dexametasona | Wako | 041-18861 | |
| Pinça de dissecação | N/A | N/A | autoclave antes do uso |
| Tesoura de dissecação, autoclave sem corte/afiada | N/A | N/A | antes |
| do uso Tesoura de dissecação, afiada/afiada | N/A | /A | autoclave antes do uso |
| DMEM/F-12, suplemento GlutaMAX | Gibco | 10565-042 | |
| Soro Fetal Bovino (FBS) | N/ | A N/ | |
| gentleMACS C Tubes | Milteny Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACSOcto Dissociador com Aquecedores | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Humulin R Injeção U-100 | Eli Lilly | 872492 | |
| Indometacina | Sigma | I7378-5G | |
| Isobutilmetilxantina (IBMX) | Sigma | 17018-1G | |
| Lipofectamina 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
| Neomicina Sulfato | Fujifilm | 146-08871 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-062 | |
| pBABE-neo largeTcDNA (SV40) | Add gene | #1780 | |
| PBS comprimidos | Takara | T900 | |
| Platinum-E (Plat-E) Embalagem Retroviral Linha Celular | biolab | celular RV-101 | |
| Polybrene | Nacalai Tesque | 12996-81 | |
| Power Sybr Green Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | TOYOBO | #FSQ-201 | |
| RNeasy Mini Kit (250) | QIAGEN | 74106 | |
| Rosiglitazone | Wako | 180-02653 | |
| T3 | Sigma | T2877-100mg | |
| Tripsina-EDTA (0,05%) | Gibco | 25200-056 |
Referências
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Hotamisligil, G. S., Shargill, N. S., Spiegelman, B. M. Adipose expression of tumor necrosis factor-alpha: direct role in obesity-linked insulin resistance. Science.
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Reimpressões e permissões
