Armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) estão associadas a várias doenças, e a imunofluorescência é frequentemente usada para sua visualização. No entanto, existem vários protocolos de coloração e, em muitos casos, apenas um tipo de tecido é examinado. Aqui, estabelecemos um protocolo geralmente aplicável para coloração de NETs em tecido humano e de camundongo.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Imagem por Imunofluorescência de Armadilhas Extracelulares de Neutrófilos em Tecidos Humanos e de Camundongos
Neste artigo
Aviso de errata
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Resumo
Resumo
As armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) são liberadas pelos neutrófilos como resposta à infecção bacteriana ou dano traumático do tecido, mas também desempenham um papel em doenças autoimunes e inflamação estéril. São estruturas semelhantes a teias compostas por filamentos de DNA de fita dupla, histonas e proteínas antimicrobianas. Uma vez liberados, os NETs podem capturar e matar patógenos extracelulares no sangue e no tecido. Além disso, os TNEs participam da regulação homeostática, estimulando a adesão plaquetária e a coagulação. No entanto, a produção desregulada de TNEs também tem sido associada a várias doenças, incluindo sepse ou doenças autoimunes, o que as torna um alvo promissor para intervenção terapêutica. Além da microscopia eletrônica, a visualização de NETs usando imagens de imunofluorescência é atualmente um dos únicos métodos conhecidos para demonstrar interações de NET no tecido. Portanto, vários métodos de coloração para visualização de NETs têm sido utilizados. Na literatura, diferentes protocolos de coloração são descritos, e identificamos quatro componentes-chave mostrando alta variabilidade entre os protocolos: (1) os tipos de anticorpos utilizados, (2) o uso de agentes redutores de autofluorescência, (3) métodos de recuperação de antígenos e (4) permeabilização. Portanto, os protocolos de coloração por imunofluorescência in vitro foram adaptados e aprimorados sistemicamente neste trabalho para torná-los aplicáveis a diferentes espécies (camundongo, humano) e tecidos (pele, intestino, pulmão, fígado, coração, disco vertebral). Após fixação e inclusão em parafina, cortes de 3 μm de espessura foram montados sobre as lâminas. Essas amostras foram coradas com anticorpos primários para mieloperoxidase (MPO), histona citrulinada H3 (H3cit) e elastase neutrofílica (NE) de acordo com um protocolo de coloração modificado. As lâminas foram coradas com anticorpos secundários e examinadas em microscópio de fluorescência de campo largo. Os resultados foram analisados de acordo com uma ficha de avaliação, e as diferenças foram registradas semiquantitativamente.
Aqui, apresentamos um protocolo otimizado de coloração NET adequado para diferentes tecidos. Usamos um novo anticorpo primário para corar para H3cit e reduzimos a coloração inespecífica com um agente redutor de autofluorescência. Além disso, demonstramos que a coloração NET requer uma alta temperatura constante e manuseio cuidadoso das amostras.
Introdução
As armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) foram visualizadas pela primeira vez por Brinkmann e col. como uma via de morte celular diferente da apoptose e necrose em 20041. Nessa via, os neutrófilos liberam sua cromatina descondensada no espaço extracelular para formar grandes estruturas semelhantes a teias cobertas por proteínas antimicrobianas que antes eram armazenadas nos grânulos ou citosol. Essas proteínas antimicrobianas incluem elastase neutrofílica (NE), mieloperoxidase (MPO) e histona citrulinada H3 (H3cit), que são comumente usadas para detecção por imunofluorescência indireta de NETs2. Esse método não....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Este estudo incluiu tecidos de camundongos derivados de experimentos aprovados pela Administração Estadual de Pesquisa Animal de Hamburgo, Behörde für Justiz und Verbraucherschutz, Hamburgo, Alemanha (73/17, 100/17, 94/16, 109/2018, 63/16). Os tecidos utilizados foram pulmão e cólon de camundongo de modelo séptico e pele queimada. Foram utilizados camundongos machos e fêmeas com 8 semanas de idade. A Diretiva Europeia 2010/63/UE relativa à proteção dos animais utilizados para fins científicos foi seguida em todas as experiências. As amostras humanas anonimizadas incluíram tecidos de enterocolite neonatal, pele queimada, atresia biliar, espondilodiscite e miocárdio. De....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Antes de iniciar nossa otimização de protocolo, identificamos os principais passos para o sucesso da coloração, pesquisando no PubMed estudos que utilizaram tecido FFPE para a imunomarcação de NETs e comparamos seus protocolos. As diferenças de protocolo mais promissoras foram identificadas como os passos chave para a otimização do protocolo, enquanto os passos que correspondiam em sua maioria não foram alterados (Tabela 1).
Tabela 1: Pesquisa PubMed para imunomarcação.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Neste trabalho, nosso objetivo foi adaptar e otimizar os protocolos existentes de obtenção de imagens de TNEs para mais tipos de tecidos, começando pelo processo de coloração propriamente dito. O primeiro passo crítico para este método é a seleção dos anticorpos mais adequados. Para NE, tentamos um anticorpo NE de um hospedeiro de camundongo em tecido humano, que não mostrou coloração confiável em comparação com NE de um hospedeiro coelho. Além disso, Thålin et al., propuseram o H3cit (R8) como um anticorpo mais específi.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi fundada pela Sociedade Alemã de Pesquisa (BO5534). Agradecemos a Antonia Kiwitt, Moritz Lenz, Johanna Hagens, Dra. Annika Heuer e PD Dr. Ingo Königs por nos fornecerem amostras. Além disso, os autores agradecem à equipe do UKE Microscopy Imaging Facility (Core facility, UKE Medical School) pelo suporte com a microscopia de imunofluorescência.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Diluição | |||
| Anticorpo anti-Elastase Neutrophil 100µ g | abcam | Ab 68672 | 1:100 |
| Anticorpo anti-histona H3 (citrulina R2 + R8 + R17) 100µ g | abcam | Ab 5103 | 1:50 |
| Anti-Mieloperoxidase anticorpo [2C7] anti-humano 100 µ g | abcam | Ab 25989 | 1:50 |
| Anti-Mieloperoxidase anticorpo [2D4] anti-camundongo 50 µ g | abcam | Ab 90810 | 1:50 |
| Software de Microscopia Axiovision | Zeiss | 4.8.2. | |
| Solução de bloqueio com soro de burro (PRONTO PARA USAR) 50ml | GeneTex | ||
| Lamínulas | Marienfeld | 0101202 | |
| Dako Solução de Recuperação de Alvo Citrato pH6 (x10) | Dako | S2369 | |
| DAPI 25 mg | Roth | 6335.1 | 1:25000 |
| DCS diluição de anticorpos 500 mL | DCS diagnósticos | DCS AL120R500 | |
| Burro formiga cabra Cy3 | JacksonImmunoResearch | 705-165-147 | 1:200 |
| Burro anti-coelho AF647 | JacksonImmunoResearch | 711-605-152 | 1:200 |
| Burro anti-coelho Cy3 | JacksonImmunoResearch | 711-165-152 | 1:200 |
| Fluoromount-G Meio de montagem | Invitrogen | 00-4958-02 | |
| Rack de slides de vidro | Roth | H552.1 | |
| Humano/Camundongo MPO Anticorpo | R& D Systems | AF 3667 | 1:20 |
| Caneta hidrofóbica | KISKER | MKP-1 | |
| Isokontrolle Rabbit IgG Policlonal 5mg | abcam | Ab 37415 | 1:2000 e 1:250 |
| MaxBlock Kit de reagente redutor de autofluorescência (RUO) 100 ml | Maxvision | MB-L | |
| Câmera de microscopia | Zeiss | AxioCamHR3 | |
| Microondas | Bosch | HMT84M421 | |
| Mouse IgG1 controle negativo | Dako | X0931 Aglient | 1:50 e 1:5 |
| Normal Goat IgG Control | R& D Systems | AB-108-C | 1:100 |
| PBS Fosfato tampolado salina (10x) | Sigma-Aldrich | P-3813 | |
| Frasco de coloração PMP | Roth | 2292.2 | |
| Anti-histona recombinante H3 (citrulina R8) anticorpo 100µ g | abcam | Ab 219406 | 1:100 |
| Coelho Recombinante IgG, monoclonal [EPR25A] - Controle de Isotipo 200µ g | abcam | Ab 172730 | 1:300 |
| ROTI Histol | Roth | 6640 | |
| SuperFrost Plus slides | R. Langenbrinck | 03-0060 | |
| TBS Tris tamponado com solução salina (x10) | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Banho-maria | Memmert | 830476 | |
| Panela de arroz para banho-maria | reishunger | RCP-30 | |
| Câmara úmida | Weckert Labortechnik | 600016 | |
| Zeiss Microscópio de campo amplo | Zeiss | Axiovert 200M |
Referências
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host ....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
Errata
Formal Correction: Erratum: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues
Posted by JoVE Editors on 9/29/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues. The Authors section was updated from:
Lavinia Schöenfeld1
Birgit Appl1
Laia Pagerols-Raluy1
Annika Heuer3
Konrad Reinshagen1
Michael Boettcher1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)
to:
Lavinia Schoenfeld1
Birgit Appl1
Laia Pagerols-Raluy1
Annika Heuer3
Konrad Reinshagen1
Michael Boettcher1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)
