Method Article

Desenvolvimento de um Sistema de Ensaio Alimentar para Avaliação do Efeito Inseticida de Fitoquímicos sobre Helicoverpa armigera

DOI:

10.3791/65278

⸱

May 26th, 2023

 ,  ,  , 
1Biochemical Sciences Division, CSIR-National Chemical Laboratory, 2Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR)

In This Article

Summary

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Este protocolo descreve o ensaio alimentar obrigatório para avaliar o efeito potencialmente tóxico de um fitoquímico sobre as larvas de insetos lepidópteros. Este é um bioensaio de insetos altamente escalável, fácil de otimizar a dose subletal e letal, atividade dissuasora e efeito fisiológico. Isso poderia ser usado para a triagem de inseticidas ecológicos.

Abstract

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Helicoverpa armigera, um inseto lepidóptero, é uma praga polífaga com distribuição mundial. Este inseto herbívoro é uma ameaça às plantas e à produtividade agrícola. Em resposta, as plantas produzem vários fitoquímicos que impactam negativamente o crescimento e a sobrevivência do inseto. Este protocolo demonstra um método de ensaio alimentar obrigatório para avaliar o efeito de um fitoquímico (quercetina) sobre o crescimento, desenvolvimento e sobrevivência de insetos. Sob condições controladas, os neonatos foram mantidos até o segundo ínstar em dieta artificial pré-definida. Essas larvas de segundo ínstar foram autorizadas a se alimentar de uma dieta artificial controle e contendo quercetina por 10 dias. O peso corporal dos insetos, o estágio de desenvolvimento, o peso do frass e a mortalidade foram registrados em dias alternados. A mudança no peso corporal, a diferença no padrão alimentar e fenótipos de desenvolvimento foram avaliados ao longo do tempo de ensaio. O ensaio alimentar obrigatório descrito simula um modo natural de ingestão e pode ser escalado para um grande número de insetos. Permite analisar o efeito de fitoquímicos na dinâmica de crescimento, transição de desenvolvimento e aptidão geral de H. armigera. Além disso, esse arranjo também pode ser utilizado para avaliar alterações em parâmetros nutricionais e processos fisiológicos digestivos. Este artigo fornece uma metodologia detalhada para sistemas de ensaio de alimentação, que pode ter aplicações em estudos toxicológicos, triagem de moléculas inseticidas e compreensão de efeitos químicos em interações planta-inseto.

Introduction

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Os fatores bióticos que afetam a produtividade das culturas são principalmente agentes patogênicos e pragas. Vários insetos-praga causam de 15% a 35% das perdas nas culturas agrícolas e afetam as práticas de sustentabilidade econômica1. Insetos pertencentes às ordens Coleoptera, Hemiptera e Lepidoptera são as principais ordens de pragas devastadoras. A natureza altamente adaptativa do ambiente tem beneficiado os lepidópteros na evolução de vários mecanismos de sobrevivência. Dentre os insetos lepidópteros, Helicoverpa armigera (Cotton bollworm) pode se alimentar de cerca de 180 culturas diferentes e causar danos significativos aos seus tecidos reprodutivos2. Em todo o mundo, a infestação por H. armigera resultou em uma perda de cerca de US$ 5 bilhões3. Algodão, grão-de-bico, feijão guandu, tomate, girassol e outras culturas são hospedeiros de H. armigera. Ele completa seu ciclo de vida em diferentes partes das plantas hospedeiras. Ovos postos por mariposas fêmeas eclodem nas folhas, seguindo-se de sua alimentação em tecidos vegetativos durante os estágios larvais. A fase larval é a mais destrutiva devido à sua natureza voraz e altamenteadaptável4,5. H. armigera apresenta distribuição global e invasão de novos territórios devido a seus atributos marcantes, como polifagia, excelentes habilidades migratórias, maior fecundidade, forte diapausa e surgimento de resistência às estratégias de controle de insetos existentes6.

Diversas moléculas químicas provenientes de terpenos, flavonoides, alcaloides, polifenóis, glicosídeos cianogênicos e muitos outros são amplamente utilizadas para o controle da infestação por H. armigera 7. No entanto, a aplicação frequente de moléculas químicas acarreta efeitos adversos ao meio ambiente e à saúde humana devido à aquisição de seus resíduos. Além disso, apresentam efeito prejudicial sobre vários predadores de pragas, resultando em desequilíbrio ecológico 8,9. Portanto, há necessidade de investigar opções seguras e ecologicamente corretas para moléculas químicas de controle de pragas.

Moléculas inseticidas naturais produzidas por plantas (fitoquímicos) podem ser usadas como uma alternativa promissora aos pesticidas químicos. Esses fitoquímicos incluem vários metabólitos secundários pertencentes às classes alcaloides, terpenóides e fenólicos 7,10. A quercetina é um dos flavonoides (compostos fenólicos) mais abundantes presentes em vários grãos, vegetais, frutas e folhas. Apresenta atividade dissuasora alimentar e inseticida contra insetos; Além disso, não é prejudicial aos inimigos naturais de pragas11,12. Assim, este protocolo demonstra o ensaio alimentar utilizando quercetina para avaliar seu efeito tóxico sobre H. armigera.

Vários métodos de bioensaio têm sido desenvolvidos para avaliar o efeito de moléculas naturais e sintéticas sobre a alimentação, crescimento, desenvolvimento e padrões comportamentais de um inseto13. Os métodos comumente utilizados incluem o ensaio de disco foliar, ensaio de escolha alimentar, ensaio de alimentação por gotículas, ensaio de contato, ensaio de cobertura de dieta e ensaio de alimentação obrigatória13,14. Esses métodos são classificados com base em como os pesticidas são aplicados aos insetos. O ensaio alimentar obrigatório é um dos métodos mais comumente utilizados, sensíveis, simples e adaptáveis para testar prováveis inseticidas e sua dose letal14. Em um ensaio de alimentação obrigatória, a molécula de interesse é misturada com uma dieta artificial. Isso proporciona consistência e controle sobre a composição da dieta, gerando resultados robustos e reprodutíveis. Variáveis importantes que afetam os ensaios alimentares são o estágio de desenvolvimento do inseto, a escolha do inseticida, fatores ambientais e tamanho da amostra. A duração do ensaio, o intervalo entre dois registros de dados, a frequência e a quantidade de dieta alimentada, a saúde dos insetos e a habilidade de manuseio dos operadores também podem influenciar o resultado dos ensaios alimentares 14,15.

Este estudo tem como objetivo demonstrar o ensaio de obrigatoriedade alimentar para avaliar o efeito da quercetina na sobrevivência e aptidão física de H. armigera . A avaliação de vários parâmetros, como peso corporal do inseto, taxa de mortalidade e defeitos de desenvolvimento, fornecerá informações sobre os efeitos inseticidas da quercetina. Enquanto isso, a mensuração de parâmetros nutricionais, incluindo a eficiência de conversão do alimento ingerido (ECI), eficiência de conversão do alimento digerido (ECD) e digestibilidade aproximada (AD), destacará os atributos antialimentares da quercetina.

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Protocol

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Larvas de H. armigera foram adquiridas do ICAR-National Bureau of Agricultural Insect Resources (NBAIR), Bangalore, Índia. Um total de 21 larvas de segundo estádio foi utilizado para o presente estudo.

1. Preparação de dieta artificial à base de grão-de-bico

NOTA: Uma lista de ingredientes necessários para preparar uma dieta artificial é mencionada na Tabela 1.

  1. Pesar todas as fracções separadamente num copo, tal como indicado no quadro 1, e preparar uma mistura homogénea utilizando uma espátula/agitador magnético.
  2. Ferva a Fração C a cerca de 100 °C usando um micro-ondas por 5 min, adicione à Fração A e misture bem.
  3. Depois de misturar completamente, deixe a fração mista esfriar um pouco antes de adicionar a Fração B (a Fração B contém componentes termolábeis).
  4. Despeje em uma placa de Petri transparente, de poliestireno, 150 mm x 150 mm.

2. Preparação de dieta artificial contendo quercetina

  1. Pesar a quantidade adequada (1.000 ppm) de hidrato de quercetina (ver Tabela de Materiais) e dissolvê-la adequadamente no volume mínimo de solventes orgânicos, como etanol (2 mg/mL), dimetilsulfóxido (DMSO; 30 mg/mL) ou dimetilformamida (DMF). Aqui, DMSO é usado para dissolver quercetina.
  2. Adicionar quercetina dissolvida na Fração B, seguida de adição na mistura das Frações A e C (o volume de água reduzido da Fração B é igual ao volume de DMSO adicionado).
  3. Adicione um volume igual de solvente orgânico usado para dissolver a quercetina na dieta controle.
    NOTA: A Figura 1 mostra a representação esquemática do preparo de dietas artificiais e contendo quercetina.

3. Criação e manutenção da cultura de H. armigera

OBS: Utilizar materiais adequadamente limpos e esterilizados para criação e manutenção de insetos. Manusear os insetos cuidadosamente, seguindo todas as práticas operacionais padrão relacionadas à esterilidade e segurança 16,17,18.

  1. Manter os ovos de H. armigera na câmara de reprodução (frasco plástico coberto com pano de musselina nas condições de manutenção, conforme descrito na etapa 3.3. Em seguida, transfira suavemente neonatos recém-surgidos usando um pincel fino em uma dieta artificial à base de grão-de-bico recém-preparada.
  2. Utilizar dieta artificial para criação das larvas e solução de sacarose a 20% (p/v) com multivitamínico a 1% (p/v) (ver Tabela de Materiais) para mariposas adultas19,20.
    NOTA: Como as larvas de terceiro e mais velho ínstar de H. armigera apresentam uma tendência canibalística, é necessário criar cada larva em um frasco separado.
  3. Manter a temperatura de 25 ± 1 °C e umidade relativa do ar de 70% na sala de cultivo de insetos, com fotoperíodo de 16 h claro:8 h escuro21.
  4. Criar uma geração de insetos no laboratório para homogeneidade e, em seguida, usá-lo para o ensaio de alimentação.
  5. Opcionalmente, aumentar a temperatura da sala de cultivo de insetos para 28 °C para acelerar o crescimento de larvas e pupas22.

4. Configuração para o ensaio de alimentação

  1. Coletar larvas de 21 segundos ínstares para cada conjunto (controle e tratamento) e mantê-las longe da dieta, por aproximadamente 1-3 h.
  2. Corte a dieta controle e contendo quercetina em pequenos pedaços, registre o peso da dieta dada e o corpo do inseto e transfira cuidadosamente os insetos para frascos de cultura. Permita que os insetos se alimentem da respectiva dieta.
    NOTA: Isso deve ser considerado como o Dia 0 do ensaio de alimentação.
  3. Registre o peso do corpo do inseto, dada dieta, dieta não consumida e frass em dias alternados (Dias 2, 4, 6, 8 e 10) até o 10º dia de ensaio.
  4. Após o 10º dia, mantê-los se alimentando de sua respectiva dieta para observar novas mudanças de desenvolvimento e morfológicas.
    OBS: As alterações de desenvolvimento por meio de: (1) intermediários larval-pupa, como a metade posterior da pupa com retalhos de cutícula larval, cápsula cefálica e pernas torácicas; (2) pré-pupas com corpo completamente enegrecido; (3) pupas subdimensionadas com encolhimento corporal; (4) mariposas-pupas intermediárias-mariposas com a pele pupal velha. As alterações morfológicas incluem adultos malformados de mariposas com corpos anormais, asas torcidas e pernas articuladas. Essas mudanças são então comparadas com insetos alimentados com a dieta controle.
  5. Congelar os insetos no dia 10 se o estudo de defeitos de desenvolvimento e morfológicos não for necessário.
    NOTA: Antes de congelar as larvas, elas precisam ser mantidas privadas da dieta por pelo menos 3 h para remover a dieta residual do trato digestivo.

5. Registro e análise dos dados

  1. No software GraphPad Prism (consulte Tabela de Materiais), escolha uma tabela de dados XY na caixa de diálogo "Bem-vindo ou Nova Tabela" e, nela, insira o número de insetos que replicam valores lado a lado nas subcolunas. Em seguida, dê o nome do título ao eixo X como número de dias e, nos grupos A e B, dê o nome do título como controle e tratamento com quercetina, respectivamente. Coloque o peso corporal de cada inseto sob controle e tratamento para gerar o gráfico de peso corporal.
    NOTA: A análise no GraphPad pode variar de acordo com o tamanho da amostra e o número de tratamentos.
  2. Comparar o peso corporal do inseto entre os grupos controle e tratamento usando o teste t de Student (α = 0,05).
  3. Conte as larvas e pupas vivas e mortas no Dia 10 para traçar uma curva de Kaplan-Meier para porcentagem de sobrevivência usando o software gráfico.
  4. Conte o número de pupas e calcule a porcentagem de pupação usando a fórmula dada:
  5. Porcentagem de pupação (%) = (número de pupas formadas/número total de larvas) x 100
  6. Comparar o desenvolvimento larval em termos de índices nutricionais23 utilizando as seguintes fórmulas, ICE (%) = (ganho de peso das larvas/peso da ração ingerida) x 100
    DCE (%) = (ganho de peso das larvas/[peso da ração ingerida - peso do frass]) x 100
    DA (%) = ([peso da ração consumida - peso da ração]/peso da ração ingerida) x 100

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Results

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Larvas de insetos alimentadas com uma dieta contendo 1.000 ppm de quercetina apresentaram uma diminuição significativa no peso corporal de ~57% em relação ao grupo controle (Figura 2A). A redução do peso corporal resultou na redução do tamanho corporal das larvas tratadas com quercetina (Figura 2B). Uma notável redução foi observada na taxa de alimentação das larvas alimentadas com quercetina em relação ao controle (Figura 2C).

...

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Discussion

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Bioensaios laboratoriais são úteis para prever desfechos e produzir dados comparativos de toxicidade de vários compostos em um curto período a um custo razoável. O bioensaio alimentar ajuda a interpretar as interações entre inseto-inseticida e inseto-planta-inseticida. É um método eficiente para medir a toxicidade de uma variedade de substâncias que simplifica significativamente o processo de estabelecimento da dose letal 50 (DL50), concentração letal 50 (CL50), ou qualquer outra concentração ou dos...

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Disclosures

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Os autores declararam a inexistência de conflitos de interesse.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SM, YP e VN reconhecem a bolsa concedida pela Comissão de Bolsas Universitárias, Governo da Índia, Nova Delhi. O RJ agradece ao Conselho de Pesquisa Científica e Industrial (CSIR), Índia, e ao CSIR-National Chemical Laboratory, Pune, Índia, pelo apoio financeiro sob os códigos de projeto MLP036626, MLP101526 e YSA000826.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ágar ÁgarHimediaRM666Agente solidificante
Ácido ascórbicoHimedia CMS1014Fonte de vitamina C
Bengal GramNANAFonte de proteínas e carboidratos
CaseínaSigmaC-5890 Fonte deproteína
ColesterolSisco Research Laboratories34811Fonte
Cloreto de colinaHimediaGRM6824sal de amônio
DMSOSigma67-68-5Solvente
GraphPad Prism v8.0https://www.graphpad.com/guides/prism/latest/user-guide/using_choosing_an_analysis.htm
Metil ParabenoHimediaGRM1291Agente antifúngico
Cápsula multivitamínicaGalaxoSmithKlineNAFonte vitamínica:
QuercetinaSigmaQ4951-10G
Ácido SórbicoHimediaM1880Agente antimicrobail
EstreptomicinaHimediaCMS220Antibiótico
Cápsula de vitamina ENukind HealthcareNAFonte de vitamina E
Extrato de leveduraHimediaRM027Fonte de aminoácidos
de ácidos graxos Fitoquímico

References

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