Artigo de método

Otimização dos parâmetros de desempenho do ensaio de comprimento telomérico TAGGG

DOI:

10.3791/65288

⸱

21 de abril de 2023

 ,  , 
1Sunandan Divatia School of Science, SVKM's NMIMS Deemed-to-be-University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, descrevemos em detalhes o protocolo de quantificação do comprimento dos telômeros usando detecção quimioluminescente não radioativa, com foco na otimização de vários parâmetros de desempenho do kit de ensaio de comprimento de telômeros TAGGG, tais como quantidades de tampão e concentrações de sonda.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Telômeros são sequências repetitivas que estão presentes nas extremidades cromossômicas; seu encurtamento é uma característica das células somáticas humanas. O encurtamento ocorre devido a um problema com a replicação final e à ausência da enzima telomerase, responsável pela manutenção do comprimento dos telômeros. Curiosamente, os telômeros também encurtam em resposta a vários processos fisiológicos internos, como estresse oxidativo e inflamação, que podem ser impactados devido a agentes extracelulares como poluentes, agentes infecciosos, nutrientes ou radiação. Assim, o comprimento dos telômeros serve como um excelente biomarcador do envelhecimento e de vários parâmetros fisiológicos de saúde. O kit de ensaio de comprimento de telômero TAGGG é usado para quantificar comprimentos teloméricos médios usando o ensaio de fragmento de restrição de telômeros (TRF) e é altamente reprodutível. No entanto, é um método caro e, por isso, não é empregado rotineiramente para grandes números amostrais. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para uma medição otimizada e econômica do comprimento dos telômeros usando análise de Southern blots ou TRF e detecção baseada em quimioluminescência não radioativa.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Telômeros são as sequências repetitivas de DNA presentes no final dos cromossomos. Eles têm repetições em tandem de TTAGGG e mantêm a integridade do genoma protegendo o cromossomo tanto do desgaste quanto do problema de replicação final, o que significa que parte da saliência 3' não pode ser replicada pela DNA polimerase 1,2. Telômeros curtos levam a anormalidades cromossômicas nas células, devido às quais as células ficam permanentemente presas em um estágio chamado senescência replicativa3. Os telômeros curtos também causam uma série de outros problemas, como disfunção mitocondrial 4,5 e disfunção celular.

As repetições teloméricas do DNA são perdidas à medida que a célula se divide, com perda média de 25 a 200 pb por ano 6, resultando em senescência celular após certo número de divisões6. O envelhecimento está associado à maior frequência de comorbidades, marcada pelo encurtamento do comprimento dos telômeros7. A análise do fragmento de restrição dos telômeros (TRF), como descrito por Mender, é um método muitodispendioso8. Devido a isso, ela não é implementada durante a quantificação do comprimento dos telômeros na maioria dos estudos.

Atualmente, a maioria dos estudos epidemiológicos emprega medidas quantitativas do comprimento dos telômeros baseadas na reação em cadeia da polimerase (qPCR). No entanto, o método baseado em qPCR é um método de medição relativa, pois mede a razão entre telômeros e produtos de amplificação gênica de cópia única, e não o comprimento absoluto dos telômeros. A medida do comprimento dos telômeros utilizando o protocolo TRF é o método padrão-ouro, pois pode medir a distribuição do comprimento dos telômeros na amostra e as medidas podem ser expressas em valores absolutos em quilobases (kb). No entanto, seu uso é limitado porque é pesado, trabalhoso e caro. Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para medição do comprimento dos telômeros usando TRFs baseados em quimioluminescência.

A análise do TRF inclui sete etapas principais: 1) cultivo de células para extração de DNA genômico, 2) extração de DNA genômico usando o método fenol:clorofórmio:isoamiloálcool (P:C:I), 3) digestão de restrição do DNA genômico, 4) eletroforese em gel de agarose, 5) Southern blotting do fragmento de DNA de digestão de restrição, 6) hibridização e detecção via quimioluminescência-a sonda telomérica imobilizada é visualizada por um substrato quimioluminescente altamente sensível para fosfatase alcalina, 2-cloro-5-(4-metoxispiro[1,2-dioxetano-3,2'-(5-clorotriciclo[3.3.1.13.7]decan])-4-il]-1-fenil fosfato (CDP-Star)-e 7) para obter informações sobre o comprimento e alcance telomérico médio desses esfregaços teloméricos.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os reagentes usados no protocolo abaixo. A Tabela 1 lista reagentes fabricados em laboratório juntamente com volumes otimizados e a Tabela 2 mostra as concentrações de trabalho dos reagentes disponíveis comercialmente.

1. Cultura celular

  1. Manter as células cujo comprimento telomérico deve ser medido (usadas aqui foram células A2780, que é uma linhagem celular de adenocarcinoma ovariano) em meio completo de águia modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), estreptomicina, penicilina e anfotericina B em uma placa de Petri de 6 cm. Incubar a 37 °C em ambiente umidificado e controlado contendo 5% de dióxido de carbono até que as células estejam 80%-100% confluentes.
  2. Retire o meio e lave com 5 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) 1x.
  3. Tratar as células com 1 mL de ácido tripsina-etilenodiaminotetracético (EDTA) para desprendimento das células, incubando a 37 °C por 3-5 min.
  4. Adicionar 2 mL de meio DMEM completo para inativar a tripsina e coletar as células em um tubo de centrifugação.
  5. Pelotar as células a 2.348 × g por 5 min.
  6. Lave o pellet com 1x PBS e centrifuja a 2.348 × g por 5 min.
  7. Conservar o pellet a -80 °C até nova utilização.
    Observação : a contagem de células pode variar dependendo da linha de célula. Obtivemos aproximadamente 2,5 × 10a 6 células no caso da linhagem celular A2780, que é utilizada em etapas posteriores.

2. Isolamento do DNA genômico

  1. Adicionar 500 μL de tampão de lise (10 mM tris-Cl, pH 8,0; 25 mM EDTA, pH 8,0; 100 mM NaCl; 0,5% p/v dodecil sulfato de sódio) ao pellet celular e misturar suavemente usando uma ponta de corte (com um diâmetro de abertura mínimo de 2 mm). Adicionar 20 μg/mL de RNase A recém-preparada e misturar delicadamente por inversão.
  2. Incubar a 37 °C durante 30 min e, ocasionalmente, inverter o tubo durante a incubação.
  3. Adicionar proteinase K a uma concentração final de 100 μg/mL e misturar suavemente por inversão 10 vezes. Incubar a 55 °C durante 2 h. Inverter o tubo em intervalos regulares (a cada 10 min) durante a incubação.
  4. Adicionar 500 μL de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico reagente (25:24:1) e misturar suavemente por inversão 20 vezes. Centrifugar a 9.391 × g durante 15 minutos à temperatura ambiente (cerca de 25 °C).
    NOTA: A Figura 1A mostra as três camadas obtidas após a centrifugação.
  5. Retire a camada aquosa superior viscosa das três camadas visíveis, coloque em um tubo fresco usando uma ponta de corte e adicione uma quantidade igual de clorofórmio. Misture por inversão suave 20 vezes.
  6. Centrifugar os tubos a 9.391 × g durante 15 minutos à temperatura ambiente.
  7. Recolher a camada aquosa e adicionar uma quantidade adequada de NaCl 5 M de modo a que a concentração final de NaCl seja de 0,2 M.
  8. Adicione dois volumes de etanol 100%. Misture por inversão suave 20-25 vezes. Centrifugar a 15.871 × g por 5 min à temperatura ambiente.
  9. Retire o sobrenadante e adicione 500 μL de etanol a 70% para lavar o pellet. Centrifugar a 15.871 × g por 5 min à temperatura ambiente.
  10. Retire o sobrenadante, seque o pellet ao ar por alguns minutos e adicione 50 μL de água estéril livre de nucleases. Deixe o DNA reidratar por 1-2 dias à temperatura ambiente. Misture por pipetagem, usando a ponta de corte.
  11. Medir a concentração de DNA usando espectrofotometria ultravioleta (UV). Rediluir as amostras, se necessário, usando água estéril livre de nucleases para obter uma concentração mínima de 300-500 ng/μL.
  12. Verifique a integridade do DNA executando-o em gel de agarose a 1% (Figura 1B).
  13. Conservar o ADN diluído a -20 °C até nova utilização.

3. Digestão do DNA genômico

  1. Preparar uma mistura enzimática de Rsa1 (20 U) e Hinf1 (20 U) e adicionar 2 μL de tampão de digestão de restrição por reação.
  2. Tome um volume apropriado de DNA genômico tal que a quantidade total de DNA seja de 1,5 μg. Completar o volume com água estéril livre de nucleases, de modo que o volume total após a adição da enzima seja de 20 μL.
  3. Misture bem batendo em seguida, seguido de um giro de pulso.
  4. Incubar a mistura a 37 °C durante 2 h.

4. Eletroforese em gel de agarose

  1. Prepare um gel de agarose 0,8% de 10 cm × 15 cm em tampão EDTA (TAE) de 1x tris acetato usando agarose de alto grau.
  2. Adicionar 5 μL de corante de carga a cada amostra de DNA genômico digerido, perfazendo assim o volume final de 25 μL, e carregar as amostras no gel.
  3. Preparar uma mistura de marcadores moleculares usando 1 μL de marcador molecular (escada), 3 μL de água estéril livre de nucleases e 1 μL de corante de carga 5x.
  4. Carregar 5 μL de mistura de marcadores moleculares em ambos os lados das amostras digeridas de DNA genômico se houver um número maior de amostras (~10), ou apenas em um lado se houver menos ou igual a cinco amostras.
  5. Passe o gel a 5 V/cm durante 6 h. Quando a execução estiver concluída, faça um entalhe em um canto do gel para marcar a ordem de carregamento.
  6. Submergir o gel em HCl 0,25 M por 10 min à temperatura ambiente com agitação suave.
  7. Enxágue o gel duas vezes com água destilada.
  8. Desnaturar o DNA submergindo o gel em uma solução de NaOH 0,5 M e NaCl 1,5 M duas vezes por 15 min cada em temperatura ambiente com agitação suave.
  9. Enxágue o gel duas vezes com água destilada.
  10. Neutralizar o DNA submergindo o gel em uma solução de tris-HCl 0,5 M e NaCl 3 M (pH 7,5) duas vezes por 15 min à temperatura ambiente com agitação suave.

5. Mancha do sul

  1. Corte uma membrana de nylon de 10 cm × 12 cm de tamanho e faça um entalhe na mesma posição do gel.
  2. Ativar a membrana mergulhando em água destilada seguida de tampão citrato salino de sódio (SSC) 20x (ver Tabela 1).
  3. Configure a transferência.
    1. Pegue uma bandeja de vidro limpa e coloque outra bandeja nela em posição invertida. Crie um pavio usando papel filtro normal, de modo que as extremidades estejam tocando a base da bandeja externa.
    2. Coloque o gel por cima do papel de filtro. Coloque suavemente a membrana de nylon ativado sobre o gel, com os entalhes sobrepostos, e remova quaisquer bolhas de ar rolando sobre uma haste de vidro.
    3. Coloque uma pilha de 2 cm de 9,5 cm × papel de filtro de celulose de 11,5 cm, seguida de uma pilha de 6 cm de papel de filtro comum das mesmas dimensões. Coloque um peso sobre esta configuração de modo que haja uma distribuição de peso igual abaixo. Preencha a bandeja externa com 20x buffer SSC (consulte a Figura 2).
    4. Deixe a configuração para transferência durante a noite.
  4. Após a transferência do Sul, fixe o DNA transferido na membrana por reticulação UV em um transiluminador UV ou reticulador UV. Use uma lâmpada de 302 nm 8 W por 5 min, ou uma lâmpada de 254 nm 8 W por 2 min, o que corresponde a aproximadamente 120 mJ. Certifique-se de que o lado da membrana em que o DNA é transferido esteja voltado para a lâmpada.
  5. Lavar a membrana duas vezes com 25 mL de tampão SSC 2x.
  6. Pause o protocolo, se necessário, secando completamente a mancha e armazenando-a a 2-8 °C depois de envolver vagamente em papel alumínio, até processamento adicional.

6. Hibridização e detecção por quimioluminescência

  1. Pré-aqueça o tampão de pré-hibridização a 42 °C.
    Observação : as etapas a seguir incluem volumes de soluções/buffers a serem usados por 100 cm2 de mancha.
  2. Incubar a membrana em 10 mL de tampão de pré-hibridização por 1 h a 42 °C com agitação suave para pré-hibridização.
  3. Adicionar 0,5 μL de sonda telomérica por 5 mL de tampão pré-aquecido de pré-hibridização para fazer a solução de hibridização.
  4. Incubar o coágulo em 10 ml de solução de hibridização a 42 °C durante 3 h com agitação suave.
  5. Lavar o blot com tampão rigoroso 1 (Tabela 1) duas vezes por 10 min (25 mL cada) à temperatura ambiente com agitação suave.
  6. Pré-aqueça o tampão rigoroso 2 (Tabela 1) por 30 min a 50 °C.
  7. Lavar o mancha com tampão 2 duas vezes durante 15 minutos (25 ml cada) a 50 °C com agitação suave.
  8. Enxaguar com 15 mL de tampão de lavagem por 5 min com agitação suave na RT.
  9. Incubar a membrana em 10 mL de solução de bloqueio 1x recém-preparada por 30 min à temperatura ambiente com agitação suave.
  10. Incubar a membrana em 10 ml de antidigioxigenina conjugada com solução de trabalho de fosfatase alcalina (ver Tabela 2) durante 30 minutos em RT com agitação suave.
  11. Lave a mancha duas vezes com tampão de lavagem à temperatura ambiente durante 15 minutos com agitação suave.
  12. Incubar em 10 mL de tampão de detecção por 5 min em TR com agitação suave.
  13. Remova o tampão de detecção de excesso e mantenha a membrana com o DNA voltado para cima em um saco de hibridização ou folha de acetato. Adicione ~1-1,5 mL de solução de substrato gota a gota sobre a membrana, coloque imediatamente outra folha sobre ela e incube por 5 min em RT.
  14. Esprema a solução de substrato em excesso para aquisição de imagens.
  15. Obtenha imagens do blot por aproximadamente 20 min em um sistema de imagem de documentação em gel, coletando várias imagens em diferentes pontos de tempo. Selecione imagens não saturadas para análise adicional.
    NOTA: Caso o sinal seja fraco, a imagem pode ser realizada por um longo período de tempo.

7. Análise

  1. Após a obtenção dos arquivos de imagem, exporte-os para publicação em .tif formato com a maior resolução possível (600 dpi neste caso).
  2. Instale o software Telotool . Isso requer uma versão específica (R2012a) do MATLAB (disponível gratuitamente) para ser executada.
  3. Abra o software e clique no botão Carregar arquivo de imagem no canto superior direito.
  4. Depois que a imagem for carregada, clique em Inverter Imagem, para que o plano de fundo da imagem fique preto e as manchas/faixas fiquem brancas.
  5. Recorte a imagem com os cantos superiores começando pelos poços. Depois que a seleção de corte tiver sido feita, clique com o botão direito do mouse dentro dela e selecione Cortar imagem.
  6. Depois que a imagem for cortada, clique em Calcular faixas e permita que a detecção de faixa ocorra automaticamente.
  7. Se as faixas não tiverem sido detectadas corretamente, por exemplo, se determinadas faixas não tiverem sido detectadas, ou se faixas extras ou parciais tiverem sido detectadas, execute o ajuste de faixa conforme descrito abaixo.
    1. Clique em Ajustar faixas e na janela pop-up que se abre, adicione e/ou ajuste faixas conforme necessário, e clique em Aplicar e fechar.
  8. Depois de ajustar as pistas, certifique-se de que um ponto vermelho seja visto em cada uma das pistas e ajuste as escadas usando o botão Ladder Fit , certificando-se de que o número de picos em ambas as faixas de escada estejam na mesma posição. Remova quaisquer picos estranhos usando o botão Excluir extremo .
  9. Depois que as escadas tiverem sido ajustadas, selecione Perfis de faixa, clique em Ladder Fit e selecione Polynomial Fit.
  10. Clique em Trendline, conforme recomendado pelo software, e selecione Corrigido na próxima opção.
  11. Clique em Obter Resultados para exibir os resultados como uma tabela, na qual a linha TRF Médio é a medida do comprimento dos telômeros das respectivas amostras de pista.
  12. Clique em Salvar tudo para armazenar os resultados na forma de uma planilha.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O DNA genômico extraído (gDNA), que foi executado em gel de agarose a 1%, mostrou boa integridade, como mostrado na Figura 1B, indicando que a amostra poderia ser usada para processamento posterior a jusante de TRFs. O ensaio TRF foi então realizado modificando-se os volumes de soluções necessários em cada etapa (ver Tabela 1 e Tabela 2). O sinal do TRF era bem visível (Figura 3). Assim, modificando os volumes e concentrações da...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Descrevemos um procedimento detalhado para um método não radioativo, baseado em quimioluminescência, para medição do comprimento dos telômeros usando Southern blotting. O protocolo foi testado para permitir o uso criterioso de vários reagentes sem comprometer a qualidade dos resultados. O tampão de pré-hibridização e hibridização pode ser reutilizado até cinco vezes. A concentração da enzima pode variar entre 10-20 U por 1,5-2 μg de DNA genômico sem afetar os resultados. Vários outros componentes do kit, como o marcador ...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm conflitos de interesse.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gostaríamos de agradecer à Sra. Prachi Shah por nos ajudar inicialmente com a otimização do protocolo. Gostaríamos de agradecer ao Dr. Manoj Garg por fornecer a linha de células de câncer de ovário A2780. A EK é apoiada por uma Bolsa de Pesquisa do Departamento de Biotecnologia (nº BT/RLF/Re-entry/06/2015), Departamento de Ciência e Tecnologia (ECR/2018/002117) e NMIMS Seed Grant (IO 401405).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Cell Line
A2780 (><>
Software
TeloToolVersão 1.3
Materiais
Ácido AcéticoMolychem64-19-7
AgaroseMP180720
Anfotericina BGibco, ThermoFisher Scientific, EUA
DMEM HyClone, Cytiva, EUASH30243.01
Ácido etilenodiamina tetracético Molychem6381-92-6
HI FBSGibco, ThermoFisher Scientific, EUA10270106
HClMolychem76-47-01-0
NaClMolychem7647-14-5
NaOHMolychem1310-73-2
Membrana de nylonSigma11209299001
PenicilinaGibco, ThermoFisher Scientific, EUA15240062
Dodecil sulfato de sódioAffymetrix151-21-3
EstreptomicinaGibco, ThermoFisher Scientific, EUA15240062
TrisBIORAD77-86-1
Tris HClSigma Aldrich1185-53-1
Whatman paperGE healthcare lifesciences1001-917
Reagents
1 kb ladderNEBN3232S
20x SSCInvitrogen15557-036
Anti DIG APTelo TAGGG Kit de ensaio de comprimento de telômero12209136001
Solução de bloqueio 10xTelo TAGGG Kit de ensaio de comprimento de telômero12209136001
Cutsmart BufferNEBB6004
Tampão de detecção 10xTelo TAGGG Kit de ensaio de comprimento de telômero12209136001
Dig easy hybTelo TAGGG Kit de ensaio de comprimento de telômero12209136001
Tampão de digestãoTelo TAGGG Kit de ensaio de comprimento de telômero12209136001
Hinf 1Telo TAGGG Kit de ensaio de comprimento de telômero12209136001
Hinf 1 (alternativa ao kit)NEBR0155T
Corante de carregamentoBIOLABSN3231S
Tampão de ácido maleico 10xTelo TAGGG Kit de ensaio de comprimento de telômero12209136001
marcador molecularTelo TAGGG Kit de ensaio de comprimento de telômero12209136001
SondaTelo TAGGG Kit de ensaio de comprimento de telômero12209136001
ensaio de comprimento de telômero Rsa 1 Telo TAGGG12209136001
Rsa 1 (alternativa ao kit)NEBR0167L
SubstratoTelo TAGGG Kit de ensaio de comprimento de telômero12209136001
Tampão de lavagemKit de ensaio de comprimento de telômero Telo TAGGG12209136001
de ovário 15240062Kit de

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Fragmento de Restri o do Tel meroSouthern BlottingAn lise de TRFDetec o por Quimioluminesc nciaExtra o de DNA Gen micoEletroforese em GelTamp o de Hibridiza oBiomarcador de EnvelhecimentoQuantifica o de DNA

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