Este protocolo descreve como reconstruir cristas mitocondriais para obter imagens 3D com alta precisão, alta resolução e alto rendimento.
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Artigo de método
Uma técnica tridimensional para a visualização de alterações ultraestruturais mitocondriais em células cancerosas pancreáticas
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A compreensão das características dinâmicas da ultraestrutura da organela celular, que não é apenas rica em informações desconhecidas, mas também sofisticada de uma perspectiva tridimensional (3D), é fundamental para estudos mecanísticos. A microscopia eletrônica (ME) oferece boa profundidade de imagem e permite a reconstrução de pilhas de imagens de alta resolução para investigar a morfologia ultraestrutural de organelas celulares mesmo na escala nanométrica; portanto, a reconstrução 3D está ganhando importância devido às suas vantagens incomparáveis. A microscopia eletrônica de varredura (MEV) fornece uma tecnologia de aquisição de imagens de alto rendimento que permite reconstruir grandes estruturas em 3D a partir da mesma região de interesse em cortes consecutivos. Portanto, a aplicação da MEV na reconstrução 3D em larga escala para restaurar a verdadeira ultraestrutura 3D de organelas está se tornando cada vez mais comum. Neste protocolo, sugerimos uma combinação de técnicas seriadas de corte ultrafino e reconstrução 3D para estudar cristas mitocondriais em células de câncer de pâncreas. Os detalhes de como essas técnicas são realizadas são descritos neste protocolo de forma passo a passo, incluindo o método ósmio-tiocarboidrazida-ósmio (OTO), a imagem de corte ultrafino seriada e o visor de visualização.
Introdução
As mitocôndrias são uma das organelas mais importantes da célula. Eles servem como o centro central da bioenergética e metabolismo celular 1,2 e desempenham um papel crítico no câncer3. O câncer de pâncreas (CP) é um dos cânceres mais difíceis de tratar4 devido à sua rápida disseminação e alta taxa de mortalidade. A disfunção mitocondrial, causada principalmente por alterações namorfologia mitocondrial3,5,6,7, tem sido associada aos mecanismos patológicos subjacentes aos....
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Protocolo
1. Preparação do material
- Cultivar 2 x 106 células Panc02 em 12 mL de meio DMEM (10% de soro fetal bovino e 100 U/mL de penicilina-estreptomicina), e manter a 37 °C e 95% de umidade em atmosfera de 5% de dióxido de carbono e 95% de ar por 48 h.
- Recolher células de Panc02, centrifugar a 28 x g durante 2 minutos e, em seguida, eliminar o sobrenadante. Certifique-se de que a amostra tem um tamanho adequado (1 x 107 células), caso contrário, as seguintes etapas de fixação e desidratação não funcionarão bem.
- Adicionar 1 mL de glutaraldeído a 2,5% como fixador para fixar as células frescas de Panc....
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Resultados
Durante a cultura celular (Figura 1A), primeiramente dividimos as células de câncer de pâncreas em um grupo controle cultivado com meio de cultura completo, um grupo (1S,3R)-RSL348 (RSL3, um ativador de ferroptose, 100 nM) e um grupo RSL3 (100 nM) mais ferrostatina-149 (Fer-1, um inibidor de ferroptose, 100 nM). Através das etapas experimentais acima, o microscópio eletrônico de varredura adquiriu 38 (Figura Suplementar 1), 43 (Figura S.......
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Discussão
O método aqui apresentado é um guia passo-a-passo útil para a aplicação da técnica de reconstrução 3D, que envolve a aplicação de microscopia eletrônica e tecnologia de processamento de imagens para o empilhamento e segmentação de imagens tomográficas 2D geradas a partir de cortes ultrafinos seriados. Este protocolo destaca uma limitação das imagens 2D que pode ser abordada pela visualização 3D da ultraestrutura da organela, que tem como vantagens a forte reprodutibilidade das estruturas em nível de alta resolução e maio.......
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi apoiada por subsídios da Fundação de Ciências Naturais da Província de Zhejiang (Z23H290001, LY19H280001); Subsídios da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82274364, 81673607 e 81774011); bem como o Projeto de Pesquisa de Bem-Estar Público da Bolsa de Ciência e Tecnologia de Huzhou (2021GY49, 2018GZ24). Agradecemos a grande ajuda, suporte técnico e suporte experimental da Plataforma Pública do Centro de Pesquisa Médica, Academia de Ciências Médicas Chinesas, Universidade Médica Chinesa de Zhejiang.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| (1S,3R)-RSL3 | MCE | HY-100218A | |
| Acetona | SIGMA | 179124 | |
| Amira | Visage Imaging | 2020.2 | |
| Ácido aspártico | MCE | HY-42068 | |
| Águia modificada de Dulbecco' s meio | Gibco | 11995115 | |
| Etanol | Merck | 100983 | |
| Ferrostatin-1 | MCE | HY-100579 | |
| Soro bovino fetal | Gibco | 10437010 | |
| Microscópio eletrônico de varredura por emissão de campo | HITACHI | SU8010 | |
| Glutaraldeído | Alfa Aesar | A10500.22 | |
| Chumbo nitrato | SANTA CRUZ | sc-211724 | |
| Tetróxido de Ósmio | SANTA CRUZ | sc-206008B | |
| Panc02 | Coleção Europeia de Culturas de Células Autenticadas | ||
| Penicilina-estreptomicina | Biosharp | BL505A | |
| Fosfato Tampolado Salino | Biosharp | BL302A | |
| Pon 812 Resina epóxi | SPI CHEM | GS02660 | |
| Ferrocianeto de potássio | Macklin | P816416 | |
| Tiocarbohidrazida | Merck | 223220 | |
| Ultramicrótomo | LEICA | EMUC7 | |
| Acetato de Uranila | RHAWN | R032929 |
Referências
- Gonidi, M., et al. Mitochondrial UCP4 and bcl-2 expression in imprints of breast carcinomas: Relationship with DNA ploidy and classical prognostic factors. Pathology, Research and Practice. 207 (6), 377-382 (2011).
- Youle, R. J., vander Bliek, A. M.
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Reimpressões e permissões
