Method Article

Uma técnica tridimensional para a visualização de alterações ultraestruturais mitocondriais em células cancerosas pancreáticas

DOI:

10.3791/65290

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June 23rd, 2023

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1School of Pharmaceutical Science of Zhejiang Chinese Medical University, 2Department of Pharmacy, Zhejiang Provincial Dermatology Hospital, 3Academy of Chinese Medical Sciences of Zhejiang Chinese Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve como reconstruir cristas mitocondriais para obter imagens 3D com alta precisão, alta resolução e alto rendimento.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A compreensão das características dinâmicas da ultraestrutura da organela celular, que não é apenas rica em informações desconhecidas, mas também sofisticada de uma perspectiva tridimensional (3D), é fundamental para estudos mecanísticos. A microscopia eletrônica (ME) oferece boa profundidade de imagem e permite a reconstrução de pilhas de imagens de alta resolução para investigar a morfologia ultraestrutural de organelas celulares mesmo na escala nanométrica; portanto, a reconstrução 3D está ganhando importância devido às suas vantagens incomparáveis. A microscopia eletrônica de varredura (MEV) fornece uma tecnologia de aquisição de imagens de alto rendimento que permite reconstruir grandes estruturas em 3D a partir da mesma região de interesse em cortes consecutivos. Portanto, a aplicação da MEV na reconstrução 3D em larga escala para restaurar a verdadeira ultraestrutura 3D de organelas está se tornando cada vez mais comum. Neste protocolo, sugerimos uma combinação de técnicas seriadas de corte ultrafino e reconstrução 3D para estudar cristas mitocondriais em células de câncer de pâncreas. Os detalhes de como essas técnicas são realizadas são descritos neste protocolo de forma passo a passo, incluindo o método ósmio-tiocarboidrazida-ósmio (OTO), a imagem de corte ultrafino seriada e o visor de visualização.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As mitocôndrias são uma das organelas mais importantes da célula. Eles servem como o centro central da bioenergética e metabolismo celular 1,2 e desempenham um papel crítico no câncer3. O câncer de pâncreas (CP) é um dos cânceres mais difíceis de tratar4 devido à sua rápida disseminação e alta taxa de mortalidade. A disfunção mitocondrial, causada principalmente por alterações namorfologia mitocondrial3,5,6,7, tem sido associada aos mecanismos patológicos subjacentes aos CP8. As mitocôndrias também são altamente dinâmicas, o que se reflete nas mudanças frequentes e dinâmicas na conectividade de sua rede e estrutura decristas9. A remodelagem da estrutura das cristas pode afetar diretamente a função mitocondrial e o estadocelular10,11, que são significativamente alterados durante o crescimento das células tumorais, metástases e alterações no microambiente tumoral12,13.

Nos últimos anos, cientistas têm estudado essa organela utilizando a observação de EM14,15,16,17; por exemplo, pesquisadores analisaram a dinâmica mitocondrial utilizando técnicas de reconstrução 3D 6,7,18,19. O conceito geral e o método para a reconstrução 3D de imagens de microscopia eletrônica foram formalmente estabelecidos já em 196820 e envolveram a combinação de microscopia eletrônica, difração de elétrons e processamento de imagens por computador para reconstruir a cauda do fago T4. Até o momento, a tecnologia de imagem 3D por microscopia eletrônica tem feito avanços significativos em termos de resolução de imagem21, grau de automação22 e volume de processamento23 e tem sido usada em escala cada vez mais ampla em pesquisas biológicas, desde o nível tecidual até o nível de ultraestrutura da organela na escala nanométrica24. Nos últimos anos, a microscopia eletrônica 3D também se tornou uma tecnologia promissora para uma ampla gama de aplicações25,26,27.

A crescente atenção às cristas mitocondriais ilustra particularmente os requisitos essenciais para a imagem volumétrica ultraestrutural. A microscopia eletrônica de transmissão (MET) tem sido utilizada para visualizar amostras coletadas em uma grade de cobre (400 mesh)28, com o feixe de elétrons passando pela seção. No entanto, devido ao alcance limitado da grade de cobre, é impossível obter imagens completas de cortes contínuos de uma mesma amostra29. Isso dificulta o estudo das estruturas-alvo durante a aquisição de imagens por TEM. Além disso, a ETM depende de tarefas manuais demoradas e propensas a erros, incluindo corte e coleta de múltiplos cortes e obtenção de imagens sequencialmente21, não sendo adaptada para reconstruções ultraestruturais de amostras de grande volume23. Atualmente, a reconstrução de alta resolução de imagens de amostras de grande volume é obtida por meio do uso de equipamentos especializados, como o TEMCA camera array (TEMCA)30 ou dois sistemas TEMCA de segunda geração (TEMCA2)31, que permitem imagens automatizadas de alto rendimento em um curto espaço de tempo. Entretanto, este tipo de imagem não tem a vantagem de ser de fácil obtenção e universal devido à necessidade de equipamentos personalizados.

Em comparação com o TEM, o método de geração automática de milhares de imagens volumétricas seriais para grandes áreas baseado no SEM 32,33 aumenta a eficiência e a confiabilidade das imagens seriais e oferece resoluções z mais altas34. Por exemplo, a microscopia eletrônica de varredura em bloco serial (SBF-SEM) e a microscopia eletrônica de varredura por feixe de íons focalizado (FIB-SEM) possibilitaram a reconstrução 3D de ultraestrutura com alta velocidade, eficiência e resolução35,36. Entretanto, é inevitável que a superfície do bloco seja raspada mecanicamente pelo bisturi de diamante do MEV-SBF ou pela fresagem com o feixe de íons focalizado do FIB-MEV33,37. Devido à destrutividade dos dois métodos para as amostras, não é possível reconstruir novamente a mesma estrutura alvo para análisesposteriores 38,39,40. Além disso, poucos estudos tentaram reconstruir a ultraestrutura da organela 3D de células cancerosas usando EM para observar alteraçõespatológicas12. Por estas razões, a fim de elucidar melhor os mecanismos patológicos de células cancerosas, como células cancerosas pancreáticas, propomos uma nova tecnologia para a reconstrução 3D de imagens de cortes seriados usando um ultramicrótomo e um microscópio eletrônico de varredura por emissão de campo (MEV-FE) para analisar a ultraestrutura mitocondrial em nível de cristas; Com essa tecnologia, dados de alta resolução podem ser adquiridos por meio de um método eficiente e acessível. As seções ultrafinas seriais feitas usando um ultramicrótomo podem ser armazenadas semi-permanentemente em uma caixa de grade e recriadas várias vezes, mesmo após vários anos41. A MEF-FE é altamente valorizada como ferramenta em vários campos de pesquisa devido à sua capacidade de fornecer imagens de alta resolução, alta magnificação e versatilidade42. Na tentativa de exibir a estrutura fina das organelas em 3D, a técnica para produzir pilhas de imagens 2D seriadas com resolução útil usando elétrons retroespalhados produzidos por FE-SEM 43,44 também pode ser usada para obter imagens de alto rendimento e multiescala de regiões alvo ou suas estruturas associadas sem equipamentos especiais 45. A geração de artefatos de carga afeta diretamente a qualidade das imagens adquiridas, por isso é particularmente importante manter o tempo de permanência curto.

Assim, o presente estudo elabora os procedimentos experimentais empregados nesta técnica de MEV para reconstruir a estrutura 3D das cristas mitocondriais46. Especificamente, mostramos o processo desenvolvido para alcançar a segmentação semiautomática das regiões mitocondriais e digitalizar a reconstrução 3D usando o software Amira, que também envolve a confecção de amostras de corte usando o método convencional de preparação de espécimes OTO44,47, completar a coleta de cortes usando fatiamento de ultramicrótomos e adquirir dados sequenciais 2D por MEV-FE.

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Protocol

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1. Preparação do material

  1. Cultivar 2 x 106 células Panc02 em 12 mL de meio DMEM (10% de soro fetal bovino e 100 U/mL de penicilina-estreptomicina), e manter a 37 °C e 95% de umidade em atmosfera de 5% de dióxido de carbono e 95% de ar por 48 h.
  2. Recolher células de Panc02, centrifugar a 28 x g durante 2 minutos e, em seguida, eliminar o sobrenadante. Certifique-se de que a amostra tem um tamanho adequado (1 x 107 células), caso contrário, as seguintes etapas de fixação e desidratação não funcionarão bem.
  3. Adicionar 1 mL de glutaraldeído a 2,5% como fixador para fixar as células frescas de Panc02 nos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL durante a noite a 4 °C.
    NOTA: As amostras precisam ser centrifugadas a 1.006 x g por 5 min em cada uma das etapas a seguir (etapas 1.3-1.11).
  4. Aspirar o fixador, enxaguar as amostras duas vezes com solução salina tamponada com fosfato 0,1 M (PBS) e, em seguida, enxaguar duas vezes com água bidestilada (ddH2O) à temperatura ambiente por 10 min cada.
  5. Adicionar 50 μL de uma solução contendo tetróxido de ósmio a 1% (OsO 4) e ferrocianeto de potássio a 1,5% na proporção de 1:1 a4 °C durante 1 h. Em seguida, enxágue duas vezes com PBS 0,1 M por 10 min de cada vez e enxágue com ddH2O por mais 10 min.
  6. Adicionar 1 mL de tiocarboidrazida (TCH) a 1%, incubar à temperatura ambiente por 30 min a 1 h e, em seguida, enxaguar com ddH2O quatro vezes por 10 min de cada vez.
  7. Adicionar 50 μL de OsO4 a 1%, fixar à temperatura ambiente durante 1 h e, em seguida, enxaguar com ddH2O quatro vezes durante 10 min de cada vez.
  8. Adicionar 1 ml de acetato de uranila a 2% a 4 °C durante a noite e, em seguida, enxaguar com ddH2O quatro vezes durante 10 minutos de cada vez.
  9. Adicionar 1 ml de solução de Walton (0,066 g de nitrato de chumbo dissolvido em 10 ml de solução-mãe de ácido aspártico 0,03 mol/L) a 60 °C para mais 1 h de incubação.
  10. Enxágue com ddH2O quatro vezes por 10 min cada vez e, em seguida, desidrate em uma série de álcool graduado por 10 min cada vez: álcool 50%, álcool 70%, álcool 80% e álcool 90% 1x e álcool 100% 2x. Em seguida, desidratar em acetona 100% duas vezes por 10 min cada vez. Use 1 mL de cada solução para a desidratação.
  11. Misturar 200 μL de acetona com a resina epóxi Pon 812 na proporção de 3:1, 1:1 e 1:3. Mergulhe a amostra em resina à temperatura ambiente por 2 h, 4 h e 4 h, respectivamente, e depois tome a resina epóxi 100% Pon 812 para impregnar durante a noite.
    OBS: Ao realizar as etapas de coloração e incorporação de resina, é importante operar em uma capela de fumaça, pois são substâncias tóxicas. Além disso, jalecos e luvas resistentes a solventes devem ser usados durante o experimento.
  12. Coloque os espécimes em um molde de incorporação e, em seguida, coloque em um forno a 60 °C por 48 h para polimerizar. Use a incorporação plana29 para reduzir a aparência de resina ao redor da amostra. Isso simplifica a instalação da amostra e diminui o impacto dos artefatos de carregamento na segmentação subsequente da imagem.
    OBS: Para posteriormente gerar uma superfície de corte horizontal, uma pequena quantidade de resina pode ser adicionada ao orifício do molde, tomando cuidado para não enchê-lo demais.
  13. Prepare wafers de silício primeiro lavando-os e depois hidrofilizando com uma solução concentrada de H 2 SO4/H 2O2por 30 min. Recolher em série tiras cortadas com uma espessura de 70 nm sobre os wafers de silício hidrofilizados utilizando um ultramicrótomo e secá-las num forno a 60 °C durante 10 min.
    NOTA: Capture lentamente a fatia à medida que a fatia flutua para a superfície dos wafers para evitar a perda ou deformação da fatia.

2. Aquisição de imagens e reconstrução tridimensional

  1. Antes de montar um wafer de silicone no palco, lave as seções com água destilada três vezes e seque-as ao ar. Corte uma fita de carbono condutora com o tamanho de 1 cm x 0,5 cm e cole-a entre o wafer de silício e o estágio da amostra de MEV para completar a configuração da amostra (Figura 2E).
  2. Ajuste o parâmetro de tensão de aceleração FE-MEV para 2 kV com uma distância de trabalho de 4 mm (Figura 3B e Tabela 1).
    NOTA: Para melhorar a relação sinal-ruído e reduzir o ruído na imagem, observe em baixas ampliações sempre que possível. À medida que o múltiplo aumenta, o alcance de varredura do MEV diminui, levando a um aumento no acúmulo de carga nas imagens.
  3. Clique no ícone H/L na barra de menu superior. Primeiro, em baixa ampliação, oriente a primeira seção das tiras de corte de destino e, em seguida, clique novamente na opção H/L (Figura 3A) para alternar para o modo de alta magnificação; Colete uma imagem apropriada para a estrutura de interesse ajustando o brilho, o contraste e a ampliação da imagem.
  4. Selecione Exibição de projeto > Dados abertos e importe os arquivos de imagem a serem analisados para o software.
  5. Alinhe as imagens clicando em Align Slices > Edit (Figura 4B) e ajuste o valor Intensity Range na barra de menus inferior esquerda modificando a transparência da imagem. Aqui, use uma estratégia de alinhamento semiautomático; Especificamente, por meio do alinhamento automático, faça com que as imagens se sobreponham a uma imagem anterior e, em seguida, execute o ajuste fino manual.
    NOTA: Neste trabalho, durante o processo de alinhamento, a imagem anterior foi utilizada como referência, e as operações mover e girar foram utilizadas para sobrepor ao máximo a estrutura alvo das duas imagens. Clicar em Alinhar par de fatias atual pode ajudar a alinhar as imagens automaticamente, mas pode ocorrer um extravio.
  6. Selecione o módulo Extrair Subvolume e recorte os conjuntos de dados alinhados para ajustar o tamanho da parte sobreposta de toda a pilha.
  7. Na subseção Segmentação (Figura 4C), selecione Resample > Segmentation > Save. Escolha o limite da Varinha Mágica e o tamanho da ferramenta Pincel para selecionar o intervalo correto. Aqui, novamente, adote um método de segmentação semiautomático usando primeiro a Varinha Mágica para selecionar automaticamente uma grande área adequada e, em seguida, use o Pincel para descrever com precisão os detalhes.
    NOTA: A Varinha Mágica pode ser aplicada a imagens de segmento com base nas diferenças óbvias na intensidade de pixel existentes entre a estrutura de interesse e as estruturas circundantes, alterando o valor de mascaramento e usando a Linha de Limite de Desenho. É incapaz de distinguir os artefatos de carregamento gerados durante a aquisição da imagem. Portanto, pode resultar em segmentação incorreta para as regiões-alvo. A ferramenta Pincel pode ser usada para segmentar manualmente para reconstruir com precisão as estruturas biológicas.
  8. Em Segmentação > Seleção, clique no ícone + para adicionar a área selecionada (Figura 4C).
  9. Repita o passo acima (2.8) para selecionar a mesma estrutura alvo em imagens diferentes até que a seleção esteja completa para reconstruir as microestruturas de interesse.
    NOTA: Durante os processos de remodelação mitocondrial, a seleção do objeto alvo deve ser realizada a partir da figura no meio de um grupo de imagens sequenciais. Se a área necessária for selecionada a partir da primeira ou da última imagem, o resultado da reconstrução não será capaz de apresentar uma visualização 3D completa.
  10. Após concluir a segmentação regional, gere o arquivo de imagem de acordo com os melhores resultados para o tamanho do objeto e a resolução da imagem. Clique em Crop Editor e digite o número 6 na caixa Virtual Slider (Figura 4C).
  11. No menu suspenso à esquerda, clique com o botão direito do mouse na área cinza sob a subseção Projeto e selecione Gerar superfície > Criar > aplicar. No arquivo gerado, use o módulo Surface View para criar a estrutura da superfície e a representação 3D.

3. Quantificação

  1. Clique em Remover pequenos pontos > aplicar (Figura 4D). Na subseção Project , clique com o botão direito do mouse na área cinza e selecione Label Analysis > Apply (Figura 4D).
  2. Personalize o nome da coluna e escolha um grupo de medidas. Selecione Volume3d e Length3d na caixa Medidas nativas.
  3. Clique no botão Aplicar no canto inferior esquerdo da tela. Copie os dados e o gráfico no software estatístico, como o GraphPad.

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Results

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Durante a cultura celular (Figura 1A), primeiramente dividimos as células de câncer de pâncreas em um grupo controle cultivado com meio de cultura completo, um grupo (1S,3R)-RSL348 (RSL3, um ativador de ferroptose, 100 nM) e um grupo RSL3 (100 nM) mais ferrostatina-149 (Fer-1, um inibidor de ferroptose, 100 nM). Através das etapas experimentais acima, o microscópio eletrônico de varredura adquiriu 38 (Figura Suplementar 1), 43 (Figura S...

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Discussion

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O método aqui apresentado é um guia passo-a-passo útil para a aplicação da técnica de reconstrução 3D, que envolve a aplicação de microscopia eletrônica e tecnologia de processamento de imagens para o empilhamento e segmentação de imagens tomográficas 2D geradas a partir de cortes ultrafinos seriados. Este protocolo destaca uma limitação das imagens 2D que pode ser abordada pela visualização 3D da ultraestrutura da organela, que tem como vantagens a forte reprodutibilidade das estruturas em nível de alta resolução e maio...

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Disclosures

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Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Acknowledgements

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Esta pesquisa foi apoiada por subsídios da Fundação de Ciências Naturais da Província de Zhejiang (Z23H290001, LY19H280001); Subsídios da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82274364, 81673607 e 81774011); bem como o Projeto de Pesquisa de Bem-Estar Público da Bolsa de Ciência e Tecnologia de Huzhou (2021GY49, 2018GZ24). Agradecemos a grande ajuda, suporte técnico e suporte experimental da Plataforma Pública do Centro de Pesquisa Médica, Academia de Ciências Médicas Chinesas, Universidade Médica Chinesa de Zhejiang.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
(1S,3R)-RSL3MCEHY-100218A
AcetonaSIGMA179124
AmiraVisage Imaging2020.2
Ácido aspárticoMCEHY-42068
Águia modificada de Dulbecco' s meioGibco11995115
EtanolMerck100983
Ferrostatin-1MCEHY-100579
Soro bovino fetalGibco10437010
Microscópio eletrônico de varredura por emissão de campoHITACHISU8010
GlutaraldeídoAlfa AesarA10500.22
Chumbo nitratoSANTA CRUZsc-211724
Tetróxido de ÓsmioSANTA CRUZsc-206008B
Panc02Coleção Europeia de Culturas de Células Autenticadas 
Penicilina-estreptomicinaBiosharpBL505A
Fosfato Tampolado SalinoBiosharpBL302A
Pon 812 Resina epóxiSPI CHEMGS02660
Ferrocianeto de potássioMacklinP816416
TiocarbohidrazidaMerck223220
UltramicrótomoLEICAEMUC7
Acetato de UranilaRHAWNR032929
98102213

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gonidi, M., et al. Mitochondrial UCP4 and bcl-2 expression in imprints of breast carcinomas: Relationship with DNA ploidy and classical prognostic factors. Pathology, Research and Practice. 207 (6), 377-382 (2011).
  2. Youle, R. J., vander Bliek, A. M. Mitochondrial fission, fusion, and stress. Science. 337 (6098), 1062-1065 (2012).
  3. Dias, N., Bailly, C. Drugs targeting mitochondrial functions to control tumor cell growth. Biochemical Pharmacology. 70 (1), 1-12 (2005).
  4. Toshiyama, R., et al. Two cases of resectable pancreatic cancer diagnosed by open surgical biopsy after endoscopic ultrasound fine-needle aspiration failed to yield diagnosis: Case reports. Surgical Case Reports. 3 (1), 39(2017).
  5. Hoffmann, M., et al. elegans ATAD-3 is essential for mitochondrial activity and development. PLoS One. 4 (10), e7644(2009).
  6. Vincent, A. E., et al. The spectrum of mitochondrial ultrastructural defects in mitochondrial myopathy. Scientific Reports. 6, 30610(2016).
  7. Strubbe-Rivera, J. O., et al. The mitochondrial permeability transition phenomenon elucidated by cryo-EM reveals the genuine impact of calcium overload on mitochondrial structure and function. Scientific Reports. 11 (1), 1037(2021).
  8. Nagdas, S., et al. Drp1 promotes KRas-driven metabolic changes to drive pancreatic tumor growth. Cell Reports. 28 (7), 1845-1859 (2019).
  9. Sukhorukov, V. M., Bereiter-Hahn, J. Anomalous diffusion induced by cristae geometry in the inner mitochondrial membrane. PLoS One. 4 (2), e4604(2009).
  10. Cogliati, S., et al. Mitochondrial cristae shape determines respiratory chain supercomplexes assembly and respiratory efficiency. Cell. 155 (1), 160-171 (2013).
  11. Shi, P., et al. Mechanical instability generated by myosin 19 contributes to mitochondria cristae architecture and OXPHOS. Nature Communications. 13 (1), 2673(2022).
  12. Moscheni, C., et al. 3D quantitative and ultrastructural analysis of mitochondria in a model of doxorubicin sensitive and resistant human colon carcinoma cells. Cancers. 11 (9), 1254(2019).
  13. Porporato, P. E., Filigheddu, N., Pedro, J. M. B., Kroemer, G., Galluzzi, L. Mitochondrial metabolism and cancer. Cell Research. 28 (3), 265-280 (2018).
  14. Sachse, M., Fernández de Castro, I., Tenorio, R., Risco, C. The viral replication organelles within cells studied by electron microscopy. Advances in Virus Research. 105, 1-33 (2019).
  15. Ohta, K., Hirashima, S., Miyazono, Y., Togo, A., Nakamura, K. I. Correlation of organelle dynamics between light microscopic live imaging and electron microscopic 3D architecture using FIB-SEM. Microscopy. 70 (2), 161-170 (2021).
  16. Wischnitzer, S. An electron microscope study of cytoplasmic organelle transformations in developing mouse oocytes. Wilhelm Roux' Archiv fur Entwicklungsmechanik der Organismen. 166 (2), 150-172 (1970).
  17. Shomorony, A., et al. Combining quantitative 2D and 3D image analysis in the serial block face SEM: application to secretory organelles of pancreatic islet cells. Journal of Microscopy. 259 (2), 155-164 (2015).
  18. Mourier, A., Ruzzenente, B., Brandt, T., Kühlbrandt, W., Larsson, N. G. Loss of LRPPRC causes ATP synthase deficiency. Human Molecular Genetics. 23 (10), 2580-2592 (2014).
  19. Miyazono, Y., et al. Uncoupled mitochondria quickly shorten along their long axis to form indented spheroids, instead of rings, in a fission-independent manner. Scientific Reports. 8 (1), 350(2018).
  20. Cremers, A. F., Schepman, A. M., Visser, M. P., Mellema, J. E. An analysis of the contracted sheath structure of bacteriophage Mu. European Journal of Biochemistry. 80 (2), 393-400 (1977).
  21. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  22. Kubota, Y., Sohn, J., Kawaguchi, Y. Large volume electron microscopy and neural microcircuit analysis. Frontiers in Neural Circuits. 12, 98(2018).
  23. Horstmann, H., Körber, C., Sätzler, K., Aydin, D., Kuner, T. Serial section scanning electron microscopy (S3EM) on silicon wafers for ultra-structural volume imaging of cells and tissues. PLoS One. 7 (4), e35172(2012).
  24. Lucas, M. S., Günthert, M., Gasser, P., Lucas, F., Wepf, R. Bridging microscopes: 3D correlative light and scanning electron microscopy of complex biological structures. Methods in Cell Biology. 111, 325-356 (2012).
  25. Kittelmann, M. 3D electron microscopy of the ER. Methods in Molecular Biology. 1691, 15-21 (2018).
  26. Müller-Reichert, T., Kiewisz, R., Redemann, S. Mitotic spindles revisited - New insights from 3D electron microscopy. Journal of Cell Science. 131 (3), 211383(2018).
  27. Russell, M. R., et al. 3D correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy. Journal of Cell Science. 130 (1), 278-291 (2017).
  28. Geys, J., et al. Acute toxicity and prothrombotic effects of quantum dots: Impact of surface charge. Environmental Health Perspectives. 116 (12), 1607-1613 (2008).
  29. Luckner, M., Wanner, G. From light microscopy to analytical scanning electron microscopy (SEM) and focused ion beam (FIB)/SEM in biology: Fixed coordinates, flat embedding, absolute references. Microscopy and Microanalysis. 24 (5), 526-544 (2018).
  30. Phelps, J. S., et al. Reconstruction of motor control circuits in adult Drosophila using automated transmission electron microscopy. Cell. 184 (3), 759-774 (2021).
  31. Zheng, Z., et al. A complete electron microscopy volume of the brain of adult Drosophila melanogaster. Cell. 174 (3), 730-743 (2018).
  32. Zechmann, B., Möstl, S., Zellnig, G. Volumetric 3D reconstruction of plant leaf cells using SEM, ion milling, TEM, and serial sectioning. Planta. 255 (6), 118(2022).
  33. Laws, R., Steel, D. H., Rajan, N. Research techniques made simple: Volume scanning electron microscopy. The Journal of Investigative Dermatology. 142 (2), 265-271 (2022).
  34. Lippens, S., Kremer, A., Borghgraef, P., Guérin, C. J. Serial block face-scanning electron microscopy for volume electron microscopy. Methods in Cell Biology. 152, 69-85 (2019).
  35. Schneider, J. P., Hegermann, J., Wrede, C. Volume electron microscopy: Analyzing the lung. Histochemistry and Cell Biology. 155 (2), 241-260 (2021).
  36. Lewis, P. N., Young, R. D., Souza, R. B., Quantock, A. J., Meek, K. M. Contrast-enhanced tissue processing of fibrillin-rich elastic fibres for 3D visualization by volume scanning electron microscopy. Methods and Protocols. 4 (3), 56(2021).
  37. Briggman, K. L., Bock, D. D. Volume electron microscopy for neuronal circuit reconstruction. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 154-161 (2012).
  38. Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
  39. Wacker, I., et al. Hierarchical imaging: A new concept for targeted imaging of large volumes from cells to tissues. BMC Cell Biology. 17 (1), 38(2016).
  40. Koga, D., Kusumi, S., Shibata, M., Watanabe, T. Applications of scanning electron microscopy using secondary and backscattered electron signals in neural structure. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 759804(2021).
  41. Parajuli, L. K., Koike, M. Three-dimensional structure of dendritic spines revealed by volume electron microscopy techniques. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 627368(2021).
  42. Suga, M., et al. Recent progress in scanning electron microscopy for the characterization of fine structural details of nano materials. Progress in Solid State Chemistry. 42 (1-2), 1-21 (2014).
  43. Koga, D., Ushiki, T., Watanabe, T. Novel scanning electron microscopy methods for analyzing the 3D structure of the Golgi apparatus. Anatomical Science International. 92 (1), 37-49 (2017).
  44. Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
  45. Koga, D., Kusumi, S., Ushiki, T. Three-dimensional shape of the Golgi apparatus in different cell types: serial section scanning electron microscopy of the osmium-impregnated Golgi apparatus. Microscopy. 65 (2), 145-157 (2016).
  46. Son, R., et al. Morphomics via next-generation electron microscopy. arXiv. 2111, 14373(2021).
  47. Lewczuk, B., Szyryńska, N. Field-emission scanning electron microscope as a tool for large-area and large-volume ultrastructural studies. Animals. 11 (12), 3390(2021).
  48. Shin, D., Kim, E. H., Lee, J., Roh, J. L. Nrf2 inhibition reverses resistance to GPX4 inhibitor-induced ferroptosis in head and neck cancer. Free Radical Biology & Medicine. 129, 454-462 (2018).
  49. Skouta, R., et al. Ferrostatins inhibit oxidative lipid damage and cell death in diverse disease models. Journal of the American Chemical Society. 136 (12), 4551-4556 (2014).
  50. Heinen-Weiler, J., et al. Superiority of focused ion beam-scanning electron microscope tomography of cardiomyocytes over standard 2D analyses highlighted by unmasking mitochondrial heterogeneity. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 12 (4), 933-954 (2021).
  51. Randles, M. J., et al. Three-dimensional electron microscopy reveals the evolution of glomerular barrier injury. Scientific Reports. 6, 35068(2016).
  52. Vincent, A. E., et al. Quantitative 3D mapping of the human skeletal muscle mitochondrial network. Cell Reports. 27 (1), 321(2019).
  53. Oh, S. J., Ikeda, M., Ide, T., Hur, K. Y., Lee, M. S. Mitochondrial event as an ultimate step in ferroptosis. Cell Death Discovery. 8 (1), 414(2022).
  54. Jang, S., et al. Elucidating the contribution of mitochondrial glutathione to ferroptosis in cardiomyocytes. Redox Biology. 45, 102021(2021).
  55. Sui, X., et al. RSL3 Drives ferroptosis through GPX4 inactivation and ROS production in colorectal cancer. Frontiers in Pharmacology. 9, 1371(2018).
  56. Jelinek, A., et al. Mitochondrial rescue prevents glutathione peroxidase-dependent ferroptosis. Free Radical Biology & Medicine. 117, 45-57 (2018).
  57. Rennie, M. Y., Gahan, C. G., López, C. S., Thornburg, K. L., Rugonyi, S. 3D imaging of the early embryonic chicken heart with focused ion beam scanning electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 20 (4), 1111-1119 (2014).
  58. Garza-Lopez, E., et al. Protocols for generating surfaces and measuring 3D organelle morphology using Amira. Cells. 11 (1), 65(2021).
  59. Shi, Y., Wang, L., Zhang, J., Zhai, Y., Sun, F. Determining the target protein localization in 3D using the combination of FIB-SEM and APEX2. Biophysics Reports. 3 (4), 92-99 (2017).
  60. Thomas, C. I., et al. Targeting functionally characterized synaptic architecture using inherent fiducials and 3D correlative microscopy. Microscopy and Microanalysis. 27 (1), 156-169 (2021).
  61. Friedman, P. L., Ellisman, M. H. Enhanced visualization of peripheral nerve and sensory receptors in the scanning electron microscope using cryofracture and osmium-thiocarbohydrazide-osmium impregnation. Journal of Neurocytology. 10 (1), 111-131 (1981).
  62. Oho, E., Suzuki, K., Yamazaki, S. Applying fast scanning method coupled with digital image processing technology as standard acquisition mode for scanning electron microscopy. Scanning. 2020, 4979431(2020).
  63. Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy image browser: A platform for segmentation and analysis of multidimensional datasets. PLoS Biology. 14 (1), e1002340(2016).
  64. Trebichalská, Z., et al. High-resolution 3D reconstruction of human oocytes using focused ion beam scanning electron microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 755740(2021).
  65. Wei, D., et al. High-resolution three-dimensional reconstruction of a whole yeast cell using focused-ion beam scanning electron microscopy. BioTechniques. 53 (1), 41-48 (2012).
  66. Xu, C. S., et al. Enhanced FIB-SEM systems for large-volume 3D imaging. eLife. 6, 25916(2017).
  67. Zhu, T., et al. Live cell mitochondrial 3-dimensional dynamic ultrastructures under oxidative phosphorylation revealed by a Pyridine-BODIPY probe. Biosensors & Bioelectronics. 178, 113036(2021).
  68. Yang, X., et al. Mitochondrial dynamics quantitatively revealed by STED nanoscopy with an enhanced squaraine variant probe. Nature Communications. 11 (1), 3699(2020).
  69. Vicidomini, G., Bianchini, P., Diaspro, A. STED super-resolved microscopy. Nature Methods. 15 (3), 173-182 (2018).
  70. Theurey, P., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes allow adaptation of mitochondrial metabolism to glucose availability in the liver. Journal of Molecular Cell Biology. 8 (2), 129-143 (2016).
  71. Stoica, R., et al. ER-mitochondria associations are regulated by the VAPB-PTPIP51 interaction and are disrupted by ALS/FTD-associated TDP-43. Nature Communications. 5, 3996(2014).
  72. Bruno, S. R., Anathy, V. Lung epithelial endoplasmic reticulum and mitochondrial 3D ultrastructure: a new frontier in lung diseases. Histochemistry and Cell Biology. 155 (2), 291-300 (2021).
  73. Park, S. J., Schertel, A., Lee, K. E., Han, S. S. Ultra-structural analysis of the brain in a Drosophila model of Alzheimer's disease using FIB/SEM microscopy. Microscopy. 63 (1), 3-13 (2014).
  74. Torkamani, N., et al. Three dimensional glomerular reconstruction: A novel approach to evaluate renal microanatomy in diabetic kidney disease. Scientific Reports. 9 (1), 1829(2019).

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