Quantificação Baseada em Fluorescência do Potencial de Membrana Mitocondrial e Níveis de Superóxido Usando Imagem Viva em Células HeLa

Summary

Esta técnica descreve um fluxo de trabalho eficaz para visualizar e medir quantitativamente o potencial de membrana mitocondrial e os níveis de superóxido dentro de células HeLa usando imagens ao vivo baseadas em fluorescência.

Abstract

As mitocôndrias são organelas dinâmicas críticas para a homeostase metabólica, controlando a produção de energia via síntese de ATP. Para apoiar o metabolismo celular, vários mecanismos de controle de qualidade mitocondrial cooperam para manter uma rede mitocondrial saudável. Uma dessas vias é a mitofagia, onde a quinase 1 induzida por PTEN (PINK1) e a fosfoubiquitinação de Parkin das mitocôndrias danificadas facilitam o sequestro do autofagossomo e a subsequente remoção da célula via fusão lisossômica. A mitofagia é importante para a homeostase celular, e mutações em Parkin estão ligadas à doença de Parkinson (DP). Devido a esses achados, tem havido uma ênfase significativa na investigação do dano e turnover mitocondrial para entender os mecanismos moleculares e a dinâmica do controle de qualidade mitocondrial. Aqui, imagens de células vivas foram usadas para visualizar a rede mitocondrial de células HeLa, para quantificar o potencial de membrana mitocondrial e os níveis de superóxido após o tratamento com cianeto de carbonila m-clorofenil hidrazona (CCCP), um agente desacoplador mitocondrial. Além disso, uma mutação PD-ligada de Parkin (Parkin^T240R) que inibe a mitofagia Parkin-dependente foi expressa para determinar como a expressão mutante impacta a rede mitocondrial em comparação com as pilhas que expressam Parkin selvagem-tipo. O protocolo descrito aqui descreve um fluxo de trabalho simples usando abordagens baseadas em fluorescência para quantificar o potencial de membrana mitocondrial e os níveis de superóxido de forma eficaz.

Introduction

A rede mitocondrial é uma série de organelas interconectadas que desempenham um papel crucial na produção de energia¹, imunidade inata ^2,3 e sinalização celular ^4,5. A desregulação mitocondrial tem sido associada a doenças neurodegenerativas, como a doença de Parkinson (DP)^6,7. A DP é uma doença neurodegenerativa progressiva que afeta neurônios dopaminérgicos da substância negra e afeta cerca de 10 milhões de pessoas em todo o^mundo8. A DP....

Protocol

1. Preparação de amostras biológicas

NOTA: Execute as seguintes etapas usando técnica estéril em um gabinete de biossegurança. Borrife a superfície do gabinete e todos os materiais com etanol 70%.

1. Cultura e transfecção de células HeLa
   1. Cultura de 30.000 células HeLa em meio águia modificado de Dulbecco (DMEM) contendo 4,5 g/L de glicose suplementado com 10% de soro fetal bovino e solução de L-glutamina a 1% (HeLa media; ver Tabela de Materiais). Plaquear as células em placas de imagem com fundo de vidro de 35 mm (verT capaz de Materiais) contendo 2 mL de mídia HeLa pré-aquec....

Results

Neste protocolo, a quantificação baseada em fluorescência foi utilizada para medir o potencial de membrana e os níveis de superóxido da rede mitocondrial após o tratamento com CCCP (Figura 1). Esse fluxo de trabalho usou células HeLa, uma linhagem celular imortalizada derivada do câncer cervical. As células HeLa são rotineiramente usadas para estudar a biologia mitocondrial e são relativamente planas, facilitando a visualização da rede mitocondrial usando microscopia. Para investigar o papel.......

Discussion

O fluxo de trabalho aqui descrito pode ser usado para quantificar o potencial de membrana mitocondrial e os níveis de superóxido de forma robusta e reprodutível usando imagens baseadas em fluorescência³⁰. Há limitações técnicas importantes a serem consideradas ao projetar esses experimentos. As células HeLa foram transfectadas com um vetor YFP vazio, YFP-Parkin^WT ou YFP-Parkin^T240R. O vetor YFP vazio foi usado como controle para confirmar que os achados experimentais eram esp.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Produtos Químicos, Peptídeos e Proteínas Recombinantes
CCCP (carbonilcianeto m-clorofenil hidrazona)	Sigma-Aldrich	C2759
DMEM (1x) com 4,5 g/L de glicose	Gibco	11-965-084
DMSO, Anidro	ThermoFisher Scientific	D12345
Fetal Bovine	Serum Hyclone	SH3007103
FuGENE 6 (Reagente de Tranfecção)	Promega	E2691
GlutaMAX 100x (Solução L-Glutamina)	Gibco	35-050-061
Hoescht 33342	ThermoFisher Scientific	62249
MitoSOX  Vermelho	ThermoFisher Scientific	M36008
MitoTracker Vermelho Escuro	ThermoFisher Scientific	M7514
Opti-MEM (Meio de soro reduzido)	ThermoFisher scientific	31985070
Tetrametilrodamina, Éster Etílico, Perclorato (TMRE)	ThermoFisher Scientific	T669
Modelos experimentais: Organismos/Cepas
HeLa-M (Homo sapiens)	A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research)	N/A
DNA recombinante
EYFP Vetor Vazio N	/A	/A
YFP-Parkin T240R	Este artigo	foi gerado por mutagênese dirigida ao local de YFP-Parkin
YFP-Parkin WT	Addgene; PMID:19029340	RRID:Addgene_23955
Software e Algoritmos
Adobe Illustrator	Adobe Inc.	https://www.adobe.com/products/illustrator	(Schindelin, 2012)
Excel (Software de Planilha)	Microsoft Office
ImageJ		https://imagej.net/software/fiji/
Leica Application Suite (LAS X)	Leica	https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Microsoft Excel	Microsoft Office	https://www.microsoft.com/excel
Prism9 (Estatístico Software de análise)	Software GraphPad	https://www.graphpad.com
Outro
35 mm Prato, lamínula nº 1,5, diâmetro de vidro de 20 mm, incubadora	MatTek	P35G-1.5-20-C
(câmara ambiental)	Okolab	https://www.oko-lab.com/cage-incubator
DMiL	Leica	N/A
LIGHTNING Software de deconvolução	Leica	N/A
STELLARIS 8 microscópio confocal	Leica	N/A