Artigo de método

Quantificação Baseada em Fluorescência do Potencial de Membrana Mitocondrial e Níveis de Superóxido Usando Imagem Viva em Células HeLa

DOI:

10.3791/65304

⸱

12 de maio de 2023

 , 
1Department of Cell Biology, Duke University Medical Center

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta técnica descreve um fluxo de trabalho eficaz para visualizar e medir quantitativamente o potencial de membrana mitocondrial e os níveis de superóxido dentro de células HeLa usando imagens ao vivo baseadas em fluorescência.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As mitocôndrias são organelas dinâmicas críticas para a homeostase metabólica, controlando a produção de energia via síntese de ATP. Para apoiar o metabolismo celular, vários mecanismos de controle de qualidade mitocondrial cooperam para manter uma rede mitocondrial saudável. Uma dessas vias é a mitofagia, onde a quinase 1 induzida por PTEN (PINK1) e a fosfoubiquitinação de Parkin das mitocôndrias danificadas facilitam o sequestro do autofagossomo e a subsequente remoção da célula via fusão lisossômica. A mitofagia é importante para a homeostase celular, e mutações em Parkin estão ligadas à doença de Parkinson (DP). Devido a esses achados, tem havido uma ênfase significativa na investigação do dano e turnover mitocondrial para entender os mecanismos moleculares e a dinâmica do controle de qualidade mitocondrial. Aqui, imagens de células vivas foram usadas para visualizar a rede mitocondrial de células HeLa, para quantificar o potencial de membrana mitocondrial e os níveis de superóxido após o tratamento com cianeto de carbonila m-clorofenil hidrazona (CCCP), um agente desacoplador mitocondrial. Além disso, uma mutação PD-ligada de Parkin (ParkinT240R) que inibe a mitofagia Parkin-dependente foi expressa para determinar como a expressão mutante impacta a rede mitocondrial em comparação com as pilhas que expressam Parkin selvagem-tipo. O protocolo descrito aqui descreve um fluxo de trabalho simples usando abordagens baseadas em fluorescência para quantificar o potencial de membrana mitocondrial e os níveis de superóxido de forma eficaz.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A rede mitocondrial é uma série de organelas interconectadas que desempenham um papel crucial na produção de energia1, imunidade inata 2,3 e sinalização celular 4,5. A desregulação mitocondrial tem sido associada a doenças neurodegenerativas, como a doença de Parkinson (DP)6,7. A DP é uma doença neurodegenerativa progressiva que afeta neurônios dopaminérgicos da substância negra e afeta cerca de 10 milhões de pessoas em todo omundo8. A DP tem sido geneticamente ligada à mitofagia, uma via de controle de qualidade mitocondrial necessária para a manutenção da homeostase celular que remove seletivamente as mitocôndrias danificadas 9,10. Estudos identificaram múltiplas vias de mitofagia independentes, incluindo o domínio FUN14 contendo 1 mitofagia mediada por FUNDC1, mitofagia facilitada pela proteína de interação Bcl-2 3 (BNIP3), mitofagia dependente de NIX e a bem caracterizada quinase 1 induzida por PTEN (PINK1)/mitofagia regulada por Parkin10,11. PINK1 (uma suposta quinase) e Parkin (uma ubiquitina ligase E3) trabalham em conjunto com mitocôndrias danificadas por fosfo-ubiquitinato, o que impulsiona a formação de autofagossomos que engolem a organela danificada e se fundem com lisossomos para iniciar a degradação 12,13,14,15,16. Mutações em Parkin têm sido associadas a fenótipos ligados à DP, como a neurodegeneração via perda de neurônios dopaminérgicos17,18.

Aqui, é descrito um protocolo no qual células HeLa, rotineiramente usadas como células imortalizadas derivadas do câncer cervical, são usadas para investigar o papel de Parkin na manutenção da saúde da rede mitocondrial. As células HeLa expressam níveis desprezíveis de Parkin endógeno e, portanto, requerem expressão exógena de Parkin19. Para estudar o papel de Parkin na saúde da rede mitocondrial, as células HeLa são transfectadas com Parkin selvagem (ParkinWT), um mutante Parkin (ParkinT240R) ou um vetor de controle vazio. ParkinT240R é uma mutação autossômica recessiva do parkinsonismo juvenil que afeta a atividade da ligase Parkin E3, reduzindo significativamente a eficiência da via mitofágica20. As células HeLa estão sujeitas a concentrações leves (5 μM) ou severas (20 μM) de cianeto de carbonila m-clorofenil hidrazona (CCCP), um agente desacoplador mitocondrial. O tratamento com concentrações severas de CCCP é rotineiramente utilizado para induzir mitofagia mediada por Parkin em várias linhagens celulares, como células HeLa e COS-721,22,23.

Após o tratamento, o protocolo emprega imagens ao vivo da rede mitocondrial usando dois corantes fluorescentes direcionados para mitocôndrias atualmente disponíveis. A tetrametilrodamina, éster etílico, perclorato (TMRE) é um corante catiônico que fluoresce com base no potencial de membrana mitocondrial24, enquanto a MitoSOX é um indicador de superóxido mitocondrial onde a intensidade da fluorescência é função da concentração de superóxido25. Finalmente, o protocolo delineado usa uma quantificação baseada em fluorescência e fluxo de trabalho simples para quantificar efetivamente o potencial de membrana mitocondrial e os níveis de superóxido com escopo mínimo para viés do usuário. Embora este protocolo tenha sido desenhado para estudar a função mitocondrial em células HeLa, ele pode ser adaptado para linhagens celulares adicionais e tipos celulares primários para caracterizar quantitativamente a saúde da rede mitocondrial.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Preparação de amostras biológicas

NOTA: Execute as seguintes etapas usando técnica estéril em um gabinete de biossegurança. Borrife a superfície do gabinete e todos os materiais com etanol 70%.

  1. Cultura e transfecção de células HeLa
    1. Cultura de 30.000 células HeLa em meio águia modificado de Dulbecco (DMEM) contendo 4,5 g/L de glicose suplementado com 10% de soro fetal bovino e solução de L-glutamina a 1% (HeLa media; ver Tabela de Materiais). Plaquear as células em placas de imagem com fundo de vidro de 35 mm (verT capaz de Materiais) contendo 2 mL de mídia HeLa pré-aquecida. Manter as culturas HeLa a 5% CO2 e 37 °C26,27.
    2. No dia seguinte ao plaqueamento, inspecione as placas de imagem de 35 mm usando um microscópio de luz para garantir que as células sejam ~50%-60% confluentes. Uma vez confluentes, transfectar as células HeLa com vetor vazio de proteína fluorescente amarela (YFP), YFP-ParkinWT ou YFP-ParkinT240R (Figura 1A).
    3. Preparar duas misturas separadas em tubos de microcentrífuga estéreis para cada transfecção. Misture batendo no tubo ou pipetando suavemente para cima e para baixo.
      1. No tubo 1, misturar 200 μL de meio sérico reduzido (ver Tabela de Materiais) com 2 μg de DNA plasmidial.
      2. No tubo 2, misturar 200 μL de meio sérico reduzido com 6 μL de reagente de transfecção (ver Tabela de Materiais)28.
    4. Incubar os tubos por 5 min à temperatura ambiente (TR). Adicione o tubo 2 ao tubo 1, misture pipetando para cima e para baixo e incube por 20 min no TR.
    5. Adicione os complexos de transfecção aos pratos de imagem existentes contendo as culturas de células HeLa, garantindo uma distribuição igual em todo o prato. Coloque as placas de imagem na incubadora de 5% CO2 e 37 °C durante a noite.
      NOTA: Rotule cada prato com o plasmídeo transfectado apropriado. Para cada experimento, rotule as três placas YFP-ParkinWT (dimetil sulfóxido [DMSO; ver Tabela de Materiais], 5 μM CCCP e 20 μM CCCP). Repita a rotulagem com os três pratos YFP-ParkinT240R e os três pratos vetoriais YFP vazios.
  2. Preparação de CCCP e corantes fluorescentes
    CUIDADO: Corantes fluorescentes são frequentemente sensíveis à luz. Guarde os corantes no escuro usando papel alumínio ou tubos de centrífuga marrom para reduzir a exposição à luz.
    1. Faça um estoque de trabalho de 5 mM de CCCP (ver Tabela de Materiais) dissolvendo 5 mg de CCCP em 4,89 mL de DMSO. Fazer um estoque de trabalho de 20 mM de CCCP dissolvendo 5 mg de CCCP em 1,22 mL de DMSO.
    2. Diluir 10 μL de uma solução-mãe MitoTracker Deep Red de 1 mM (ver Tabela de Materiais) em 390 μL de DMSO para formar um material de trabalho de 25 μM.
    3. Dissolva 50 μg de MitoSOX Red25 (ver Tabela de Materiais) em 13 μL de DMSO para criar um parque de trabalho de 5 mM.
    4. Dissolver 10 mg de TMRE24 (ver Tabela de Materiais) em 19,4 ml de DMSO para formar uma solução-mãe de 1 mM. Diluir o TMRE adicionando 10 μL de 1 mM TMRE em 990 μL de DMSO para fazer um estoque de trabalho de 10 μM.

2. Tratamento CCCP e marcação mitocondrial com sondas fluorescentes em células HeLa

CUIDADO: Execute as seguintes etapas rapidamente para garantir que as células HeLa não fiquem fora da incubadora por um período prolongado.

  1. No dia seguinte à transfecção, adicionar 2 μL de CCCP 5 ou 20 mM (concentração final: 5 μM e 20 μM, respectivamente) a cada placa experimental. Para placas de controle, adicionar 2 μL de DMSO. Retorne as placas para a incubadora de 5% CO2 e 37 °C por 1,5 h (Figura 1A).
    NOTA: O tratamento CCCP é para um total de 2 h. No entanto, as mitocôndrias são marcadas com sondas fluorescentes durante os 30 minutos finais do tratamento com CCCP.
  2. Após 1,5 h, remova as placas da incubadora e adicione sondas fluorescentes às placas de imagem. Retorne as placas para a incubadora de 5% CO2 e 37 °C por 30 min (Figura 1A).
    1. Experimento TMRE: Adicionar 2 μL de 25 μM MitoTracker (concentração final: 25 nM) e 2 μL de 10 μM TMRE (concentração final: 10 nM).
    2. Experiência MitoSOX: Adicionar 2 μL de 25 μM MitoTracker (concentração final: 25 nM) e 1 μL de 5 mM MitoSOX (concentração final: 2,5 μM).
  3. Após o tratamento com CCCP de 2 h, preparar as células HeLa para aquisição de imagens (Figura 1A,B).
    1. Experimento TMRE: as células HeLa estão imediatamente prontas para obter imagens; garantir que o TMRE permaneça no meio de cultura de células HeLa.
    2. Experimento MitoSOX: Lave as células 3x com 2 mL de meio HeLa pré-aquecido para remover o corante livre MitoSOX. Adicionar 2 mL de meio pré-aquecido. As células HeLa estão agora prontas para serem fotografadas.
      NOTA: Lavar as células HeLa com meios HeLa frescos e pré-aquecidos que contenham a mesma concentração de DMSO ou CCCP que a condição experimental; não incluem MitoSOX ou MitoTracker.

3. Configuração de aquisição de imagens em microscópio confocal

NOTA: Obtenha imagens das células HeLa usando um microscópio confocal (ver Tabela de Materiais) equipado com uma objetiva de imersão em óleo de abertura numérica (NA) de 63x/1,40 e uma câmara ambiental (consulte Tabela de Materiais).

  1. Em 1 h antes da aquisição de imagens, ligue o CO2 abrindo a válvula do tanque. Pressione o botão On para ligar o controlador ambiental do microscópio. Use as setas para cima e para baixo no touchpad para ajustar a temperatura para 37 °C e o CO2 para 5%. Pressione Definir quando concluir.
    OBS: Certifique-se de que as portas da câmara ambiental estejam fechadas e aguarde a estabilização das condições.
  2. Configurações do laser
    1. Ligue o Laser de Luz Branca (WLL) e ajuste a potência do laser para 85% e o controle de excitação para a potência máxima. Clique na guia Adquirir , selecione Adicionar Laser e, na caixa de diálogo exibida, alterne a WLL para Ativada. Clique no botão Laser Power e digite 85%. Clique no botão Excitation Control e selecione Maximum Power no menu suspenso (Figura 2A).
    2. Experiência TMRE: Defina os espectros de excitação e emissão para YFP, MitoTracker e TMRE.
      1. Para YFP, ajuste o laser de excitação para 514 nm e a janela de espectros de emissão para 524-545 nm. Na guia Adquirir , clique no botão Adicionar Nova Configuração ; em seguida, clique em Adicionar laser e arraste-o para a configuração 1. Clique duas vezes na Linha de excitação e digite 514 como o comprimento de onda na caixa de diálogo. Clique duas vezes no detector correspondente e digite 524 para o comprimento de onda inicial e 545 para o final.
      2. Para o MitoTracker Deep Red, ajuste o laser de excitação para 641 e a janela de espectros de emissão para 650-750 nm. Na guia Adquirir, clique no botão Adicionar Laser e arraste-o para a Configuração 1. Clique duas vezes na linha de excitação e digite 641 como o comprimento de onda na caixa de diálogo. Clique duas vezes no detector correspondente e digite 650 para o comprimento de onda inicial e 750 para o final.
      3. Para TMRE, ajuste o laser de excitação para 555 nm e a janela de espectros de emissão para 557-643 nm. Na guia Adquirir , clique no botão Adicionar Nova Configuração ; em seguida, clique no botão Adicionar laser e arraste-o para a configuração 2. Clique duas vezes na linha de excitação e digite 555 como o comprimento de onda na caixa de diálogo. Clique duas vezes no detector correspondente e digite 557 para o início e 643 para o comprimento de onda final.
    3. Experiência MitoSOX: Defina os espectros de excitação e emissão para YFP, MitoTracker e MitoSOX (Figura 2B).
      1. Para YFP, ajuste o laser de excitação para 507 nm e a janela de espectros de emissão para 517-540 nm. Na guia Adquirir , clique no botão Adicionar Nova Configuração ; em seguida, clique no botão Adicionar laser e arraste-o para a configuração 1. Clique duas vezes na Linha de excitação e digite 507 como o comprimento de onda na caixa de diálogo. Clique duas vezes no detector correspondente e digite 517 para o início e 540 para o comprimento de onda final.
      2. Para MitoSOX, ajuste o laser de excitação para 547 nm e a janela de espectros de emissão para 564-636 nm. Na guia Adquirir , clique no botão Adicionar Nova Configuração ; em seguida, clique no botão Adicionar laser e arraste-o para a configuração 2. Clique duas vezes na Linha de excitação e digite 547 como o comprimento de onda na caixa de diálogo. Clique duas vezes no detector correspondente e digite 564 para o comprimento de onda inicial e 636 para o final.
      3. Para o MitoTracker Deep Red, ajuste o laser de excitação para 641 nm e a janela de espectros de emissão para 652-742 nm. Na guia Adquirir , clique no botão Adicionar Nova Configuração ; clique no botão Adicionar laser e arraste-o para a configuração 3. Clique duas vezes na linha de excitação e digite 641 como o comprimento de onda na caixa de diálogo. Clique duas vezes no detector correspondente e digite 652 para o início e 742 para o comprimento de onda final.
  3. Configurações de aquisição de imagens (Figura 2C)
    1. Defina o formato para 1.024 x 1.024, a velocidade de digitalização para 600 Hz e a média de linha para 3.
      1. Selecione a guia Aquisição e clique no botão Formatar . No menu suspenso, selecione 1.024 x 1.024. Clique no botão Velocidade e selecione 600 no menu suspenso. Em seguida, clique no botão Média de linhas e, no menu suspenso, selecione 3.
      2. Ative a varredura bidirecional e defina o fator de fase e zoom para 22,61 e 1,50, respectivamente.
        1. Na guia Aquisição, alterne o botão Bidirecional para Ativado. Clique na configuração Fase X e defina-a como 22.61. Clique na configuração Fator de zoom e defina-a como 1,50.

4. Aquisição de imagens

CUIDADO: O experimentador deve fazer um julgamento visual para selecionar as células com base no sinal de fluorescência YFP. Evite pixels supersaturados, pois eles podem afetar significativamente a quantificação da intensidade da fluorescência. Use uma tabela de pesquisa sobre/abaixo que indique a saturação de pixels para evitar a aquisição de imagens saturadas.

  1. Clique na Configuração de interesse e pressione Fast Live para fornecer uma visualização ao vivo da imagem de fluorescência.
  2. Ajuste o ganho e a intensidade clicando duas vezes no detector correspondente. Na caixa de diálogo exibida, ajuste o Ganho usando o controle deslizante. Para alterar a intensidade, clique duas vezes na Linha de excitação e use as setas para cima e para baixo na janela pop-up para alterar a intensidade. Clique em Parar para encerrar a visualização.
    1. Experimento TMRE: Imageie a placa de controle DMSO primeiro. Ajustar o ganho e a intensidade do sinal TMRE (Ajuste 2) para que a intensidade da rede mitocondrial fique um pouco abaixo da saturação; manter o ganho e a intensidade constantes para o experimento. Ajuste o ganho e a intensidade do MitoTracker e do YFP (Configuração 1) para que a rede mitocondrial seja visível, mas fraca.
    2. Experimento MitoSOX: Obtenha imagens da placa de controle DMSO primeiro. Ajuste o ganho e a intensidade do sinal MitoSOX (Setting 2) para que a fluorescência seja visível, mas fraca; manter o ganho e a intensidade constantes para o experimento. Ajuste o ganho e a intensidade do YFP (Setting 1) e do MitoTracker (Setting 3) para que a rede mitocondrial fique visível, mas fraca.
      OBS: Registre o ganho e a intensidade de TMRE e MitoSOX, pois esses valores devem permanecer constantes durante todo o experimento. Os sinais de fluorescência do YFP e do MitoTracker não são quantificados neste protocolo. Portanto, o ganho e a intensidade podem ser ajustados para cada imagem. É mais eficaz ter as configurações de ganho e intensidade onde as células são fáceis de ver, mas ainda fracas, para garantir que as células não sejam expostas a intensidades excessivas de laser que causam danos celulares ou fotoclareamento.
  3. Quando as configurações de ganho e intensidade estiverem concluídas, clique em Iniciar para adquirir uma imagem. Adquirir imagens de 20 células por condição experimental (por exemplo, cinco imagens com quatro células por imagem; Figura 2D).

5. Quantificação da intensidade de fluorescência usando ImageJ

NOTA: Os arquivos de imagem são salvos como ".lif" e são compatíveis com o ImageJ29. Os tipos de arquivos compatíveis com o ImageJ são especificados em seu site. Pode ser necessário converter o tipo de arquivo se ele for incompatível.

  1. Crie e salve uma região de interesse (ROI).
    1. No ImageJ, clique em Arquivo | Novo | Imagem. Na caixa de diálogo exibida, clique em OK.
    2. Clique no botão Rectangle Tool e desenhe uma caixa de 6 mícrons x 6 mícrons. Abra o gerenciador de ROI clicando em Analisar | Ferramentas | ROI Manager e aguarde até que uma caixa de diálogo com o gerenciador de ROI apareça (Figura 3A). Adicione o ROI retangular ao gerenciador clicando em Adicionar na caixa de diálogo do gerente. Salve o ROI selecionando Mais e, em seguida, clique no botão Salvar e OK.
  2. Meça a intensidade da fluorescência.
    1. Na Imagem J, clique em Arquivo e selecione Abrir. Na caixa de diálogo, selecione os arquivos de imagem para o experimento e clique em Abrir.
    2. Aguarde até que a janela Bio-formats Import Options (Opções de importação de bioformatos ) seja exibida (Figura 3B). Selecione Canais divididos e clique em Abrir.
      NOTA: O recurso de canais divididos permite que cada canal na imagem seja aberto como uma janela separada. A ordem do canal corresponde à ordem de aquisição.
      1. Experimentos TMRE : YFP (Setting 1) é o primeiro canal (c = 0); MitoTracker (Configuração 1) é o segundo canal (c = 1); e TMRE (Setting 2) é o terceiro canal (c = 2).
      2. Experimentos MitoSOX : YFP (Setting 1) é o primeiro canal (c = 0); MitoSOX (Setting 2) é o segundo canal (c = 1); e MitoTracker (Configuração 3) é o terceiro canal (c = 2).
    3. Ajuste o brilho selecionando Imagem | Ajustar | Brilho (Figura 3C).
      Observação : não pressione Definir ou aplicar para garantir que o brilho da imagem não é alterado permanentemente. Ocasionalmente, a intensidade da fluorescência não é visível nos canais TMRE ou MitoSOX. Ajuste o brilho para permitir uma visualização mais fácil. Alterar o brilho não afeta os valores brutos de intensidade de fluorescência.
    4. Clique em Analisar e selecione Definir medidas. Marque as caixas Area e Mean gray value e clique em OK (Figura 3D).
      Observação : o valor médio de cinza é a intensidade de fluorescência.
    5. Abra o ROI Manager e carregue o ROI salvo na etapa 5.1 clicando em Analisar | Ferramentas | Gerente de ROI. No Gerenciador de ROI, clique em Mais, em Abrir na lista exibida e selecione o ROI salvo.
    6. Meça a intensidade da fluorescência de cinco regiões aleatórias em uma única célula selecionando a ROI salva do gerenciador de ROI e mova a ROI para um local aleatório dentro de uma célula (Figura 3E). Meça a intensidade da fluorescência pressionando M. Repita esta etapa com quatro regiões adicionais não sobrepostas. Quando uma caixa de diálogo com os valores de área e cinza médio for exibida (Figura 3F), copie e cole os valores em uma planilha para análise.
      1. Experimento TMRE : Selecione a imagem (c = 2).
      2. Experimento MitoSOX : Selecione a imagem (c = 2).
    7. Obter os valores médios de intensidade de fluorescência. Usando um software de planilha eletrônica (consulte Tabela de Materiais), faça a média dos cinco valores médios de cinza. Repita esse processo para cada célula.
    8. Analisar e comparar os valores médios de cinza TMRE ou MitoSOX em condições experimentais usando um programa de software estatístico (ver Tabela de Materiais; Figura 4 e Figura 5). Apresente os dados como gráficos de barras ou gráficos de violino.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neste protocolo, a quantificação baseada em fluorescência foi utilizada para medir o potencial de membrana e os níveis de superóxido da rede mitocondrial após o tratamento com CCCP (Figura 1). Esse fluxo de trabalho usou células HeLa, uma linhagem celular imortalizada derivada do câncer cervical. As células HeLa são rotineiramente usadas para estudar a biologia mitocondrial e são relativamente planas, facilitando a visualização da rede mitocondrial usando microscopia. Para investigar o papel...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O fluxo de trabalho aqui descrito pode ser usado para quantificar o potencial de membrana mitocondrial e os níveis de superóxido de forma robusta e reprodutível usando imagens baseadas em fluorescência30. Há limitações técnicas importantes a serem consideradas ao projetar esses experimentos. As células HeLa foram transfectadas com um vetor YFP vazio, YFP-ParkinWT ou YFP-ParkinT240R. O vetor YFP vazio foi usado como controle para confirmar que os achados experimentais eram esp...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm interesses concorrentes a declarar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos aos membros do laboratório Evans por seu feedback atencioso sobre este manuscrito. Este trabalho é apoiado por Duke Whitehead Scholars, Duke Science and Technology Scholars, e Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Hanna Gray Fellowship. A Figura 1A foi confeccionada com BioRender.com.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Produtos Químicos, Peptídeos e Proteínas Recombinantes
CCCP (carbonilcianeto m-clorofenil hidrazona) Sigma-AldrichC2759
DMEM (1x) com 4,5 g/L de glicoseGibco11-965-084
DMSO, AnidroThermoFisher ScientificD12345
Fetal BovineSerum HycloneSH3007103
FuGENE 6 (Reagente de Tranfecção)PromegaE2691
GlutaMAX 100x (Solução L-Glutamina) Gibco 35-050-061
Hoescht 33342ThermoFisher Scientific62249
MitoSOX  Vermelho ThermoFisher ScientificM36008
MitoTracker Vermelho EscuroThermoFisher ScientificM7514
Opti-MEM (Meio de soro reduzido)ThermoFisher scientific31985070
Tetrametilrodamina, Éster Etílico, Perclorato (TMRE) ThermoFisher ScientificT669
Modelos experimentais: Organismos/Cepas
HeLa-M (Homo sapiens)A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research)N/A
DNA recombinante
EYFP Vetor Vazio N/A/A
YFP-Parkin T240REste artigofoi gerado por mutagênese dirigida ao local de YFP-Parkin
YFP-Parkin WTAddgene; PMID:19029340RRID:Addgene_23955
Software e Algoritmos
Adobe IllustratorAdobe Inc.https://www.adobe.com/products/illustrator(Schindelin, 2012)
Excel (Software de Planilha)Microsoft Office 
ImageJhttps://imagej.net/software/fiji/
Leica Application Suite (LAS X)Leicahttps://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Microsoft ExcelMicrosoft Officehttps://www.microsoft.com/excel
Prism9 (Estatístico Software de análise)Software GraphPadhttps://www.graphpad.com
Outro
35 mm Prato, lamínula nº 1,5, diâmetro de vidro de 20 mm, incubadoraMatTekP35G-1.5-20-C
(câmara ambiental)Okolabhttps://www.oko-lab.com/cage-incubator
DMiLLeicaN/A
LIGHTNING Software de deconvoluçãoLeicaN/A
STELLARIS 8 microscópio confocalLeicaN/A
Nhttps://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel de gaiola não revestidaMicroscópio invertido

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
  2. West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S. Mitochondria in innate immune responses. Nature Reviews. Immunology. 11 (6), 389-402 (2011).
  3. Seth, R. B., Sun, L., Ea, C. K., Chen, Z. J. Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF 3. Cell. 122 (5), 669-682 (2005).
  4. Tait, S. W. G., Green, D. R. Mitochondria and cell signalling. Journal of Cell Science. 125, 807-815 (2012).
  5. Antico Arciuch, V. G., Elguero, M. E., Poderoso, J. J., Carreras, M. C. Mitochondrial regulation of cell cycle and proliferation. Antioxidants and Redox Signaling. 16 (10), 1150-1180 (2012).
  6. Grunewald, A., Kumar, K. R., Sue, C. M. New insights into the complex role of mitochondria in Parkinson's disease. Progress in Neurobiology. 177, 73-93 (2019).
  7. Borsche, M., Pereira, S. L., Klein, C., Grunewald, A. Mitochondria and Parkinson's disease: clinical, molecular, and translational aspects. Journal of Parkinson's Disease. 11 (1), 45-60 (2021).
  8. Ou, Z., et al. Global trends in the incidence, prevalence, and years lived with disability of Parkinson's disease in 204 countries/territories from 1990 to 2019. Frontiers in Public Health. 9, 776847(2021).
  9. Martinez-Vicente, M. Neuronal mitophagy in neurodegenerative diseases. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 64(2017).
  10. Youle, R. J., Narendra, D. P. Mechanisms of mitophagy. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 12 (1), 9-14 (2011).
  11. Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. E. No Parkin zone: mitophagy without Parkin. Trends in Cell Biology. 28 (11), 882-895 (2018).
  12. Geisler, S., et al. The PINK1/Parkin-mediated mitophagy is compromised by PD-associated mutations. Autophagy. 6 (7), 871-878 (2010).
  13. Kane, L. A., et al. PINK1 phosphorylates ubiquitin to activate Parkin E3 ubiquitin ligase activity. The Journal of Cell Biology. 205 (2), 143-153 (2014).
  14. Koyano, F., et al. Ubiquitin is phosphorylated by PINK1 to activate parkin. Nature. 510 (7503), 162-166 (2014).
  15. Ordureau, A., et al. Defining roles of PARKIN and ubiquitin phosphorylation by PINK1 in mitochondrial quality control using a ubiquitin replacement strategy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (21), 6637-6642 (2015).
  16. Ordureau, A., et al. Quantitative proteomics reveal a feedforward mechanism for mitochondrial PARKIN translocation and ubiquitin chain synthesis. Molecular Cell. 56 (3), 360-375 (2014).
  17. Kitada, T., et al. Mutations in the parkin gene cause autosomal recessive juvenile parkinsonism. Nature. 392 (6676), 605-608 (1998).
  18. Valente, E. M., et al. PARK6 is a common cause of familial parkinsonism. Neurological Sciences. 23, S117-S118 (2002).
  19. Matsuda, N., et al. PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy. The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).
  20. Sriram, S. R., et al. Familial-associated mutations differentially disrupt the solubility, localization, binding and ubiquitination properties of parkin. Human Molecular Genetics. 14 (17), 2571-2586 (2005).
  21. Vives-Bauza, C., et al. PINK1-dependent recruitment of Parkin to mitochondria in mitophagy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (1), 378-383 (2010).
  22. Wong, Y. C., Holzbaur, E. L. F. Optineurin is an autophagy receptor for damaged mitochondria in parkin-mediated mitophagy that is disrupted by an ALS-linked mutation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (42), E4439-E4448 (2014).
  23. Bertolin, G., et al. Parkin maintains mitochondrial levels of the protective Parkinson's disease-related enzyme 17-beta hydroxysteroid dehydrogenase type 10. Cell Death and Differentiation. 22 (10), 1563-1576 (2015).
  24. Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), (2016).
  25. Kuznetsov, A. V., et al. Mitochondrial ROS production under cellular stress: comparison of different detection methods. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400 (8), 2383-2390 (2011).
  26. Moore, A. S., Holzbaur, E. L. F. Dynamic recruitment and activation of ALS-associated TBK1 with its target optineurin are required for efficient mitophagy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (24), E3349-E3358 (2016).
  27. Evans, C. S., Holzbaur, E. L. F. Degradation of engulfed mitochondria is rate-limiting in Optineurin-mediated mitophagy in neurons. eLife. 9, e50260(2020).
  28. Jacobsen, L. B., Calvin, S. A., Colvin, K. E., Wright, M. FuGENE 6 Transfection Reagent: the gentle power. Methods. 33 (2), 104-112 (2004).
  29. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  30. Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 4, Unit 4.25 1-21 (2010).
  31. Lin, H. C., Liu, S. Y., Lai, H. S., Lai, I. R. Isolated mitochondria infusion mitigates ischemia-reperfusion injury of the liver in rats. Shock. 39 (3), 304-310 (2013).
  32. Kholmukhamedov, A., Schwartz, J. M., Lemasters, J. J. Isolated mitochondria infusion mitigates ischemia-reperfusion injury of the liver in rats: mitotracker probes and mitochondrial membrane potential. Shock. 39 (6), 543(2013).
  33. Thorn, K. Genetically encoded fluorescent tags. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).
  34. Pavel, M., et al. Contact inhibition controls cell survival and proliferation via YAP/TAZ-autophagy axis. Nature Communications. 9 (1), 2961(2018).
  35. Rossignol, R., et al. Energy substrate modulates mitochondrial structure and oxidative capacity in cancer cells. Cancer Research. 64 (3), 985-993 (2004).
  36. Schornack, P. A., Gillies, R. J. Contributions of cell metabolism and H+ diffusion to the acidic pH of tumors. Neoplasia. 5 (2), 135-145 (2003).
  37. Christensen, M. E., Jansen, E. S., Sanchez, W., Waterhouse, N. J. Flow cytometry based assays for the measurement of apoptosis-associated mitochondrial membrane depolarisation and cytochrome c release. Methods. 61 (2), 138-145 (2013).
  38. Muller, B., et al. Application of extracellular flux analysis for determining mitochondrial function in mammalian oocytes and early embryos. Scientific Reports. 9 (1), 16778(2019).
  39. Connolly, N. M. C., et al. Guidelines on experimental methods to assess mitochondrial dysfunction in cellular models of neurodegenerative diseases. Cell Death and Differentiation. 25 (3), 542-572 (2018).
  40. Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: a key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795(2019).
  41. Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. The Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).
  42. Kwak, S. H., Park, K. S., Lee, K. U., Lee, H. K. Mitochondrial metabolism and diabetes. Journal of Diabetes Investigation. 1 (5), 161-169 (2010).
  43. Reddy, P. H. Role of mitochondria in neurodegenerative diseases: mitochondria as a therapeutic target in Alzheimer's disease. CNS Spectrums. 14 (8), 8-13 (2009).
  44. Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease: recent advances. Molecular Neurodegeneration. 15 (1), 30(2020).
  45. Baloyannis, S. J. Mitochondrial alterations in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 9 (2), 119-126 (2006).
  46. Wallace, D. C. Mitochondria and cancer. Nature Reviews. Cancer. 12 (10), 685-698 (2012).
  47. Middleton, P., Vergis, N. Mitochondrial dysfunction and liver disease: role, relevance, and potential for therapeutic modulation. Therapeutic Advances in Gastroenterology. 14, 17562848211031394(2021).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Mitochondrial Membrane PotentialSuperoxide LevelsLive Cell ImagingHeLa CellsFluorescence QuantificationMitochondrial NetworkTMRE StainingMitoSOX FluorescenceParkin MutationMitochondrial Quality Control

Artigos relacionados