Detecção quantitativa de ligações cruzadas DNA-proteína e suas modificações pós-traducionais

Resumo

O presente protocolo destaca um método modificado para detectar e quantificar ligações cruzadas DNA-proteína (DPCs) e suas modificações pós-traducionais (MPTs), incluindo ubiquitilação, SUMOilação e ADP-ribosilação induzida por inibidores de topoisomerase e por formaldeído, permitindo assim o estudo da formação e reparo de DPCs e suas MPTs.

Resumo

As ligações cruzadas DNA-proteína (DPCs) são lesões de DNA frequentes, ubíquas e deletérias, que surgem de danos endógenos ao DNA, mau funcionamento de enzimas (topoisomerases, metiltransferases, etc.) ou agentes exógenos, como quimioterápicos e agentes de reticulação. Uma vez que as CPDs são induzidas, vários tipos de modificações pós-traducionais (MPTs) são prontamente conjugadas a elas como mecanismos de resposta precoce. Foi demonstrado que as DPCs podem ser modificadas por ubiquitina, pequeno modificador semelhante à ubiquitina (SUMO) e poli-ADP-ribose, que estimulam os substratos a sinalizar suas respectivas enzimas de reparo designadas e, em alguns casos, coordenam o reparo de maneira sequencial. Como as MPTs transpiram rapidamente e são altamente reversíveis, tem sido um desafio isolar e detectar DPCs conjugadas a PTM que geralmente permanecem em níveis baixos. Apresentamos aqui um imunoensaio para purificar e detectar quantitativamente DPCs ubiquitiladas, SUMOiladas e ADP-ribosiladas (DPCs topoisomerases induzidas por drogas e DPCs não específicas induzidas por aldeído) in vivo. Este ensaio é derivado do ensaio RADAR (rapid approach to DNA adduct recovery) que é usado para o isolamento de DNA genômico contendo DPCs por precipitação de etanol. Após a normalização e digestão de nucleases, PTMs de DPCs, incluindo ubiquitilação, SUMOilação e ADP-ribosilação, são detectados por immunoblotting usando seus anticorpos correspondentes. Este ensaio robusto pode ser utilizado para identificar e caracterizar novos mecanismos moleculares que reparam DPCs enzimáticas e não enzimáticas e tem o potencial de descobrir inibidores de pequenas moléculas visando fatores específicos que regulam as MPTs para reparar as DPCs.

Introdução

O dano ao DNA genômico ocorre devido ao decaimento espontâneo, danos internos e fatores ambientais¹. As lesões de DNA resultantes compreendem bases danificadas, incompatibilidades, quebras de fita simples e dupla, ligações cruzadas inter e intra-fitas e ligações cruzadas DNA-proteína (DPCs). Um DPC é formado quando uma proteína ligada à cromatina é aprisionada no DNA através de ligação covalente. As CPDs são induzidas por lesões endógenas de DNA e metabólitos reativos, além de agentes exógenos como quimioterápicos e reticulantes bifuncionais. Em determinadas circunstâncias, a disfunção enzimática também pode levar à formação de^{CPDs 2}. A grande diferença nos indutores de DPC resulta em uma diferença na identidade da proteína ligada covalente, na região cromossômica onde a DPC é formada, no tipo de estrutura do DNA reticulado à proteína e na propriedade química da ligação covalente entre a proteína e o DNA ^2,3,4.

Com base em sua natureza química, as DPCs são geralmente categorizadas em dois grupos: DPCs enzimáticas e DPCs não enzimáticas. Certas enzimas, como topoisomerases, glicosilases e metil/aciltransferases, atuam formando intermediários covalentes enzima-DNA reversíveis durante suas reações catalíticas normais. Estes são intermediários enzima-DNA de curta duração e podem ser convertidos em DPCs enzimáticas de vida longa após seu aprisionamento por agentes endógenos ou exógenos, em particular por quimioterápicos³. As CPDs topoisomerases estão entre as CPDs enzimáticas mais frequentes em células eucarióticas, que podem ser geradas por inibidores da topoisomerase clinicamente úteis (topotecano e irinotecano para topoisomerase I [TOP1] e etoposídeo e doxorrubicina para topoisomerase II [TOP2]) e são os principais mecanismos terapêuticos desses inibidores ^5,6. As DNA metiltransferases (DNMT) 1, 3A e 3B são alvo da 5-aza-2'-desoxicitidina (também conhecida como decitabina) e formam DPCs quando expostas ao fármaco⁷. Agentes reativos, bem como luz ultravioleta e radiação ionizante, induzem DPCs não enzimáticas por proteínas de reticulação não específicas ao DNA. Aldeídos reativos como acetaldeído e formaldeído (AG) são frequentemente gerados como subprodutos do metabolismo celular, entre os quais o AG é produzido em concentrações micromolares durante o metabolismo do metanol, peroxidação lipídica e desmetilação de histonas. Além disso, a AF é um produto químico de produção de alto volume fabricado em todo o mundo, ao qual muitas pessoas estão expostas tanto ambiental quanto ocupacionalmente ^8,9.

As DPCs enzimáticas e não enzimáticas são altamente tóxicas para as células, pois seus componentes proteicos volumosos dificultam eficientemente quase todos os processos baseados em cromatina, incluindo replicação e transcrição, levando à parada do ciclo celular e apoptose se não forem reparados. Nas últimas duas décadas, o reparo de CPDs tem sido vigorosamente estudado, e várias proteínas/vias têm sido identificadas como fatores-chave que reparam diretamente as CPDs ou modulam seus processos de reparo. Por exemplo, está bem estabelecido que a proteólise do volume proteico de uma DPC é uma etapa fundamental do reparo da DPC, e que a proteólise pode ser catalisada pelas proteases SPRTN 10,11,12,13,14, FAM111A¹⁵, GCNA 16,17 ou pelo complexo proteassoma^26S 18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27 de forma dependente do tipo celular ou do contexto celular. A identificação e caracterização dessas proteases têm se baseado em grande parte no ensaio in vivo complex of the enzyme (ICE)^28,29 e no ensaio RADAR (rapid approach to DNA adduct recovery)^30,31, que isolam moléculas de DNA e suas proteínas ligadas covalentes de proteínas celulares livres para permitir a detecção de DPCs por slot-blot usando anticorpos direcionados às proteínas reticuladas. Além disso, o ensaio de imunomarcação de DNA de agarose (TARDIS) foi usado como um meio de detectar e quantificar DPCs em nível de célula única³². Atualmente, os pesquisadores escolhem o ensaio RADAR em vez do ensaio ICE para medir DPCs, já que o ensaio ICE se baseia na purificação de ácidos nucleicos usando ultracentrifugação de gradiente de cloreto de césio, o que é extremamente demorado, enquanto o ensaio RADAR precipita ácidos nucleicos usando etanol em um período muito mais curto.

Nos últimos anos, surgiram evidências crescentes de que múltiplas modificações pós-traducionais (MPTs) estão envolvidas na sinalização e recrutamento de proteases direcionadas para DPC 3,33,34,35. Por exemplo, ambos os TOP1- e TOP2-DPCs foram encontrados para ser conjugado por pequeno modificador ubiquitin-like (SUMO)-2/3 e, em seguida, SUMO-1 pelo SUMO E3 ligase PIAS4, independentemente da replicação de DNA e transcrição. As modificações sequenciais do SUMO parecem ser um alvo da ubiquitina, que é depositada aos TOP-DPCs SUMOilados e forma cadeias poliméricas através de seu resíduo de lisina 48 por uma ligase de ubiquitina direcionada à SUMO, denominada RNF4. Posteriormente, o polímero ubiquitina provoca um sinal e recruta o proteassoma 26S para TOP-DPCs^23,36. Recentemente, foi demonstrado que a mesma via SUMO-ubiquitina atua em DNMT1-DPCs, bem como em complexos PARP-DNA para seu reparo^37,38. Além disso, a ubiquitilação independente de SUMO pela ubiquitina E3 ligase TRAIP tem sido relatada como DPCs para degradação proteassomal de forma acoplada à replicação³⁹. Assim como a degradação proteassomal de TOP-DPCs, a proteólise de DPCs enzimáticas e não enzimáticas pela metaloprotease acoplada à replicação SPRTN também requer a ubiquitilação dos substratos de DPC como mecanismo de engajamento de SPRTN^40,41. A delimitação do papel da SUMOilação e ubiquitilação requer a detecção de DPCs que são marcados com essas PTMs. Como o ensaio ICE original e o ensaio RADAR dependem do aparelho slot-blot/dot-blot para medir amostras de DNA não digeridas, nenhum desses dois ensaios é capaz de resolver e visualizar espécies de DPC conjugadas a PTM com pesos moleculares diferentes. Para superar esse problema, digerimos as amostras de DNA após sua purificação por precipitação de etanol e normalização das amostras com nuclease microcócica, uma endo-exonuclease de DNA e RNA para liberar as proteínas reticuladas, o que nos permitiu resolver as proteínas, bem como suas PTMs covalentes com eletroforese em gel de poliacrilamida dodecil-sulfato de sódio (SDS-PAGE). A eletroforese permitiu detectar e quantificar DPCs conjugadas a PTM usando anticorpos específicos direcionados às MPTs. Inicialmente, denominamos este método aprimorado de ensaio DUST, para destacar sua robustez na detecção de TOP-DPCs ubiquiquilados e SUMOilados²³. Posteriormente, expandimos o uso do ensaio para avaliar quantitativamente a ADP-ribosilação de TOP1-DPCs in vivo, utilizando anticorpos contra polímeros de poli-ADP-ribose²⁰.

Apresentamos aqui um protocolo detalhado para o ensaio que detecta e mede DPCs ubiquitiladas, SUMOiladas e ADP-ribosiladas, que foi otimizado para as DPCs TOP-modificadas que são induzidas por seus inibidores e DPCs não-específicas/não enzimáticas que são induzidas por AG. Este ensaio isola as DPCs conjugadas com PTM lisando as células com um agente caotrópico, precipitando o DNA com etanol e liberando as proteínas reticuladas e seus modificadores com nuclease microcócica. As proteínas ligadas ao DNA e suas PTMs são quantificadas por immunoblotting usando anticorpos específicos. Este ensaio abre um novo caminho para elucidar os mecanismos moleculares pelos quais a célula repara DPCs enzimáticas e não enzimáticas. Especificamente, permite estudos detalhados da indução e cinética de PTMs importantes para a regulação da degradação e reparo de TOP-DPC, e assim permite a descoberta de novos fatores como os ligases E3 ditando as PTMs, bem como inibidores direcionados a esses fatores. Uma vez que algumas das MPTs responsáveis pelo reparo da TOP-DPC provavelmente estão envolvidas no reparo de CPDs induzidas por outros quimioterápicos, como fármacos à base de platina²², este ensaio também tem potencial para aplicação na descoberta de novos fármacos e otimização racional de terapias combinatórias com inibidores da topoisomerase ou antineoplásicos à base de platina em células de pacientes para orientar regimes de tratamento.

Protocolo

1. Cultura celular e tratamento medicamentoso na linhagem celular humana embrionária rim 293 (HEK293)

1. Preparar meio de cultura, meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), suplementado com 10% de soro fetal bovino, 1% 2 mM L-glutamina e 100 unidades/mL de penicilina-estreptomicina.
2. Semear 1 x 10 6 células em uma placa de 60 mm ou uma placa de⁶ poços por condição de tratamento mais controle.
3. No dia seguinte, tratar as células com indutores de DPC de escolha.
   1. Para induzir TOP1-DPCs e sua ubiquitilação e SUMOilação, adicione o inibidor de TOP1 camptotecina a 20 μM às células e colete as células em 20, 60 e 180 min.
   2. Para induzir TOP2α e β-DPCs e sua ubiquitilação e SUMOilação, expor as células para adicionar o inibidor de TOP2 etoposídeo a 200 μM às células e coletar as células em 20, 60 e 180 min.
   3. Para induzir DPCs não enzimáticas e sua ubiquitilação e SUMOilação, adicionar AG a 1 mM e coletar as células 2 h após a exposição.
   4. Para induzir a PARilação de TOP1-DPCs, pré-trate as células por 1 h para bloquear a desPARilação com inibidor da poli(ADP-ribose) glicohidrolase (PARG) PDD00017273 a 10 μM, seguido de co-tratamento com 20 μM de camptotecina por 20, 60 e 180 min.

2. Isolamento e normalização de DNA contendo proteínas reticuladas

1. Aspirar rapidamente o meio com uma pipeta de aspiração após o tratamento e enxaguar as células com solução salina tamponada com fosfato (PBS) gelada 1x. Lisar imediatamente as células em 600 μL de reagente DNAzol contendo 1x inibidor de coquetel de protease, 1 mM de ditiotreitol (DTT) e 20 mM de N-etilmaleimida (inibidor de enzimas dessumoilantes e deubiquitilantes).
2. Agitar lentamente a placa numa plataforma vibratória durante 10 minutos a 4 °C.
3. Adicionar 1/2 volume de etanol 100% gelado (0,3 mL) diretamente à placa e repetir a etapa 2.2 até que o agregado opaco de ácido nucleico se torne visível. Transferir o lisado celular para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e submeter o tubo à velocidade máxima (20.000 x g) de centrifugação por 15 min a 4 °C para precipitar o ácido nucleico e suas proteínas reticuladas.
4. Aspirar o sobrenadante com uma pipeta de aspiração e lavar o pellet de ácido nucleico em 1 mL de etanol a 75%, seguido de 2 min de centrifugação a 20.000 x g a 4 °C.
5. Aspirar o sobrenadante, girar para baixo na mesma velocidade e remover o líquido restante usando uma pipeta P20. Seque o pellet ao ar por 5 min.
6. Dissolver rapidamente o pellet de ácido nucleico em 0,1 mL de ddH₂O. Ressuspenda o pellet por pipetagem repetida e, em seguida, incube em banho-maria a 37 °C até que o pellet inche para pelo menos três vezes maior (aproximadamente 30 min).
7. Sonicar as amostras com uma sonda de processador ultra-sônico a 30% de amplitude por 10 s para dissolver totalmente o pellet.
8. Etapa opcional: Tratar as amostras com a mistura de RNase A/T1 (10 μg de RNase A e 25 U de RNase T1) e incubar a 37 °C por 15 min. Adicionar 1/10 volume de acetato de sódio 3 M e dois volumes de etanol 100% gelado ao tubo, seguido de centrifugação a 20.000 x g por 10 min para recuperar o DNA. Remover o sobrenadante e dissolver o DNA precipitado em 0,1 mL de ddH₂O.
9. Etapa opcional: Centrifugar a amostra por 5 min a 20.000 x g e transferir o sobrenadante para um novo tubo.
10. Quantifique a concentração de DNA usando um espectrômetro ultravioleta-visível (UV-Vis). O rendimento típico de DNA é de cerca de 600-800 ng/μL. A relação A260/A280 deve ser reduzida de 2,0-2,1 para 1,8-1,9 após a remoção do RNA.
11. Ajustar a concentração do ADN para 400-500 ng/μL em 0,12 ml de ddH 2 O. Transferir 20 μL da amostra para um novo tubo de microcentrífuga como controlo de carga de ADN não digerido (ver passo_2.4).
12. Para digerir o DNA dissolvido nos 100 μL restantes de ddH 2 O,adicione 2.000 unidades de gel de nuclease microcócica juntamente com 1/10 volume (~11 μL) de 10x tampão de reação de nuclease microcócica de cálcio à amostra. Incubar a 37 °C durante 30 min.

3. Western blotting de amostras de DNA digerido

1. Adicione 4x tampão de amostra Laemmli e, em seguida, ferva a amostra por 5 min.
2. Carregar 5-6 μg de amostra digerida (~15 μL) em gel de poliacrilamida a 4%-20%, seguido de SDS-PAGE⁴² para resolver DPCs não modificadas e conjugadas a PTM.
3. Para detectar espécies de DPC não enzimáticas induzidas por FA, incubar o gel com coloração de azul de Coomassie durante a noite à temperatura ambiente. Lave o gel com ddH 2 O por₂h e adquira uma imagem usando um sistema de imagem.
4. Transfira o gel e incube as membranas durante a noite a 4 °C com diluições apropriadas de anticorpo primário em tampão de bloqueio.
   1. Para detectar a ubiquitilação, faça uma diluição de 1:100 do anticorpo anti-ubiquitina.
   2. Para detectar a modificação SUMO-1 ou SUMO-2/3, faça uma diluição 1:250 do anticorpo anti-SUMO-1 ou anti-SUMO-2/3.
   3. Para detectar ADP-ribosilação, fazer uma diluição de 1:500 de anticorpo anti-PAR.
   4. Para detectar TOP1-, TOP2α-, ou TOP2β-DPCs totais, faça uma diluição de 1:500 do anticorpo anti-TOP1, anti-TOP2α ou anti-TOP2β.
      NOTA: Consulte a Tabela de materiais para obter detalhes sobre a diluição de anticorpos.
5. Incubar uma membrana lavada 1x PBS-T (0,1% tween 20) com um anticorpo secundário diluído 5.000 vezes em tampão de bloqueio por 60 min à temperatura ambiente.
6. Desenvolver a membrana com reagente de quimioluminescência aprimorada (ECL) e adquirir uma imagem usando o sistema de imagem.

4. Slot-blotting de amostras de ADN não digeridas

1. Diluir a amostra de 20 μL de ADN não digerido em 180 μL de tampão fosfato de sódio (25 mM, pH 6,6).
2. Cortar a membrana de nitrocelulose (0,45 μm) e equilibrar por 5 min no tampão fosfato de sódio.
3. Monte o aparelho de ranhura-blot de acordo com as instruções do fabricante e ligue-o a um sistema de vácuo.
4. Lave os poços com tampão fosfato de sódio aplicando o vácuo. Certifique-se de que não há vazamento dos poços.
5. Pare o vácuo e carregue 200 μL de DNA por amostra (1 μg). Encher os poços vazios com 200 μL de tampão fosfato de sódio.
6. Aplique o vácuo.
7. Quando todos os poços estiverem completamente vazios, pare o vácuo, carregue 200 μL de tampão fosfato de sódio em cada poço e repita a etapa 4.6.
8. Recuperar a membrana e bloquear com tampão de bloqueio a 5% durante 0,5 h à temperatura ambiente.
9. Sonda com anticorpo anti-DNA de fita dupla (dsDNA) em uma diluição de 1:5.000 durante a noite a 4 °C.
10. Lavar 3x com 1x PBS-T e incubar com 1:5.000 anticorpo secundário anti-camundongo anti-peroxidase de raiz forte diluído (HRP).
11. Desenvolver a membrana com reagente de quimioluminescência aprimorada (ECL) e adquirir uma imagem usando o sistema de imagem.

5. Análise densitométrica

1. Usando o ImageJ, calcule a razão da intensidade de cada banda/esfregaço em relação à intensidade do slot de DNA não digerido e normalize a proporção com a das células sem/antes do tratamento medicamentoso.

Resultados

Os resultados representativos apresentados na Figura 1 mostram a formação e cinética das TOP1-DPCs induzidas por drogas e sua SUMOilação e ubiquitilação. O TOP1 clivou uma fita do dúplex de DNA e formou um intermediário covalente enzima-DNA, denominado complexo de clivagem TOP1 (TOP1cc). O tratamento da camptotecina (CPT), um inibidor do TOP1, ligou-se e estabilizou o TOP1cc, levando à formação de TOP1-DPCs de longa vida. Observou-se que as TOP1-DPCs foram induzidas e atingiram o pico 20 min após a exposição ao CPT. Simultaneamente, as TOP1-DPCs foram modificadas pelo SUMO-2/3, que também atingiu o pico 20 min após o tratamento com CPT. Como SUMO-2 e SUMO-3 compartilham 95% de identidade de sequência, o anticorpo não distingue um do outro. Em 60 min, TOP1-DPCs e sua modificação SUMO-2/3 diminuíram, acompanhadas pelo culminar de sua modificação SUMO-1 e ubiquitilação. Após o tratamento medicamentoso de 60 min, os níveis de modificação e ubiquitilação do TOP1-DPC SUMO-1 começaram a diminuir. Em mamíferos, as isoenzimas TOP2 α e β atuam introduzindo uma quebra de fita dupla de DNA, bem como através da formação de um complexo covalente enzima-DNA transitório e reversível (TOP2cc). Os inibidores de TOP2, como o etoposídeo (ETOP), convertem TOP2cc em TOP2-DPCs e induzem sua SUMOilação e ubiquitilação. Semelhante à cinética das TOP1-DPCs e suas PTMs, as TOP2α- e β-DPCs e sua modificação SUMO-2/3 atingiram um pico em 20 min, então começaram a diminuir; enquanto isso, suas modificações no SUMO-1 e na ubiquitina atingiram o pico em 60 min (Figura 2). A depuração de TOP-DPCs tem sido demonstrada como resultado da degradação proteassomal, e a depuração de TOP-DPC SUMOylation e ubiquitylation é provavelmente devido à reciclagem por desSUMOylation e deubiquitylation, respectivamente, por suas enzimas reversoras. Os experimentos da Figura 3 examinaram DPCs não enzimáticas induzidas por AG e suas MPTs. Observou-se que as CPDs e seus SUMO-2/3, SUMO-1 e ubiquitilação formaram-se e acumularam-se de forma dose-dependente de AG. Finalmente, a PARilação das TOP1-DPCs foi detectada quantitativamente com um anticorpo anti-PAR usando o mesmo método (Figura 4). A PARilação TOP1-DPC não foi detectável a menos que um inibidor de PARG fosse adicionado à célula, sugerindo que a PARilação transpira prontamente e é altamente dinâmica. Consistente com o achado anterior, a inibição da desPARilação por PARGi pareceu acumular TOP1-DPCs, provavelmente por bloquear a degradação proteolítica.

Figura 1: Análise quantitativa da formação e cinética de TOP1-DPCs e sua SUMOilação e ubiquitilação após o tratamento com CPT em células HEK293. (A) As células HEK293 foram tratadas com 20 μM de CPT pelos períodos de tempo indicados. Os lisados celulares foram colhidos e submetidos ao ensaio RADAR modificado e western blotting com anticorpos indicados. Amostras de DNA não digeridas foram submetidas a slot-blotting usando anticorpo anti-dsDNA como controle de carga. (B) As intensidades das bandas foram quantificadas com o software ImageJ e plotadas com o software Prism. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Análise quantitativa da formação e cinética de TOP2-DPCs e sua SUMOilação e ubiquitilação após o tratamento com ETOP em células HEK293. (A) As células HEK293 foram tratadas com 200 μM de ETOP pelos períodos de tempo indicados. Os lisados celulares foram colhidos e submetidos ao ensaio RADAR modificado e western blotting com anticorpos indicados. Amostras de DNA não digeridas foram submetidas a slot-blotting usando anticorpo anti-dsDNA como controle de carga. (B) As intensidades das bandas foram quantificadas com o software ImageJ e plotadas com o software Prism. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Análise quantitativa das DPCs não enzimáticas e sua SUMOilação e ubiquitilação após tratamento com AG em células HEK293. (A) As células HEK293 foram tratadas com AG nas concentrações indicadas por 2 h. Os lisados celulares foram colhidos e submetidos ao ensaio RADAR modificado e western blotting com anticorpos indicados. Amostras de DNA não digeridas foram submetidas a slot-blotting usando anticorpo anti-dsDNA como controle de carga. (B) As intensidades das bandas foram quantificadas com o software ImageJ e plotadas com o software Prism. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Análise quantitativa das TOP1-DPCs e sua PARilação após o tratamento com CPT em células HEK293. (A) As células HEK293 foram pré-tratadas com 10 μM de PARGi por 1 h e, em seguida, co-tratadas com CPT pelos períodos de tempo indicados. Os lisados celulares foram colhidos e submetidos ao ensaio RADAR modificado e western blotting com anticorpos indicados. Amostras de DNA não digeridas foram submetidas a slot-blotting usando anticorpo anti-dsDNA como controle de carga. (B) As intensidades das bandas foram quantificadas com o software ImageJ e plotadas com o software Prism. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

O método descrito permite a medição de ligações cruzadas DNA-proteína enzimáticas e não enzimáticas em células de mamíferos e é a única abordagem adequada para estudar sua ubiquitilação, SUMOilação e ADP-ribosilação. O slot-blotting após o ensaio ICE ou RADAR permite a detecção rápida de DPCs enzimáticas específicas, como TOP-DPCs, usando seus anticorpos. No entanto, uma ressalva a esse método é sua incapacidade de separar proteínas de diferentes pesos moleculares, impossibilitando a determinação dos tamanhos das DPCs conjugadas com PTM. O método descrito resolve o problema liberando proteínas reticuladas com nuclease microcócica, que degrada o DNA em oligonucleotídeos com 3'-fosfatos terminais, permitindo assim a separação completa das proteínas (conjugadas com oligonucleotídeos) por SDS-PAGE. DPCs modificados com monômeros de ubiquitina, SUMO ou ADP-ribose e polímeros de diferentes tamanhos podem, portanto, ser visualizados e quantificados por anticorpos direcionados a essas MPTs, permitindo uma investigação detalhada de sua formação e cinética. Para garantir a reprodutibilidade e calcular a significância estatística, são necessárias réplicas biológicas dos experimentos.

Um dos problemas mais comuns deste ensaio é o baixo rendimento de DNA após precipitação com etanol. Por um lado, o rendimento do DNA pode ser aumentado com mais material de partida (células). Por outro lado, a incubação de lisados celulares com etanol em uma placa plana em vez de um tubo Eppendorf pode melhorar acentuadamente a agregação de moléculas de DNA e, assim, facilitar sua precipitação. Sinais inespecíficos observados em amostras sem tratamento medicamentoso podem indicar contaminação proteica não covalente. Se este for o caso, pode-se considerar lavar pellets de DNA com tampão de alto sal para remover os contaminantes antes da sonicação. Também é recomendado girar amostras de DNA após a sonicação e digestão de nucleases microcócicas e descartar qualquer insolúvel. No caso de sinal fraco ou nenhum, várias soluções potenciais podem ser tentadas. Primeiro, pode-se aumentar a quantidade de carga de DNA para SDS-PAGE e immunoblotting. Para tornar as espécies de DPC SUMOiladas e ubiquitiladas detectáveis, recomenda-se carregar pelo menos 4 μg de DNA no gel. Em segundo lugar, pode-se aumentar as concentrações da droga para induzir níveis mais altos de DPCs e suas PTMs associadas. Uma incubação de 2 dias pode potencializar significativamente o sinal e, assim, reduzir a variabilidade biológica de experimentos independentes²³. A remoção de membrana para recoloração inevitavelmente resulta na perda de uma certa quantidade de espécies de DPC conjugadas com PTM que já estão em baixa abundância. Portanto, é altamente recomendável executar géis separados para detecção de ubiquitina e SUMO em vez de re-sondar uma mancha. Além disso, os pellets de DNA devem ser lavados com etanol 75% para remover o DNAzol restante contendo sal de guanidina antes da dissolução em H2O ou quaisquer outros solventes, o que de outra forma causa a cristalização da amostra após a adição do tampão de carregamento Laemmli.

O fluxo de trabalho do método descrito é muito mais eficiente em termos de tempo em comparação com o pesado ensaio ICE, pois se baseia na precipitação rápida de etanol em vez da demorada ultracentrifugação de cloreto de césio para isolar o DNA genômico. A um preço, a purificação à base de etanol traz uma baixa quantidade de contaminantes proteicos que normalmente são insignificantes para imunodetecção. No entanto, quando se trata de estudos analíticos, como análise proteômica baseada em espectrometria de massa ou sequenciamento de próxima geração que exigem precisão e exatidão, a centrifugação por gradiente de densidade de cloreto de césio ainda é uma abordagem mais confiável para isolar DNA puro e de alta abundância. Este método também pode ser potencialmente aplicado ao perfil de sítios de modificação em proteínas reticuladas e à determinação de tipos de ligação de poliubiquitilação e poli-SUMOilação usando métodos apropriados baseados em espectrometria de massas.

Vale ressaltar que este ensaio permite a identificação e caracterização de fatores reguladores de MPTs para reparo de CPDs. Por exemplo, métodos imparciais de triagem de alto rendimento (interferência de RNA e CRISPR) são ferramentas poderosas para descobrir ligases de ubiquitina E3, ligases SUMO E3 e seus cofatores associados mitigando a citotoxicidade de indutores de DPC. O método descrito permite a validação molecular dessas proteínas, determinando se elas ajudam as células a sobreviver aos indutores de DPC reparando as DPCs. Novos inibidores de pequenas moléculas que visam essas proteínas identificados, por exemplo, por triagem virtual, também podem ser validados usando esse protocolo. Tendo em vista que os inibidores de topoisomerase estão entre os quimioterápicos mais prescritos, este ensaio robusto pode ser desenvolvido como uma ferramenta para o desenvolvimento de fármacos que sinergizem com os inibidores clínicos de topoisomerases.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
10x solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Thermo Fisher	70011069
4– Gel de poliacrilamida pré-moldado a 20%	Bio-Rad	4561096
4x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	1610747
AcquaStain (coomassie blue)	Bulldog Bio	AS001000
anti-dsDNA (monoclonal de camundongo)	Abcam	27156	1: 5.000 diluição é recomendada
anti-PAR (monoclonal de camundongo)	R& D systems	4335-MC-100	1: 500 diluição é recomendada
anti-SUMO-1 (monoclonal de coelho)	Tecnologia de Sinalização Celular	4940	1: 250 diluição é recomendada
anti-SUMO-2/3 (monoclonal de coelho)	Tecnologia de Sinalização Celular	4971	: 250 diluição é recomendada
anti-TOP1 (monoclonal de camundongo)	BD Biosciences	556597	1: 500 diluição é recomendada
anti-TOP2&alfa; (monoclonal de camundongo)	Santa Cruz Biotechnology	SC-365799	1: 250 diluição é recomendada
anti-TOP2β (monoclonal de camundongo)	Santa Cruz Biotechnology	SC-25330	1: 250 diluição é recomendada
anti-ubiquitina (monoclonal de camundongo)	Santa Cruz Biotechnology	SC-8017	1: 100 diluição é recomendada
Cloreto de cálcio	Sigma-Aldrich	499609	Usado para digestão de nuclease microcócica
Camptotecina	Sigma-Aldrich	PHL89593
ChemiDo MP imaging system	Bio-Rad	12003154
Fosfato dissódico	Sigma-Aldrich	5438380100	Usado para fazer tampão de fosfato de sódio
DNAzol	Thermo Fisher	10503027
DTT (ditiotreitol)	Thermo Fisher	R0861
Meio de águia modificado de Dulbecco	Sigma-Aldrich	11965084
Álcool etílico, 200 provas	Sigma-Aldrich	E7023
Etoposídeo	Sigma-Aldrich	1268808
Formaldeído	Sigma-Aldrich	47608
Graphpad Prism Software	GraphStats	Prism 9.0.0
HRP-linked Mouse IgG	Cytiva	NA931	1: 5.000 diluição é recomendada
HRP-linked HRP-linked Rabbit IgG	Cytiva	NA934	Recomenda-se diluição de 1:5.000
ImageJ Software	NIH, EUA	ImageJ 1.53e
L-Glutamina	Fisher Scientific	25030081
Sensibilidade máxima Substrato ECL	Thermo Fisher	34095
Nuclease microcócica	New England BioLabs	M0247S
Fosfato monossódico	Sigma-Aldrich	S3139	Usado para fazer tampão de fosfato de sódio
NanoDrop 2000 espectrofotômetro	Thermo Scientific	ND-2000
N-etilmaleimida	Thermo Fisher	23030	DeSUMOilação/inibidor de desubiquitilação
Membrana de nitrocelulose, 0.45 µ m	Bio-Rad	1620115
Leite em pó desnatado	Bio-Rad	1706404XTU
PDD00017273	Selleckchem	S8862	Inibidor da poli(ADP-ribose) glicohidrolase
Penicilina-estreptomicina	Thermo Fisher	15140122
Coquetel de inibidor de protease	Thermo Fisher	78430
Q700 sonicator	Qsonica	Q700-110
Kit de transferência de PVDF pronto para montar	Bio-Rad	1704274
Aparelho de slot-blot	Bio-Rad	1706542
Papel de filtro de slot-blot	Bio-Rad	Sistema de transferência turbo 1620161
Trans-Blot	Bio-Rad	Tampão de
Tris/Glicina/SDS	Bio-Rad
Tween-20	Sigma-Aldrich	P3179
Célula de eletroforese vertical	Bio-Rad	1658004