Um fluxo de trabalho integrado para estudar a arquitetura do genoma espaço-temporal centrada no promotor em populações celulares escassas

Resumo

A expressão gênica é regulada por interações de promotores gênicos com elementos regulatórios distais. Aqui, descrevemos como a baixa entrada de Capture Hi-C (liCHi-C) permite a identificação dessas interações em tipos celulares raros, que antes eram imensuráveis.

Resumo

A transcrição espacial temporal de genes é fortemente regulada por elementos regulatórios distais, como intensificadores e silenciadores, que dependem da proximidade física com seus promotores gênicos alvo para controlar a transcrição. Embora esses elementos regulatórios sejam fáceis de identificar, seus genes-alvo são difíceis de prever, uma vez que a maioria deles é específica do tipo celular e pode ser separada por centenas de quilobases na sequência linear do genoma, pulando sobre outros genes não-alvo. Por vários anos, o Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) tem sido o padrão-ouro para a associação de elementos regulatórios distais aos seus genes-alvo. No entanto, a PCHi-C depende da disponibilidade de milhões de células, proibindo o estudo de populações celulares raras, como as comumente obtidas de tecidos primários. Para superar essa limitação, foi desenvolvido o Low input Capture Hi-C (liCHi-C), um método econômico e personalizável para identificar o repertório de elementos regulatórios distais que controlam cada gene do genoma. O liCHi-C baseia-se em uma estrutura experimental e computacional semelhante à PCHi-C, mas empregando mudanças mínimas de tubo, modificando a concentração e os volumes do reagente e trocando ou eliminando etapas, ele é responsável por uma perda mínima de material durante a construção da biblioteca. Coletivamente, o liCHi-C possibilita o estudo da regulação gênica e da organização espaço-temporal do genoma no contexto da biologia do desenvolvimento e da função celular.

Introdução

A expressão gênica temporal impulsiona a diferenciação celular e, em última instância, o desenvolvimento do organismo, e sua alteração está intimamente relacionada a uma ampla gama de doenças1,2,3,4,5. A transcrição gênica é finamente regulada pela ação de elementos regulatórios, que podem ser classificados em proximais (i.e., promotores gênicos) e distais (e.g., intensificadores ou silenciadores), estes últimos frequentemente localizados distantes de seus genes-alvo e interagindo fisicamente com eles atrav....

Protocolo

Para garantir uma perda mínima de material, (1) trabalhar com tubos e pontas de baixa ligação de ADN (ver Tabela de Materiais), (2) colocar reagentes na parede do tubo em vez de introduzir a ponta no interior da amostra e, (3) se possível, misturar a amostra por inversão em vez de pipetar a amostra para cima e para baixo, e girar para baixo depois para recuperar a amostra.

1. Fixação celular

1. Células crescendo em suspensão
   1. Colher 50.000 a um milhão de células e colocá-las em um tubo de DNA de baixa ligação de 1,5 mL.
      NOTA: Os tipos celulares utilizados para o presente estudo estão detalha....

Resultados

O liCHi-C oferece a possibilidade de gerar bibliotecas de interatoma promotor genômico de alta qualidade e resolução com apenas 50.000 células⁵³. Isso é conseguido por – além da redução drástica dos volumes de reação e do uso de plástico de baixa ligação de DNA em todo o protocolo – removendo etapas desnecessárias do protocolo original, nas quais ocorrem perdas significativas de material. Estes incluem a purificação de fenol após a desreticulação, a remoção de biotina e subsequente purificação de .......

Discussão

O liCHi-C oferece a capacidade de gerar bibliotecas de interatoma promotor de alta resolução usando uma estrutura experimental semelhante à da PCHi-C, mas com um número de células muito reduzido. Isso é muito conseguido eliminando etapas desnecessárias, como purificação de fenol e remoção de biotina. No protocolo clássico de ligadura intranúcleo Hi-C⁵⁷ e sua subsequente técnica derivada PCHi-C, a biotina é removida de fragmentos de restrição não ligados para evitar puxar para baixo fragmentos de D.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,4 mM Biotina-14-dATP	Invitrogen	19524-016
0,5 M EDTA pH 8,0	Invitrogen	AM9260G
1 M Tris pH 8,0	Invitrogen	AM9855G
10x NEBuffer 2	New England Biolabs	B7002S	Referenciado como tampão de restrição 2 no manuscrito
10x PBS	Fisher Scientific	BP3994
10x tampão de reação de DNA ligase T4	New England Biolabs	B0202S
Solução de formaldeído a 16% (p/v), sem metanol	Thermo Scientific	28908
20 mg/mL Albumina de soro bovino	New England Biolabs	B9000S
5 M NaCl	Invitrogen	AM9760G
5PRIME Phase Lock Gel Light tubes	Qiuantabio	2302820	Para purificação de fenol-clorofórmio na seção 4 (purificação de DNA). Os tubos Phase Lock Gel são um tipo comercial de tubos especialmente projetados para maximizar a recuperação de DNA após purificações de fenol-clorofórmio, evitando o transporte de contaminantes na fase orgânica, contendo uma resina de densidade intermediária que se deposita entre a fase orgânica e aquosa e os isola. Os tubos PLG devem ser girados a 12.000 x g por 30 s antes do uso para garantir que a resina esteja bem colocada na parte inferior do tubo
Adaptadores e primers PCR para amplificação de biblioteca	Tecnologias integradas	de DNA -	Compradas como primers individuais com purificação PAGE para
NGS Raspadores de células	Nunc	179693	Ou qualquer outra marca
Centrífuga (rotor de ângulo fixo para tubos de 1,5 mL)	Qualquer marca
Pacote CHiCAGO R	1.14.0
Contas CleanNGS	CleanNA	CNGS-0050
dATP, dCTP, dGTP, dTTP	Promega	U120A, U121A, U122A, U123A	Ou qualquer outra marca
de tubo DNA LoBind, 1.5 mL	Eppendorf	30108051
DNA LoBind tubo, 2 mL	Eppendorf	30108078
DNA polimerase I grande (Klenow) fragmento 5000 unidades/mL	New England Biolabs	M0210L
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads	Invitrogen	65002	Para pull-down de biotina da biblioteca pré-capturada na seção 8 (pull-down de biotina)
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beads	Invitrogen	65602	Para pull-down de biotina da biblioteca pós-capturada na seção 11 (pull-down de biotina e amplificação de PCR)
DynaMag-2	Invitrogen	12321D	Ou qualquer outro ímã adequado para tubo de 1,5 mlL
Etanol absoluto	VWR	20821.321
FBS, qualificado	Gibco	10270-106	Ou qualquer outra marca
Glycine	Fisher BioReagents	BP381-1
GlycoBlue Coprecipitante	Invitrogen	AM9515	Usado para coprecipitação de DNA na seção 4 (purificação de DNA)
HiCUP	0.8.2
HindIII, 100 U/µ L	New England Biolabs	R0104T
IGEPAL CA-630	Sigma-Aldrich	I8896-50ML
Klenow EXO- 5000 unidades/mL	New England Biolabs	M0212L
Pontas de filtro de baixa retenção ( 10 µ L, 20 µ L, 200 µ L e 1000 µ L)	ZeroTip	PMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000
M220 Ultrassônico focalizado	Covaris	500295
Micro TUBE AFA Fiber Pré-tampa de pressão pré-cortada 6 frascos de 16 mm	Covaris	520045	Para sonicação na seção 6 (sonicação)
NheI-HF, 100 U/µ L	New England Biolabs	R3131M
Nuclease livre de água de grau de biologia molecular	Sigma-Aldrich	W4502
PCR primers para controles de qualidade	Tecnologias de DNA	Integradas-Tiras
de PCR  e tampas	Agilent Technologies	410022, 401425
Fenol: Clorofórmio: Álcool Isoamílico 25:24:1, Saturado com 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA	Sigma-Aldrich	P3803
Phusion  Master Mix de PCR de alta fidelidade com tampão HF	New England Biolabs	M0531L	Para amplificação da biblioteca nas seções 9 (rejeito de dATP, ligadura do adaptador e amplificação de PCR) e 11 (pull-down de biotina e amplificação de PCR)
Coquetel de inibidor de protease (sem EDTA)	Roche	11873580001
Proteinase K, recombinante, Grau PCR	Roche	3115836001
Qubit 1x kit de alta sensibilidade dsDNA	Invitrogen	Q33230	Para quantificação de DNA após precipitação na seção 4 (purificação de DNA)
Tubos de ensaio Qubit	Invitrogen	Q32856
rCutsmart buffer	New England Biolabs	B6004S
RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAX	Gibco	61870-010	Ou qualquer outra marca
SDS - Solução 10% para biologia molecular	PanReac AppliChem	A0676
Acetato de sódio pH 5.2	Sigma-Aldrich	S7899-100ML
Biblioteca personalizada SureSelect de 3-5.9 Mb Agilent	Technologies	5190-4831	Sistema de captura de mouse ou humano personalizado, usado para a captura
Caixa de Enriquecimento de Alvo SureSelect 1	Agilent Technologies	5190-8645	Usado para o kit de enriquecimento de alvo de captura
SureSelect Adaptador completo ILM PE	Agilent Technologies	931107	Usado para a captura
T4 DNA ligase 1 U/µ L	Invitrogen	15224025	Para ligadura na seção 3 (ligação e reticulação)
T4 DNA ligase 2000000/mL	New England Biolabs	M0202T	Para ligadura na seção 9 (rejeito de dATP, ligação do adaptador e amplificação por PCR)
T4 DNA polimerase 3000 unidades/mL	New England Biolabs	M0203L
T4 PNK 10000 unidades/mL	Instrumento New England Biolabs	M0201L
Tapestation 4200	Agilent Technologies		Para eletroforese automatizada na seção 9 (rejeito dATP, ligadura do adaptador e amplificação de PCR) and seção 11 (pull-down de biotina e amplificação de PCR). Qualquer outro sistema de eletroforese automatizado é válido
Reagentes Tapestation	Agilent Technologies	5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585,	Para eletroforese automatizada na seção 9 (rejeito de dATP, ligadura do adaptador e amplificação de PCR) e seção 11 (pull-down de biotina e amplificação de PCR). Qualquer outro sistema de eletroforese automatizado é válido
Triton X-100 para biologia molecular	PanReac AppliChem	A4975
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416-50ML