Artigo de método

Um fluxo de trabalho integrado para estudar a arquitetura do genoma espaço-temporal centrada no promotor em populações celulares escassas

DOI:

10.3791/65316

⸱

21 de abril de 2023

 ,  ,  ,  , 
1Josep Carreras Leukaemia Research Institute, 2Barcelona Supercomputing Center, 3Catalan Institution for Research and Advanced Studies (ICREA), 4Institute for Health Science Research Germans Trias i Pujol

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A expressão gênica é regulada por interações de promotores gênicos com elementos regulatórios distais. Aqui, descrevemos como a baixa entrada de Capture Hi-C (liCHi-C) permite a identificação dessas interações em tipos celulares raros, que antes eram imensuráveis.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A transcrição espacial temporal de genes é fortemente regulada por elementos regulatórios distais, como intensificadores e silenciadores, que dependem da proximidade física com seus promotores gênicos alvo para controlar a transcrição. Embora esses elementos regulatórios sejam fáceis de identificar, seus genes-alvo são difíceis de prever, uma vez que a maioria deles é específica do tipo celular e pode ser separada por centenas de quilobases na sequência linear do genoma, pulando sobre outros genes não-alvo. Por vários anos, o Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) tem sido o padrão-ouro para a associação de elementos regulatórios distais aos seus genes-alvo. No entanto, a PCHi-C depende da disponibilidade de milhões de células, proibindo o estudo de populações celulares raras, como as comumente obtidas de tecidos primários. Para superar essa limitação, foi desenvolvido o Low input Capture Hi-C (liCHi-C), um método econômico e personalizável para identificar o repertório de elementos regulatórios distais que controlam cada gene do genoma. O liCHi-C baseia-se em uma estrutura experimental e computacional semelhante à PCHi-C, mas empregando mudanças mínimas de tubo, modificando a concentração e os volumes do reagente e trocando ou eliminando etapas, ele é responsável por uma perda mínima de material durante a construção da biblioteca. Coletivamente, o liCHi-C possibilita o estudo da regulação gênica e da organização espaço-temporal do genoma no contexto da biologia do desenvolvimento e da função celular.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A expressão gênica temporal impulsiona a diferenciação celular e, em última instância, o desenvolvimento do organismo, e sua alteração está intimamente relacionada a uma ampla gama de doenças1,2,3,4,5. A transcrição gênica é finamente regulada pela ação de elementos regulatórios, que podem ser classificados em proximais (i.e., promotores gênicos) e distais (e.g., intensificadores ou silenciadores), estes últimos frequentemente localizados distantes de seus genes-alvo e interagindo fisicamente com eles através de looping de cromatina para modular a expressão gênica 6,7,8.

A identificação de regiões reguladoras distais no genoma é uma questão amplamente consensual, uma vez que essas regiões abrigam modificações específicas de histonas 9,10,11 e contêm motivos específicos de reconhecimento de fatores de transcrição, atuando como plataformas de recrutamento para elas12,13,14. Além disso, no caso dos intensificadores e superpotencializadores 15,16, eles também apresentam baixa ocupação nucleossômica 17,18 e são transcritos em eRNAs não codificantes 19,20.

No entanto, os genes-alvo de cada elemento regulatório distal são mais difíceis de prever. Na maioria das vezes, as interações entre os elementos regulatórios distais e seus alvos são do tipo celular e estímulo específico 21,22, abrangem centenas de quilobases, fazendo ponte com outros genes em qualquer direção 23,24,25, podendo inclusive estar localizadas dentro de regiões intrônicas de seu gene alvo ou de outros genes não intervenientes 26,27. Além disso, elementos reguladores distais também podem controlar mais de um gene ao mesmo tempo, evice-versa28,29. Essa complexidade posicional dificulta a identificação de associações regulatórias entre eles e, portanto, a maioria dos alvos de cada elemento regulatório em cada tipo celular permanece desconhecida.

Durante os últimos anos, houve um boom significativo no desenvolvimento de técnicas de captura de conformação cromossômica (3C) para estudar interações com cromatina. O mais utilizado deles, o Hi-C, permite gerar um mapa de todas as interações entre cada fragmento do genoma de uma célula30. No entanto, para detectar interações significativas no nível de fragmento de restrição, o Hi-C depende de sequenciamento ultraprofundo, proibindo seu uso para estudar rotineiramente o cenário regulatório de genes individuais. Para superar essa limitação econômica, várias técnicas 3C baseadas em enriquecimento surgiram, como ChIA-PET31, HiChIP 32 e sua contraparte de baixa entrada HiCuT33. Essas técnicas dependem do uso de anticorpos para enriquecer interações genômicas mediadas por uma proteína específica. No entanto, a característica única dessas técnicas 3C é também a banalidade de sua aplicação; Os usuários contam com a disponibilidade de anticorpos de alta qualidade para a proteína de interesse e não podem comparar condições em que a ligação da proteína é dinâmica.

O Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) é outra técnica 3C baseada em enriquecimento que contorna essas limitações34,35. Ao empregar um sistema de enriquecimento de sonda de RNA biotinilado, o PCHi-C é capaz de gerar bibliotecas genômicas de alta resolução de regiões genômicas interagindo com 28.650 promotores de genes humanos ou 27.595 anotados em camundongos, também conhecidos como interactome promotor. Esta abordagem permite detectar interações significativas de longo alcance na resolução do nível de fragmento de restrição de promotores ativos e inativos, e comparar robustamente os interátomos promotores entre qualquer condição, independentemente da dinâmica de modificações de histonas ou ligação de proteínas. A PCHi-C tem sido amplamente utilizada nos últimos anos para identificar reorganizações interatomas promotoras durante a diferenciação celular 36,37, identificar o mecanismo de ação dos fatores de transcrição38,39 e descobrir novos potenciais genes e vias desreguladas na doença por variantes não codificantes 40,41,42,43,44,45,46,47,48, ao lado de novas mutações não codificadoras 49,50. Além disso, apenas modificando o sistema de captura, essa técnica pode ser personalizada de acordo com a questão biológica para interrogar qualquer interatoma (por exemplo, o interatoma intensificador 51 ou o interatoma de uma coleção de alterações não codificantes41,52).

No entanto, a PCHi-C depende de um mínimo de 20 milhões de células para realizar a técnica, o que impede o estudo de populações celulares escassas como as frequentemente usadas em biologia do desenvolvimento e aplicações clínicas. Por esta razão, desenvolvemos o Low input Capture Hi-C (liCHi-C), um novo método econômico e personalizável baseado na estrutura experimental do PCHi-C para gerar interatomas promotores de alta resolução com entrada de baixa célula. Realizando o experimento com trocas mínimas de tubo, trocando ou eliminando etapas do protocolo PCHi-C original, reduzindo drasticamente os volumes de reação e modificando as concentrações de reagentes, a complexidade da biblioteca é maximizada e é possível gerar bibliotecas de alta qualidade com apenas 50.000 células53.

O Low input Capture Hi-C (liCHi-C) tem sido comparado com PCHi-C e usado para elucidar a religação do interatoma promotor durante a diferenciação de células hematopoéticas humanas, descobrir potenciais novos genes e vias associadas à doença desreguladas por alterações não-codificantes e detectar anormalidades cromossômicas53. O passo-a-passo do protocolo e os diferentes controles de qualidade através da técnica são detalhados aqui até a geração final das bibliotecas e sua análise computacional.

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Protocolo

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Para garantir uma perda mínima de material, (1) trabalhar com tubos e pontas de baixa ligação de ADN (ver Tabela de Materiais), (2) colocar reagentes na parede do tubo em vez de introduzir a ponta no interior da amostra e, (3) se possível, misturar a amostra por inversão em vez de pipetar a amostra para cima e para baixo, e girar para baixo depois para recuperar a amostra.

1. Fixação celular

  1. Células crescendo em suspensão
    1. Colher 50.000 a um milhão de células e colocá-las em um tubo de DNA de baixa ligação de 1,5 mL.
      NOTA: Os tipos celulares utilizados para o presente estudo estão detalhados na seção de resultados representativos.
    2. Centrifugar as células durante 5 minutos a 600 x g (a 4 °C) utilizando uma centrífuga de rotor de ângulo fixo e remover o sobrenadante por pipetagem.
    3. Ressuspender as células em 1 mL de RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) à temperatura ambiente.
    4. Adicionar 143 μL de formaldeído a 16% sem metanol para atingir uma concentração de 2% e misturar.
    5. Incubar as células por 10 min enquanto gira à temperatura ambiente para fixar as células.
      NOTA: Tente ser o mais preciso possível com a incubação de 10 min. A fixação excessiva ou insuficiente das células pode levar a uma diminuição da qualidade da biblioteca.
    6. Atenuar a reacção adicionando 164 μL de glicina 1 M gelada e misturar. Incubar as células por 5 min, girando à temperatura ambiente.
    7. Incube ainda mais as células por 15 min no gelo, misturando por inversão a cada ~5 min.
    8. Centrifugar as células por 10 min a 1.000 x g (a 4 °C) usando uma centrífuga de rotor de ângulo fixo e remover o sobrenadante.
    9. Lave as células ressuspendendo o pellet em 1 mL de solução salina 1x tamponada com fosfato (PBS) gelada.
    10. Centrifugar as células durante 10 min a 1.000 x g (a 4 °C) e remover o sobrenadante.
      NOTA: As células peletizadas podem ser congeladas em nitrogênio líquido ou gelo seco e armazenadas a -80 °C.
  2. Células aderentes
    1. Lave as células na placa de cultura com 1x PBS.
    2. Preparar RPMI 1640 suficiente suplementado com FBS 10% e formaldeído a 2% livre de metanol à temperatura ambiente para cobrir o prato de cultura.
    3. Adicione o meio suplementado à placa de cultura com as células e incube por 10 min, balançando à temperatura ambiente para fixar as células.
      NOTA: Tente ser o mais preciso possível com a incubação de 10 min. A fixação excessiva ou insuficiente das células pode levar a uma diminuição da qualidade da biblioteca.
    4. Atenuar a reação adicionando 1 M de glicina até 0,125 M e misturar por balanço.
    5. Incubar as células por 5 min, balançando à temperatura ambiente.
    6. Incubar ainda mais as células por 15 min a 4 °C, misturando balançando a cada 3-4 min.
    7. Retire o meio e lave as células com 1x PBS frio.
    8. Raspar as células e transferi-las para um tubo de baixa ligação de DNA de 1,5 mL. Limpe a placa de cultura com 0,5-1 mL de PBS frio 1x.
    9. Centrifugar as células por 10 min a 1.000 x g (a 4 °C) usando uma centrífuga de rotor de ângulo fixo e remover o sobrenadante. As células peletizadas podem ser congeladas em nitrogênio líquido ou gelo seco e armazenadas a -80 °C.

2. Lise e digestão

  1. Ressuspender as células em 1 mL de tampão de lise a frio (Tabela 1) para romper a membrana celular. A adição do tampão por si só deve ser suficiente para ressuspender as células, mas elas podem ser ressuspensas se necessário por vórtices leves.
  2. Incubar no gelo por 30 min, misturando por inversão a cada ~5 min. Centrifugar os núcleos durante 10 min a 1.000 x g (a 4 °C) e remover o sobrenadante. Ressuspender os núcleos com 500 μL de tampão de restrição 2 a frio de 1,25x (ver Tabela de Materiais).
  3. Centrifugar os núcleos durante 10 min a 1.000 x g (a 4 °C) e remover o sobrenadante. Ressuspender os núcleos em 179 μL de 1,25x tampão de restrição 2.
  4. Adicionar 5,5 μL de dodecil sulfato de sódio a 10% (SDS; ver Tabela de Materiais) e misturar. As células podem formar aglomerados; Isso é normal e precisa ser desagregado o máximo possível por vórtice. Incubar a amostra durante 1 h a 37 °C num termobloco, agitando a 950 rpm.
  5. Temperar o SDS adicionando 37,5 μL de 10% Triton X-100 e misturar. Incubar a amostra durante 1 h a 37 °C num termobloco, agitando a 950 rpm.
  6. Digerir a cromatina adicionando 7,5 μL de HindIII (100 U/μL; ver Tabela de Materiais) e misturar. Incubar a amostra durante a noite a 37 °C num termobloco, agitando a 950 rpm.
  7. Na manhã seguinte, adicione mais 2,5 μL de HindIII (100 U/μL) e incube a amostra por 1 h a 37 °C em um termobloco, com agitação a 950 rpm para garantir a digestão adequada da cromatina.
    NOTA: Como parte dos controlos da eficiência da digestão (ver passo 5.1), transfira o equivalente a 20.000 a 40.000 núcleos para outro tubo para representar o controlo não digerido. Após a digestão, transfira o mesmo número de células para outro tubo novamente para representar o controle digerido. Recomenda-se testar a eficiência da digestão como um experimento separado se a disponibilidade do material de partida for escassa.

3. Ligadura e descrosslinking

  1. Resfriar a amostra no gelo. Preparar um mastermix e adicionar os seguintes reagentes para preencher e biotinilar as saliências do fragmento de restrição: 3 μL de 10x tampão de restrição 2, 1 μL de água livre de nuclease, 0,75 μL de 10 mM dCTP, 0,75 μL de 10 mM dTTP, 0,75 μL de 10 mM dGTP, 18,75 μL de 0,4 mM de biotina-14-dATP e 5 μL de 5 U/μL de Klenow (ver Tabela de Materiais). Incubar a amostra por 75 min a 37 °C, misturando por inversão a cada ~15 min.
  2. Resfriar a amostra no gelo. Preparar um mastermix e adicionar os seguintes reagentes para ligar as extremidades preenchidas do DNA: 50 μL de tampão de ligadura 10x, 2,5 μL de albumina de soro bovino (BSA) 20 mg/mL, 12,5 μL de DNA ligase 1 U/μL T4 e 173 μL de água livre de nucleases (ver Tabela de Materiais).
  3. Incubar a amostra durante 4-6 h a 16 °C, misturando por inversão a cada ~1 h. Além disso, incubar a amostra por 30 min à temperatura ambiente. Descruzar a cromatina adicionando 30 μL de 10 mg/mL de proteinase K e misturar. Incubar a amostra durante a noite a 65 °C.
  4. Na manhã seguinte, adicionar mais 15 μL de 10 mg/mL de proteinase K e incubar a amostra por 2 h a 65 °C para garantir a desreticulação adequada da cromatina.

4. Purificação do DNA

  1. Arrefecer a amostra à temperatura ambiente e transferi-la para um tubo adequado para a purificação do fenol-clorofórmio.
  2. Adicionar 1 volume (545 μL) de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1) para purificar o ADN e misturar agitando vigorosamente.
  3. Centrifugar a amostra durante 5 minutos a 12.000 x g à temperatura ambiente e transferir a fase aquosa superior (545 μL) para um tubo de ligação baixa de ADN de 2 ml.
  4. Adicionar os seguintes reagentes para precipitar o DNA: 1.362,5 μL de etanol 100% resfriado a -20 °C, 54,5 μL de acetato de sódio 3 M (pH 5,2) e 2 μL de glicogênio 15 mg/mL como coprecipitante.
  5. Incubar durante 1 h a -80 °C ou durante a noite a -20 °C.
  6. Centrifugar a amostra durante 30 min a 16.000-21.000 x g a 4 °C e remover o sobrenadante. A pastilha de DNA deve ser visível.
  7. Lave o pellet adicionando 1 mL de etanol a 70%, vórtice e centrifugação por 10 min a 16.000-21.000 x g à temperatura ambiente.
  8. Retire o sobrenadante e deixe o pellet secar ao ar. Ressuspender a pastilha de DNA em 130 μL de água livre de nucleases.
  9. Avaliar a concentração por quantificação fluorométrica (ver Tabela de Materiais). Conservar o material 3C purificado a -20 °C durante vários meses antes de prosseguir com o protocolo.

5. Controles de qualidade opcionais

  1. Avaliar a eficiência da digestão. Efectuar a desreticulação e a purificação do ADN fenol:clorofórmio, conforme descrito anteriormente, para os controlos não digeridos e digeridos obtidos no passo 2.13. Ressuspender a pastilha de DNA em 10 μL de água livre de nucleases. Quantificar a concentração e diluir o ADN obtido, se necessário, para 4 ng/μL.
  2. Realizar PCR quantitativo com 4 ng de DNA dos controles não digerido e digerido, com primers abrangendo um locus aberto de cromatina com e sem um alvo HindIII (veja a Tabela 2 para o design do primer). Calcular a eficiência da digestão seguindo um relatório publicado anteriormente35.
    NOTA: A eficiência da ligadura é calculada em percentagem utilizando a fórmula: digestão (%) = 100 -100/(2^[(Ct digerido com HindIII - Ctdigested sem HindIII) - (Ct não digerido com HindIII - Ct não digerido sem HindIII)]) (ver Tabela 3), que tem em conta o diferencial dos diferentes Cts obtidos para cada par de primers nos controlos não digerido e digerido.
  3. Avaliar a sensibilidade da detecção de interação realizando a reação em cadeia da polimerase (PCR) convencional (0,2 mM dNTP, 0,4 μm ambos os primers F + R, 0,1 e U/μL polimerase de início a quente), com primers abrangendo interações invariantes celulares de longo e curto alcance (consulte a Tabela 2 para o design do primer). Use 50-100 ng de material 3C (para interações de curto e longo alcance, respectivamente) e amplie usando as seguintes condições: 98 °C por 15 min, seguido por 37 ciclos de 98 °C por 30 s, 60 °C por 1 min, 72 °C por 1 min e terminar por 72 °C por 10 min. Segure a 4 °C.
    NOTA: Se a quantidade de DNA obtida for inferior a 2 μg, verifique apenas uma interação de longo e curto alcance em vez de todo o painel de interação.
  4. Executar o produto em 1x tris-borato-EDTA (TBE) usando gel de agarose a 1,6% e procurar a presença do amplicon de PCR correspondente54.
    NOTA: Devido ao imprevisível "recorte-e-colagem" do genoma, bandas inespecíficas podem aparecer. Desde que o tamanho correto da banda seja observado, ele é contado como correto.
  5. Avaliar a eficiência do preenchimento e da ligadura de biotina digerindo diferencialmente um produto de PCR de curto alcance com HindIII, NheI (ver Tabela de Materiais), ambas as enzimas ou nenhuma (água), e executando o produto em um gel de agarose 1x TBE a 1,6%. Um correto preenchimento e ligadura eliminam o alvo HindIII anterior e criam um novo alvo NheI, de modo que o amplicon deve ser cortado apenas na presença de NheI.
    NOTA: Para minimizar a perda de material, recupere 2,5 μL de um produto de PCR de curto alcance dos controles de interação e reamplie-o cinco vezes para realizar os controles de preenchimento e ligadura.

6. Sonicação

  1. Transfira os 130 μL da amostra (completar com água livre de nuclease, se alguma for usada para os controles) para uma cubeta adequada para sonicação.
  2. Configure um sonicador e sonicate em banho-maria usando os seguintes parâmetros (otimizados para o modelo e cubetas descritos na Tabela de Materiais): fator de trabalho: 20%; potência de incidência de pico: 50; ciclos por burst: 200; tempo: 65 s; e faixa de temperatura: 6-10 °C (8 °C ideal).
  3. Transfira a amostra para um novo tubo de baixa ligação de DNA de 1,5 mL.

7. Reparo final

  1. Prepare um mastermix e adicione os seguintes reagentes para reparar as extremidades irregulares dos fragmentos de DNA criados durante a sonicação: 18 μL de tampão de ligadura 10x, 18 μL de mistura de 2,5 mM dNTP cada, 6,5 μL de 3 U/μL T4 DNA polimerase, 6,5 μL de 10 U/μL T4 PNK e 1,3 μL de 5 U/μL Klenow (ver Tabela de Materiais).
  2. Incubar a amostra durante 30 min a 20 °C e completar com tampão Tris-low EDTA (TLE) (ver quadro 1) até 300 μL.

8. Biotina pull-down

  1. Transfira 150 μL de contas de estreptavidina C1 (ver Tabela de Materiais) por amostra para um tubo de 1,5 mL, coloque-as em um ímã de tubo de 1,5 mL e aguarde 2-3 min ou até que todas as contas estejam presas à parede. Retire o sobrenadante, deixando as contas para trás.
  2. Lavar as contas com 400 μL de tampão 1x Tween (TB; ver Tabela 1). Para lavar as contas, adicione o tampão e ressuspenda-as por vórtice suave. Coloque o tubo de volta no ímã e aguarde 2-3 min ou até que todas as contas estejam presas à parede. Retire o sobrenadante, deixando as contas para trás.
  3. Lavar as esferas com 300 μL de tampão 1x sem Tween (NTB; ver Tabela 1). Ressuspender as contas em 300 μL de 2x NTB (ver Tabela 1).
    NOTA: As contas podem formar uma camada empoeirada ao redor da parede do tubo ao lavar com tampões sem detergente. Isso é normal e não afeta o resultado do protocolo.
  4. Combinar estes 300 μL de contas em 2x NTB com os 300 μL da amostra. Incubar por 15 min, girando à temperatura ambiente para puxar para baixo os fragmentos informativos de DNA com biotina. A biblioteca agora está presa às contas de estreptavidina C1.
  5. Lave as contas com 400 μL de 1x NTB. Lavar as esferas com 100 μL de tampão TLE e depois ressuspendê-las em 35,7 μL de tampão TLE.

9. dATP-tailing, ligadura do adaptador e amplificação por PCR

  1. Preparar um mastermix e adicionar os seguintes reagentes à amostra para dATP-cauda das extremidades dos fragmentos de DNA reparados: 5 μL de 10x tampão de restrição 2, 2,3 μL de 10 mM dATP e 7 μL de 5 U/μL de Klenow exo-. Incubar a amostra durante 30 min a 37 °C.
  2. Inative o exo- de Klenow incubando ainda mais a amostra durante 10 min a 65 °C. Resfriar a amostra no gelo. Lave as contas com 300 μL de 1x TB. Lave as contas com 300 μL de 1x NTB.
  3. Lavar as esferas com 100 μL de tampão de ligadura 1x e depois ressuspendê-las em 50 μL de tampão de ligadura 1x. Adicionar 4 μL de mistura de adaptadores pré-recozida de 15 μM (ver quadro 2) e 1 μL de 2.000 U/μL de liga de ADN T4 (ver Tabela de Materiais) à amostra.
  4. Incubar durante 2 h à temperatura ambiente. Lave as contas com 400 μL de 1x TB. Lave as contas com 200 μL de 1x NTB. Lave as contas com 100 μl de 1x tampão de restrição 2.
  5. Lave as esferas com 50 μL de 1x tampão de restrição 2 e depois as ressuspenda em 50 μL de 1x tampão de restrição 2.
  6. Misturar os seguintes reagentes para preparar a reação de PCR para amplificar a biblioteca: 50 μL de contas com a biblioteca, 250 μL de 2x PCR mastermix com enzima, 12 μL de primers F + R (25 μM cada; ver Tabela 2) e 188 μL de água livre de nucleases.
  7. Realizar a PCR com as seguintes condições (dividir a mistura de reagentes de PCR em reações de 50 μL): 98 °C por 40 s, seguido por ciclos X de 98 °C por 10 s, 65 °C por 30 s, 72 °C por 30 s e terminar em 72 °C por 10 min. Segure a 4 °C.
    NOTA: Use o seguinte número de ciclos como ponto de partida para otimizar o protocolo em células diploides visando uma saída de 500-1.000 ng antes da captura da biblioteca: um milhão de células para oito ciclos; 250.000 células por 10 ciclos; 50.000 células por 12 ciclos.
  8. Junte todas as reações de 50 μL da mesma amostra em um tubo de baixa ligação de DNA de 1,5 mL, coloque-o em um ímã de tubo de 1,5 mL e aguarde 2-3 min ou até que todas as contas estejam presas à parede.
  9. Transferir o sobrenadante que contém a biblioteca (500 μL) para um novo tubo de baixa ligação de DNA de 1,5 mL. Completar com tampão TLE para 500 μL se algum do sobrenadante foi perdido. As contas de estreptavidina C1 não são mais necessárias.
  10. Realizar uma seleção frente e verso55 usando purificação de esferas paramagnéticas (0,4-1 volume). Isso permite a eliminação seletiva de fragmentos muito grandes (>1.000 pb) e muito pequenos ou primers de PCR (<200 pb), dependendo da concentração de polietilenoglicol e sal das esferas paramagnéticas adicionadas.
  11. Adicione 200 μL (0,4 volumes) de contas de estoque à biblioteca e misture por vórtice. Incubar durante 10 minutos, girando à temperatura ambiente.
  12. Coloque em um ímã, aguarde 2-3 min ou até que todas as contas estejam presas à parede e transfira o sobrenadante que contém a biblioteca (sem os fragmentos maiores) para um novo tubo de baixa ligação de DNA de 1,5 mL.
  13. Concentre as contas tomando 750 μL de contas de estoque, coloque-as em um tubo de 1,5 mL em um ímã, aguarde 2-3 min ou até que todas as contas estejam presas à parede, remova o sobrenadante e ressuspenda as contas por vórtice em 300 μL de novas contas de estoque.
  14. Adicione estes 300 μL de contas concentradas à amostra (1 volume) e misture por vórtice. Incubar durante 10 minutos, girando à temperatura ambiente. Coloque em um ímã, aguarde 2-3 min ou até que todas as contas estejam presas à parede e remova o sobrenadante (contendo os fragmentos menores e os primers de PCR).
  15. Lave as contas três vezes com 1 mL de etanol 70%. Para fazer isso, adicione o etanol enquanto o tubo com as contas ainda está no ímã, tentando não perturbar as contas, e aguarde 30-60 s. Depois, retire o sobrenadante sem atrapalhar as contas.
  16. Deixe as contas secarem ao ar e ressuspenda-as em 21 μL de tampão TLE por vórtice.
    OBS: A secagem excessiva das contas pode reduzir o rendimento ao eluír o DNA. Procure ressuspendê-los em tampão TLE imediatamente após eles não estarem mais "brilhantes" do etanol.
  17. Incubar a amostra durante 10 min a 37 °C num termobloco para retirar a biblioteca das contas. Coloque o tubo em um ímã e transfira o sobrenadante que contém a biblioteca para um novo tubo de baixa ligação de DNA de 1,5 mL.
  18. Quantificar o tamanho e a concentração por eletroforese automatizada (ver Tabela de Materiais). O material Hi-C purificado pode ser armazenado a -20 °C por vários meses antes de prosseguir com o protocolo.

10. Captura de bibliotecas

  1. Trabalhar com 500-1.000 ng da biblioteca. Concentrar a biblioteca secando o DNA usando um concentrador a vácuo e ressuspendendo o material em 3,4 μL de água livre de nucleases.
  2. Adicione os seguintes bloqueadores do kit de enriquecimento de destino (consulte Tabela de Materiais) à amostra: 2,5 μL de Bloqueador 1, 2,5 μL de Bloqueador 2 e 0,6 μL de oligobloqueador personalizado para os adaptadores.
  3. Ressuspender completamente, transferir a solução para uma tira de PCR de 0,2 mL e incubar em um termociclador por 5 min a 95 °C, seguido de 5 min a 65 °C com uma tampa aquecida. Deixar o tubo incubado a 65 °C.
  4. Preparar a solução de hibridização combinando os seguintes reagentes do kit de enriquecimento alvo (ver Tabela de Materiais) por amostra (13 μL). Manter no banco à temperatura ambiente: 6,63 μL de Hyb 1, 0,27 μL de Hyb 2, 2,65 μL de Hyb 3 e 3,45 μL de Hyb 4.
  5. Diluir 0,5 μL do bloco de RNase do kit de enriquecimento alvo com 1,5 μL de água livre de nuclease por amostra. Descongelar 5 μL do RNA biotinilado por amostra no gelo e adicionar a ele os 2 μL do bloco de RNase diluído. Manter no banco à temperatura ambiente.
  6. Adicionar os 13 μL da solução de hibridização aos 7 μL do RNA biotinilado com RNase e misturar bem.
  7. Enquanto estiver no termociclador a 65 °C, transfira a solução de hibridização com o RNA biotinilado (20 μL) para a biblioteca bloqueada. Feche firmemente a tampa do tubo e incube no termociclador durante a noite a 65 °C.
    NOTA: Para minimizar a evaporação da amostra (que pode levar à hibridização RNA-DNA subótima) ao realizar várias amostras ao mesmo tempo, use uma pipeta multicanal para transferir o RNA biotinilado para cada biblioteca ao mesmo tempo.

11. Pull-down de biotina e amplificação por PCR

  1. Transfira 50 μL de contas de estreptavidina T1 por amostra para um tubo de baixa ligação de DNA de 1,5 mL, coloque-as em um ímã de tubo de 1,5 mL e aguarde 2-3 min ou até que todas as contas estejam presas à parede. Retire o sobrenadante, deixando as contas para trás. Lavar as contas três vezes com 200 μL do tampão de ligação do kit de enriquecimento alvo.
  2. Ressuspenda as esferas em 200 μL de buffer de ligação. Enquanto estiver no termociclador a 65 °C, transferir a amostra para as esferas de estreptavidina T1 ressuspensas e incubar por 30 min, girando à temperatura ambiente.
  3. Lave as contas com 200 μL do tampão de lavagem 1 do kit de enriquecimento alvo. Incubar durante 15 minutos, girando à temperatura ambiente. Lavar as contas três vezes com 200 μL do tampão de lavagem 2 do kit de enriquecimento alvo aquecido a 65 °C. Incubar durante 10 min a 65 °C num termobloco, agitando a 300 rpm entre as lavagens.
  4. Lavar as esferas com 200 μL de 1x tampão de restrição 2 e depois ressuspendê-las em 30 μL de 1x tampão de restrição 2.
  5. Misturar os seguintes reagentes para preparar a reação de PCR para amplificar a biblioteca: 30 μL de contas com a biblioteca, 150 μL de 2x PCR mastermix com enzima, 7,2 μL de primers F + R (25 μM cada; ver Tabela 2) e 112,8 μL de água livre de nucleases.
  6. Realizar a PCR com as seguintes condições (dividir a mistura de reagentes de PCR em reações de 50 μL): 98 °C por 40 s, seguido por quatro ciclos de 98 °C por 10 s, 65 °C por 30 s, 72 °C por 30 s e terminar com 72 °C por 10 min. Segure a 4 °C.
  7. Junte todas as reações de 50 μL da mesma amostra em um tubo de baixa ligação de DNA de 1,5 mL, coloque-o em um ímã de tubo de 1,5 mL e aguarde 2-3 min ou até que todas as contas estejam presas à parede.
  8. Transfira o sobrenadante que contém a biblioteca (300 μL) para um novo tubo de baixa ligação de DNA de 1,5 mL. Completar com tampão TLE para 300 μL se algum sobrenadante foi perdido. As contas de estreptavidina T1 não são mais necessárias.
  9. Realizar uma purificação de DNA usando esferas paramagnéticas (0,9 volumes; ver Tabela de Materiais). Adicionar 270 μL de contas de caldo à amostra e misturar por vórtice.
  10. Incubar durante 10 minutos, girando à temperatura ambiente.
  11. Coloque em um ímã, aguarde 2-3 min ou até que todas as contas estejam presas à parede e remova o sobrenadante.
  12. Lave as contas três vezes com 1 mL de etanol 70%. Para fazer isso, adicione o etanol enquanto o tubo com as contas ainda está no ímã, tentando não perturbar as contas, e aguarde 30-60 s. Depois, retire o sobrenadante sem atrapalhar as contas.
  13. Deixe as contas secarem ao ar e ressuspenda-as em 21 μL de tampão TLE por vórtice.
    OBS: A secagem excessiva das contas pode reduzir o rendimento ao eluír o DNA. Procure ressuspendê-los em tampão TLE imediatamente após eles não estarem mais "brilhantes" do etanol.
  14. Incubar a amostra durante 10 min a 37 °C num termobloco para retirar a biblioteca das contas.
  15. Coloque o tubo em um ímã e transfira o sobrenadante que contém a biblioteca para um novo tubo de baixa ligação de DNA de 1,5 mL.
  16. Quantificar o tamanho e a concentração por eletroforese automatizada.

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Resultados

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O liCHi-C oferece a possibilidade de gerar bibliotecas de interatoma promotor genômico de alta qualidade e resolução com apenas 50.000 células53. Isso é conseguido por – além da redução drástica dos volumes de reação e do uso de plástico de baixa ligação de DNA em todo o protocolo – removendo etapas desnecessárias do protocolo original, nas quais ocorrem perdas significativas de material. Estes incluem a purificação de fenol após a desreticulação, a remoção de biotina e subsequente purificação de ...

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Discussão

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O liCHi-C oferece a capacidade de gerar bibliotecas de interatoma promotor de alta resolução usando uma estrutura experimental semelhante à da PCHi-C, mas com um número de células muito reduzido. Isso é muito conseguido eliminando etapas desnecessárias, como purificação de fenol e remoção de biotina. No protocolo clássico de ligadura intranúcleo Hi-C57 e sua subsequente técnica derivada PCHi-C, a biotina é removida de fragmentos de restrição não ligados para evitar puxar para baixo fragmentos de D...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos ao resto dos membros do laboratório Javierre por seu feedback sobre o manuscrito. Agradecemos ao Programa CERCA, à Generalitat de Catalunya e à Fundação Josep Carreras pelo apoio institucional. Este trabalho foi financiado pelo FEDER/Ministério da Ciência e Inovação da Espanha (RTI2018-094788-A-I00), pela Associação Europeia de Hematologia (4823998) e pela Associação Espanhola contra o Câncer (AECC) LABAE21981JAVI. O BMJ é financiado pelo projeto Líder Júnior da Fundação Bancária La Caixa (LCF/BQ/PI19/11690001), o LR é financiado por uma bolsa AGAUR FI (2019FI-B00017) e o LT-D é financiado por uma bolsa FPI (PRE2019-088005). Agradecemos ao programa de doutorado em bioquímica e biologia molecular da Universitat Autònoma de Barcelona pelo apoio. Nenhum dos financiadores esteve envolvido em nenhum momento do desenho experimental ou da redação do manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,4 mM Biotina-14-dATPInvitrogen19524-016
0,5 M EDTA pH 8,0InvitrogenAM9260G
1 M Tris pH 8,0InvitrogenAM9855G
10x NEBuffer 2New England BiolabsB7002SReferenciado como tampão de restrição 2 no manuscrito
10x PBSFisher ScientificBP3994
10x tampão de reação de DNA ligase T4New England BiolabsB0202S
Solução de formaldeído a 16% (p/v), sem metanolThermo Scientific28908
20 mg/mL Albumina de soro bovinoNew England BiolabsB9000S
5 M NaClInvitrogenAM9760G
5PRIME Phase Lock Gel Light tubesQiuantabio2302820Para purificação de fenol-clorofórmio na seção 4 (purificação de DNA). Os tubos Phase Lock Gel são um tipo comercial de tubos especialmente projetados para maximizar a recuperação de DNA após purificações de fenol-clorofórmio, evitando o transporte de contaminantes na fase orgânica, contendo uma resina de densidade intermediária que se deposita entre a fase orgânica e aquosa e os isola. Os tubos PLG devem ser girados a 12.000 x g por 30 s antes do uso para garantir que a resina esteja bem colocada na parte inferior do tubo
Adaptadores e primers PCR para amplificação de bibliotecaTecnologias integradasde DNA -Compradas como primers individuais com purificação PAGE para
NGS Raspadores de célulasNunc179693Ou qualquer outra marca
Centrífuga (rotor de ângulo fixo para tubos de 1,5 mL)Qualquer marca
Pacote CHiCAGO R1.14.0
Contas CleanNGSCleanNACNGS-0050
dATP, dCTP, dGTP, dTTPPromegaU120A, U121A, U122A, U123AOu qualquer outra marca
de tubo DNA LoBind, 1.5 mLEppendorf30108051
DNA LoBind tubo, 2 mLEppendorf30108078
DNA polimerase I grande (Klenow) fragmento 5000 unidades/mLNew England BiolabsM0210L
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beadsInvitrogen65002Para pull-down de biotina da biblioteca pré-capturada na seção 8 (pull-down de biotina)
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beadsInvitrogen65602Para pull-down de biotina da biblioteca pós-capturada na seção 11 (pull-down de biotina e amplificação de PCR)
DynaMag-2Invitrogen12321DOu qualquer outro ímã adequado para tubo de 1,5 mlL
Etanol absolutoVWR20821.321
FBS, qualificadoGibco10270-106Ou qualquer outra marca
GlycineFisher BioReagentsBP381-1
GlycoBlue CoprecipitanteInvitrogenAM9515Usado para coprecipitação de DNA na seção 4 (purificação de DNA)
HiCUP0.8.2
HindIII, 100 U/µ LNew England BiolabsR0104T
IGEPAL CA-630Sigma-AldrichI8896-50ML
Klenow EXO- 5000 unidades/mLNew England BiolabsM0212L
Pontas de filtro de baixa retenção ( 10 µ L, 20 µ L, 200 µ L e 1000 µ L)ZeroTipPMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000
M220 Ultrassônico focalizadoCovaris500295
Micro TUBE AFA Fiber Pré-tampa de pressão pré-cortada 6 frascos de 16 mmCovaris520045Para sonicação na seção 6 (sonicação)
NheI-HF, 100 U/µ LNew England BiolabsR3131M
Nuclease livre de água de grau de biologia molecularSigma-AldrichW4502
PCR primers para controles de qualidadeTecnologias de DNAIntegradas-Tiras
de PCR  e tampasAgilent Technologies410022, 401425
Fenol: Clorofórmio: Álcool Isoamílico 25:24:1, Saturado com 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTASigma-AldrichP3803
Phusion  Master Mix de PCR de alta fidelidade com tampão HFNew England BiolabsM0531LPara amplificação da biblioteca nas seções 9 (rejeito de dATP, ligadura do adaptador e amplificação de PCR)
e 11 (pull-down de biotina e amplificação de PCR)
Coquetel de inibidor de protease (sem EDTA)Roche11873580001
Proteinase K, recombinante, Grau PCRRoche3115836001
Qubit 1x kit de alta sensibilidade dsDNAInvitrogenQ33230Para quantificação de DNA após precipitação na seção 4 (purificação de DNA)
Tubos de ensaio QubitInvitrogenQ32856
rCutsmart bufferNew England BiolabsB6004S
RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAXGibco61870-010Ou qualquer outra marca
SDS - Solução 10% para biologia molecularPanReac AppliChemA0676
Acetato de sódio pH 5.2Sigma-AldrichS7899-100ML
Biblioteca personalizada SureSelect de 3-5.9 Mb AgilentTechnologies5190-4831Sistema de captura de mouse ou humano personalizado, usado para a captura
Caixa de Enriquecimento de Alvo SureSelect 1Agilent Technologies5190-8645Usado para o kit de enriquecimento de alvo de captura
SureSelect Adaptador completo ILM PEAgilent Technologies931107Usado para a captura
T4 DNA ligase 1 U/µ LInvitrogen15224025Para ligadura na seção 3 (ligação e reticulação)
T4 DNA ligase 2000000/mLNew England BiolabsM0202TPara ligadura na seção 9 (rejeito de dATP, ligação do adaptador e amplificação por PCR)
T4 DNA polimerase 3000 unidades/mLNew England BiolabsM0203L
T4 PNK 10000 unidades/mLInstrumento New England BiolabsM0201L
Tapestation 4200Agilent TechnologiesPara eletroforese automatizada na seção 9 (rejeito dATP, ligadura do adaptador e amplificação de PCR) and
seção 11 (pull-down de biotina e amplificação de PCR). Qualquer outro sistema de eletroforese automatizado é válido
Reagentes TapestationAgilent Technologies5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585,Para eletroforese automatizada na seção 9 (rejeito de dATP, ligadura do adaptador e amplificação de PCR) e
seção 11 (pull-down de biotina e amplificação de PCR). Qualquer outro sistema de eletroforese automatizado é válido
Triton X-100 para biologia molecularPanReac AppliChemA4975
Tween 20Sigma-AldrichP9416-50ML

Referências

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