Method Article

Avaliação do impacto de um novo sistema de processador de células de resfriamento na instalação de isolamento de células de ilhotas

DOI:

10.3791/65321

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August 11th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Qatar Metabolic Institute, Hamad Medical Corporation, 2Univ-Lille, Inserm, CHU Lille, Institute Pasteur Lille, U1190 - EGID F-59000 Lille, 3Department of Nephrology, Leiden University Medical Center (LUMC)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O protocolo aqui descreve um sistema de processador de célula de resfriamento personalizado que é compatível com uma sala limpa de boas práticas de fabricação (GMP) para melhorar a viabilidade da célula pós-processamento.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O equipamento de terapia celular padrão, incluindo o processador de células padrão-ouro para purificar ilhotas humanas para transplante clínico, raramente é refrigerado, potencialmente expondo as células a temperaturas elevadas durante a etapa de centrifugação. Os sistemas de resfriamento personalizados têm um benefício direto na viabilidade e função das ilhotas humanas. O estudo atual foi projetado para testar a eficácia de um sistema de processador de célula resfriado recém-desenvolvido e prontamente disponível que requer modificações mínimas e para avaliar seu impacto na viabilidade da célula humana e no ambiente de sala limpa GMP. O sistema de resfriamento, um trocador de calor refrigerado mecanicamente ajustado a -30 ° C, foi usado para fornecer ar seco de grau médico resfriado ao recipiente do processador de células através de um orifício perfurado na tampa da centrífuga. Com a disponibilidade limitada de doadores de pâncreas no Catar, a validação do sistema foi feita com purificação contínua por gradiente de densidade do revestimento buffy da medula óssea humana. Esterilidade, turbulência e contagem de partículas foram medidas em ambientes de sala limpa classe C e classe B. Nenhuma turbulência se desenvolveu em torno do processador de célula resfriada e nenhum excesso de partículas transportadas pelo ar de 0,5 μm e 5 μm foi gerado de acordo com os padrões GMP de sala limpa. No início e no final das etapas de coleta, a temperatura subiu respectivamente para 21,50 °C ± 0,34 °C e 21,93 °C ± 0,20 °C no processador de célula não refrigerada e para apenas 10,9 °C ± 0,17 °C e 11,16 °C ± 0,35 °C no processador de célula resfriada (p <0,05). O processador de células resfriadas levou a uma melhor recuperação (98%) da fração de células mononucleares e viabilidade (100% ± 2%) pós-processamento. O novo sistema de resfriamento reduz efetivamente o calor produzido pelo processador da célula, sem ter impacto de partículas no ambiente da sala limpa GMP. O processador de célula resfriada descrito aqui é um método barato (US$ 16.000 sem incluir impostos, desembaraço aduaneiro e transporte) e minimamente invasivo para fornecer resfriamento robusto. Atualmente, essa tecnologia na instalação de terapia celular GMP está sendo aplicada ao isolamento e transplante de células de ilhotas humanas para o programa clínico.

Introduction

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O transplante de ilhotas para diabetes tipo 1 grave pode restaurar a secreção endógena de insulina e se tornou o padrão de tratamento em vários países1. O isolamento das ilhotas é um procedimento de várias etapas que inclui a digestão enzimática e mecânica quente do pâncreas, seguida de fases resfriadas para recuperação do tecido digerido e purificação das ilhotas com gradientes de densidade contínuos ou descontínuos em um processador celular. O resfriamento rápido retarda a fase de digestão enzimática e protege as ilhotas das enzimas digestivas liberadas pela contaminação das células acinares. O processador de células foi originalmente projetado para separar os componentes do sangue celular à temperatura ambiente2. Foi reaproveitado para purificar ilhotas pancreáticas humanas de Langerhans em 19893. Por três décadas, as ilhotas humanas foram purificadas para ensaios clínicos e, mais recentemente, padrão de atendimento, seja em um processador de células com gradientes descontínuos4 ou gradientes de densidade contínuos1 feito com um gradiente maker1 ou misturador operado por computador equivalente5,6,7. Outros grupos relataram purificação de ilhotas de grandes mamíferos e humanos usando grandes garrafas plásticas cilíndricas8,7,9, o que melhorou substancialmente a eficácia da purificação e a qualidade das ilhotas.

De fato, considerando o padrão-ouro para purificar ilhotas humanas para transplante clínico10,11, o processador de células fabricado estava sem refrigeração. Como consequência direta da falta de refrigeração, as ilhotas foram expostas a temperaturas crescentes durante a etapa de purificação. Durante a centrifugação, ocorre um aumento descontrolado da temperatura devido ao atrito mecânico do rotor12,13. Os processadores celulares foram adaptados com um sistema de resfriamento em centros de isolamento de ilhotas que aumentou estatisticamente a secreção de insulina induzida por glicose e a viabilidade celular, confirmando a vantagem de manter ilhotas pancreáticas em baixas temperaturas durante o procedimento de purificação14,15.

Deve-se notar que, no final da década de 1980, 10 protótipos refrigerados foram construídos para reduzir os danos às ilhotas durante a purificação do gradiente de densidade, mas não receberam mais atenção. Os protótipos do processador de células foram baseados no resfriamento do fuso e da tigela com polietilenoglicol resfriado. Em particular, as soluções de purificação de ilhotas, incluindo soluções de preservação de órgãos e gradientes de densidade de polissacarídeos, podem ser deletérias para a viabilidade das ilhotas quando usadas à temperatura ambiente ou acima dela16,17,18. Uma comparação de diferentes estratégias de resfriamento do processador de células para purificação de células de ilhotas versus o processador de células não refrigeradas original foi avaliada para combater o aumento descontrolado de temperatura que ocorre devido ao atrito do rotor. Várias tentativas foram feitas para resfriar o processador celular durante a purificação das ilhotas humanas. O processador de células pode ser alojado temporária ou permanentemente em uma câmara fria especialmente projetada para manter uma temperatura de 0-8 °C19 durante a centrifugação gradiente que é atualmente usada nos centros de isolamento de ilhotas da Universidade de Illinois Chicago19, University of Miami14, instalações da Universidade de Oxford15e a Universidade de São Francisco (a unidade de resfriamento personalizada envolve o processador da célula). Outra modificação inclui o resfriamento do núcleo do fuso do processador de células com um sistema de resfriamento usando resfriamento de nitrogênio líquido controlado eletronicamente em Genebra, Suécia e República Tcheca15,19. Outra alternativa em meados de 2000 foi o resfriamento do núcleo do processador da célula com uma unidade de ar condicionado12 ou por resfriamento líquido do eixo na Universidade de Lille.

As modificações de resfriamento do processador de célula não estão prontamente disponíveis e apresentam riscos (umidade, acúmulo de condensação) dentro de ambientes de sala limpa GMP, incluindo perda de garantia e recusa do construtor em fazer a manutenção da máquina. Consequentemente, alguns centros de ilhotas, incluindo Milão, Itália, Oslo, Noruega e Edimburgo, Escócia, não usam um sistema de resfriamento para processadores de células durante o processo de purificação das ilhotas15.

O estudo atual foi projetado para testar a eficácia de um cooler recém-desenvolvido e prontamente disponível em conjunto com um sistema de processador de célula minimamente modificado. Resumidamente, o resfriador à base de ar descrito aqui é um trocador de calor refrigerado mecanicamente que controla a temperatura de 1 pé cúbico padrão por minuto (SCFM) de gás seco entre -40 °C a -100 °C. Este sistema de resfriamento requer um suprimento de ar medicinal seco. O ar fluirá através da linha e do trocador de calor e sairá pelo bico (7.9 mm). Um aquecedor localizado dentro do bico fornece calor para controlar a temperatura do fluxo de ar. Uma tampa de centrífuga de plástico sólido sobressalente foi comprada e modificações mínimas foram feitas. Um orifício de 13,3 mm de diâmetro foi perfurado na tampa e o ar resfriado foi fornecido do bico do resfriador para o processador da célula através do orifício na tampa da centrífuga. O ar medicinal resfriado foi injetado dentro do recipiente de centrifugação do processador de células com controle constante da temperatura dos líquidos ou gradientes de densidade.

Avaliamos o desempenho técnico do processador de célula resfriada e o impacto do elemento de resfriamento no ambiente de sala limpa GMP. O foco principal era atingir uma temperatura robustamente baixa (<10 ° C) durante a purificação das ilhotas humanas para preservar a viabilidade. Usando uma separação de densidade de revestimento leucocitário como um proxy para o isolamento das ilhotas, determinamos a eficácia desse protocolo de resfriamento na viabilidade celular.

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Protocol

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Este protocolo utilizou sangue total descartado impróprio para uso de acordo com as diretrizes de descarte da instituição. A aprovação do IRB e o consentimento informado não são aplicáveis.

1. Configuração do processador de célula resfriada

NOTA: Todos os procedimentos devem ser feitos em um ambiente de sala limpa e a equipe deve respeitar os procedimentos de vestimenta de sala limpa.

  1. Compra de equipamentos
    1. Compre uma tampa de acrílico sobressalente. Adquira o sistema de equipamento de refrigeração, refrigerador com controlador de temperatura de fluxo de gás refrigerado mecanicamente, secador de ar, regulador de pressão e fluxo e a garantia (opcional). Consulte Tabela de Materiais para referências.
      NOTA: O custo total é de $ 16.133 sem taxas de envio ou alfandegárias.
    2. Encomende ar seco medicinal, um gás medicinal comprimido que esteja em conformidade com o grau padrão (referência 1238 da farmacopeia europeia) do fornecedor local de gases medicinais. Adquira 2 cilindros de 6,8 m3 (47 L: 23 cm x 153 cm; diâmetro x comprimento).
  2. Configuração do equipamento (Figura 1 e Figura 2)
    1. Insira o equipamento na sala limpa GMP (desinfete antes de entrar na sala limpa de acordo com os procedimentos GMP.
    2. Para o ar comprimido de grau médico, instale uma linha de gás em vez de colocar o cilindro de gás diretamente na sala limpa.
  3. Modificação do processador de célula para resfriamento
    1. Primeiro, remova a tampa de acrílico. Guarde a tampa original de plexiglass caso haja algum problema com a garantia. Faça um furo na tampa sobressalente do processador de células com um diâmetro correspondente e encaixe o diâmetro externo da ponta do bico do dispositivo de resfriamento para evitar rachaduras na tampa da centrífuga (recomenda-se 13.3 mm).
    2. Fixe os suportes com um pedaço circular de espuma. Isso é feito para evitar quebra e/ou arranhões na tampa, para manter o bico do resfriador no lugar acima do processador da célula, para proteger a tampa contra dobras excessivas devido à alta pressão do ar injetado, para suportar o peso do bico e, por último, para garantir a máxima segurança ao operador para ter acesso livre e seguro a todas as funções necessárias do processador da célula durante o procedimento experimental.
    3. Conecte o sistema de resfriamento ao processador da célula conectando o bico de resfriamento ao orifício do plexiglass. Prenda-o com suportes e almofadas de espuma.
    4. Coloque a caixa de refrigeração a até 8 m (2.44 pés) de distância do bico. Aloje o controlador de temperatura em um gabinete separado e coloque-o a 6 pés (1.83 m) da caixa de refrigeração.
    5. Defina o ponto de ajuste do resfriador em -40 °C para resfriar o fluxo de ar no resfriador. A temperatura do ar de saída é continuamente indicada no indicador digital com uma resolução de 0,1 °C. Defina a temperatura de saída digitalmente para 0,1 °C com o controlador de temperatura.
    6. Controle a pressão e a vazão do suprimento de ar no módulo regulador de pressão e vazão (Figura 2) antes de alimentar o resfriador. Defina-os para taxas de fluxo de 55 psi e 4 SCFM, respectivamente, para atingir as condições ideais em um fluxo de ar resfriado a -30 °C ± 2 °C.
    7. Verifique se o suprimento de gás medicinal é regulado a uma pressão de saída de 5 bar e pode durar pelo menos 90 min, pois isso é necessário para que o ar comprimido atinja -30 °C.
      NOTA: O ar seco medicinal é gás medicinal comprimido e o ar seco totalmente pressurizado está em conformidade com o grau padrão.
    8. Forneça 5 bar de um bico mais frio conectado à tampa do processador da célula através de um orifício perfurado na tampa da centrífuga. Injete o ar medicinal resfriado dentro do recipiente de centrifugação do processador de células (Figura 2). Selecione a posição da injeção de ar de forma que o ar resfriado seja direcionado perpendicularmente ao aro de alumínio do rotor da centrífuga.
    9. Ao preparar o processador de células, certifique-se de que o rotor esteja em temperatura ambiente (18 °C). Ajuste o termorregulador automático do sistema de refrigeração para -30 °C e direcione as injeções de ar frio para o rotor.
      NOTA: Diferentes condições de teste foram testadas para atingir um gradiente de temperatura ideal de +4 °C, o que é necessário para superar a resistência térmica do sistema separador de células do processador de células e o aquecimento do rotor durante a centrifugação. O termorregulador programado manterá a temperatura ideal dentro da máquina de processamento de células durante o procedimento, particularmente durante a centrifugação, a uma temperatura ambiente limpa de +18 °C.
      1. Configure o processador celular com a primeira fase de pré-resfriamento para resfriar o processador (sem o kit do processador celular) a +3 °C por 30 a 45 minutos, e a segunda fase de pré-resfriamento da operação do processador celular deve ser com o kit pré-resfriado a +4 °C a 134 x g, por 5 min.

2. Contagem de partículas em suspensão no ar

  1. Avalie a conformidade do dispositivo de resfriamento com o ambiente de sala limpa GMP de acordo com a norma ISO 14644-1 para avaliar o impacto dos dispositivos de calor durante a fase de operação.
  2. Use o monitoramento da contagem de partículas para fornecer evidências de que o nível necessário de limpeza é alcançado em pontos críticos de controle em repouso e em operação.
    1. O número mínimo de locais de amostragem depende da área medida. Calcule isso usando a equação
      figure-protocol-1
      em que A é a área da sala limpa ou do espaço controlado por ar limpo em m2 e NL é o número de locais de amostragem arredondado para um número inteiro.
    2. O volume de amostragem no ar é o volume mínimo em cada local. Certifique-se de que o volume de ar seja grande o suficiente para contar 20 partículas do maior tamanho de partícula especificado. Calcular o volume de amostragem no ar através da equação
      V= 20/C x 1000
      em que V é o volume mínimo de amostra individual por localização, expresso em L, e C é o limite da classe (número de partículas/m3).
    3. Para cada local, dependendo da área, use uma ou mais amostras. Certifique-se de que o menor volume amostrado em cada local seja de 2 L e o tempo mínimo de amostragem seja de pelo menos 1 min.
  3. Antes da amostragem, purgue o dispositivo contador de partículas com um filtro de purga. Remova o filtro e coloque-o com a sonda isocinética para amostragem.
  4. Coloque o instrumento contador de partículas no local de amostragem identificado. Inicie a coleta de amostras na tela principal do dispositivo contador de partículas.
  5. Quando a amostragem terminar, leve o dispositivo contador de partículas para o próximo local. Quando todos os locais para amostragem estiverem concluídos, revise os dados e imprima um relatório.
  6. Quando a concentração média de partículas para todos os pontos de amostragem na área cair abaixo do limite de classe indicado na Tabela 1, considere o espaço passado para ter a concentração de partículas permitida.

3. Preparação de gradiente e processamento de separação celular

  1. Antes da experimentação, pré-arrefecer os gradientes de densidade leve e pesado e os kits de processador de células durante a noite a +4 °C num frigorífico.
  2. Pré-resfrie o processador de célula por 45 minutos em repouso (ou seja, ligue o processador de célula antes de usar). Mantenha a temperatura entre +2 °C e +5 °C. Insira o kit do processador de células pré-resfriado a +4 °C.
  3. Para o fabricante de gradiente de camisa dupla refrigerado a etanol padrão (opcional; Figura 3) Conecte as 2 câmaras de vidro e coloque-as em um agitador magnético. Prenda a tubulação entre as 2 câmaras. Resfrie o gradiente com um resfriador de resfriamento com circulação de etanol a 0 °C.
  4. Primeiro, prepare-se para carregar a camada pesada no fundo do saco, enchendo a câmara com 130 mL de gradiente de densidade pesada (HD; 1,087 g/mL). Carregue a uma velocidade de bomba de 150 mL/min.
  5. Uma vez que o gradiente pesado esteja no saco, adicione 130 mL de gradiente de alta densidade (HD) ao béquer frontal e 140 mL de gradientes de baixa densidade (LD; 1,063 g/mL) na parte de trás (grampo fechado).
  6. Desclampeie o hemostato/clamp entre as 2 câmaras e crie um gradiente contínuo na velocidade da bomba de 50 mL/min.
  7. Prepare com antecedência as células do revestimento leucocitário mononuclear humano para purificação de vários revestimentos leucocitários anônimos coletados de resíduos de sangue total (40 mL a 60 mL de sangue total foram adicionados a 10 sacos de casacos leucocitários), dependendo da disponibilidade do banco de sangue.
    1. Separação MNC
      1. Use centrifugação de gradiente de densidade para isolamento de células mononucleares humanas de baixa densidade. Para fazer isso, siga as etapas descritas abaixo.
      2. Para a preparação celular, calcule o volume de sangue (sangue total anticoagulado ou leucemia suspensa). Dilua o sangue com solução tampão 2x-4x misturando a inversão. Quanto mais diluído o sangue, melhor a pureza das células mononucleares.
      3. Prepare o tampão misturando tampão fosfato com um anticoagulante. Calcule o número de tubos necessários dividindo o volume de sangue por 35 mL e despeje 15 mL de solução de gradiente de densidade 1,073 em cada tubo.
      4. Gradualmente, coloque 35 mL da suspensão de sangue diluída sobre o gradiente de densidade, correndo suavemente na superfície do gradiente de densidade usando uma seringa de 60 mL conectada a uma agulha; para pequenos volumes, use uma pipeta. Tente não interromper a interface, pois isso resultará em uma camada mononuclear ruim.
      5. Centrifugar a 400 x g durante 20 min a 20 °C sem interrupções (aceleração 0, desaceleração 0). Após a centrifugação, colha suavemente a camada de interface das células mononucleares usando uma pipeta de transferência estéril. Transfira as células para outro novo tubo cônico de 50 mL.
      6. Lave as células 2x com tampão (PBS com adição de anticoagulante). Para a primeira lavagem, encha o tubo que contém as células com tampão até 50 mL. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 20 °C até às células em pellets (aceleração 9, desaceleração 0). Remova cuidadosamente todo o sobrenadante.
      7. Realize a segunda lavagem para a remoção de plaquetas. Ressuspenda o pellet a um volume de 50 mL com tampão. Centrifugar a 200-300 x g durante 10 min a 20 °C (aceleração 9, desaceleração 0).
      8. Reconstituir as células para um volume final de 5 mL, essas células devem ter gravidade específica semelhante ao MNC de baixa densidade <1,073. Meça a densidade específica do gradiente com um densiômetro.
      9. Ressuspenda o pellet até um volume final de 100 mL com 95 mL de meio gradiente de alta densidade (1,083 g / mL) em um saco de transferência. Use este produto para purificação usando um separador de células. O volume final de 100 mL contém células e 1.083 meio gradiente de alta densidade.
        NOTA: O buffy coat pode ser armazenado na geladeira durante a noite em PBS contendo 0,5% de BSA ou plasma autólogo. O casaco buffy também pode ser lavado.
  8. Carregue os gradientes pré-formados com um máximo de 30 mL de MNC isolado do revestimento leucocitário suspenso em 100 mL de meio de conservação concentrado usando uma bomba peristáltica a 25 mL / min. Mantenha o gradiente em +4 ° C.
  9. Meça continuamente a temperatura dentro do processador da célula com uma sonda termo-calibrada. Usando um termopar digital conectado a uma sonda termoestéril, monitore a temperatura dos gradientes e células durante o processo.

4. Otimização de diferentes etapas de carregamento de gradiente

  1. Insira o kit do processador de células pré-resfriado a +4 °C. Carregue o gradiente pesado (130 mL) a + 4.5 °C. No final do carregamento de gradiente, coloque a centrífuga em uma velocidade relativamente baixa (537 x g) para minimizar o calor gerado pelo rotor.
  2. Desligue o processador da célula para permitir que o sistema hidráulico volte aos níveis anteriores e libere ar.
  3. Reinicie o processador da célula a 537 x g e adicione os gradientes de densidade pesado (130 mL) e baixo (140 mL) para criar um gradiente de densidade contínuo a +4.3 °C e uma taxa de fluxo de 50 mL/min.
  4. Carregue o revestimento buffy (30 mL) com 100 mL de meio de armazenamento refrigerado a +6 °C e uma taxa de fluxo de 25 mL / min. Adicione 50 mL (25 mL x 2) de solução de lavagem.
  5. Após 5 min a +5 °C, colete o gradiente girado em 12 garrafas a uma taxa de fluxo de 100 mL/min.
  6. Encha os tubos com meios de lavagem (M199 + 20% de albumina humana + 10% de estreptomicina de penicilina). Encha o tubo 1 com 100 mL de meio de lavagem e 150 mL de células e os tubos 2-12 com 225 mL de meio de lavagem e 25 mL de células.

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Results

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O impacto do processador de célula resfriada na sala limpa GMP foi quantificado pela primeira vez. Os métodos padronizados usaram um contador de partículas que mede a contaminação por partículas transportadas pelo ar em um ambiente de sala limpa classe C e classe B GMP em pontos críticos próximos ao processador da célula e ao sistema de resfriamento de ar pressurizado. Os resultados demonstraram que nenhuma turbulência se desenvolveu ao redor do equipamento. Os dados registrados mostraram que não havia excesso de partícu...

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Discussion

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As instalações de isolamento de ilhotas em todo o mundo adotaram por décadas a purificação humana de ilhotas em um processador de células reaproveitado. Embora algumas instalações de produção de ilhotas continuem a processar ilhotas em um processador de células não refrigerado, a maioria dos centros usa uma versão refrigerada do processador de células 10,11,15. Os centros colocam o processador de células em uma câmara fria que t...

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Disclosures

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Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores gostariam de agradecer ao Instituto Europeu de Genômica para Diabetes (ANR-10- LABEX-0046 a FP) e ao Instituto Metabólico do Catar - Hamad Medical Corporation, Catar. Os autores também agradecem ao Centro de Pesquisa Médica da Hamad Medical Corporation pelo suporte às taxas de processamento de artigos.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
EquipamentoContador de partículas de
arLasair III 
AirJet XR40Sistema FTS da SP ScientificXR40
Gabinete de BiossegurançaThermo ScientificEQ-1301
Chiller de Resfriamento CirculanteJulaboCF30
COBE 2991 Terumo BCT
BiorepCCT-01
Fabricante de gradiente duplo revestido personalizado em casa
KJT-Termômetro de TermoparHanna InstrumentsHI93551NPara medir a temperatura de líquidos
Agitador magnético Bombaperistáltica Thermo Scientific 88880014
Termômetro MasterFlexMK-77921-79
Extech InstrumentsRMS 430Para Banho
Contas Sem ÁguaCole-Parmer10122-00
Materiais e reagentes
BD kit de enumeração de células-troncoBD Biosciences 
Kit de tubulação COBE 2911Terumo BCT90819
Tubos cônicos 250mlCorning430776
Densidade gradiente 1.1Biochrom L6155
Garrafas descartáveis graduadasThermo fisher382019-1000
Albumina humana 20% Kedrion Biopharma8091600
M199 solução de lavagem Corning 99-784-CM 
Tubos MasterflexMasterflex96400-6
Medical Dry AirLinde HealthcareMedi On 22
Pencillin-estreptomicina Gibco 
ThermoprobeBiorepTC-02Thermosensor
Trypan blue Sigma Aldrich15250061
Universidade de Wisconsin Belzer (UW) Ponte da Vida RM/N 4055Meio de Conservação
Bandeja de Resfriamento Cônica de de Temperatura COBE 34456315140122

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. The New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
  2. Vesilind, G. W., Simpson, M. B., Colman, R. E., Kao, K. J. Evaluation of a centrifugal blood cell processor for washing platelet concentrates. Transfusion. 28 (1), 46-51 (1988).
  3. Lake, S. P., et al. Large-scale purification of human islets utilizing discontinuous albumin gradient on IBM 2991 cell separator. Diabetes. 38, 143-145 (1989).
  4. Ricordi, C., et al. Human islet isolation and allotransplantation in 22 consecutive cases. Transplantation. 53 (2), 407-414 (1992).
  5. Friberg, A. S., Stahle, M., Brandhorst, H., Korsgren, O., Brandhorst, D. Human islet separation utilizing a closed automated purification system. Cell transplantation. 17 (12), 1305-1313 (2008).
  6. Bampton, T. J., et al. Australian experience with total pancreatectomy with islet autotransplantation to treat chronic pancreatitis. ANZ Journal of Surgery. 91 (12), 2663-2668 (2021).
  7. Doppenberg, J. B., Engelse, M., de Koning, E. J. P. PRISM: A Novel Human Islet Isolation Technique. Transplantation. 106 (6), 1271-1278 (2021).
  8. Shimoda, M., et al. Islet purification method using large bottles effectively achieves high islet yield from pig pancreas. Cell Transplantation. 21 (2-3), 501-508 (2012).
  9. Noguchi, H. Pancreatic Islet Purification from Large Mammals and Humans Using a COBE 2991 Cell Processor versus Large Plastic Bottles. Journal of Clinical Medicine. 10 (1), 10(2021).
  10. Shapiro, A. M., et al. International trial of the Edmonton protocol for islet transplantation. The New England Journal of Medicine. 355 (13), 1318-1330 (2006).
  11. Ricordi, C. National Institutes of Health-Sponsored Clinical Islet Transplantation Consortium Phase 3 Trial: Manufacture of a Complex Cellular Product at Eight Processing Facilities. Diabetes. 65 (11), 3418-3428 (2016).
  12. Swift, S., Kin, T., Mirbolooki, M., Wilson, R., Lakey, J. R. T. Comparison of cooling systems during islet purification. Cell Transplantation. 15 (2), 175-180 (2006).
  13. Rilo, H. L. R., et al. Comparison of islet number and viability obtained during purification on Euro-Collins-Ficoll gradients processed on a refrigerated or nonrefrigerated COBE 2991 cell separator. Transplantation Proceedings. 26 (6), 3430(1994).
  14. Chadwick, D. R., et al. Pancreatic islet purification using bovine serum albumin: The importance of density gradient temperature and osmolality. Cell Transplantation. 2 (4), 355(1993).
  15. Nano, R., et al. Heterogeneity of human pancreatic islet isolation around Europe: results of a survey study. Transplantation. 104 (1), 190-196 (2020).
  16. Chadwick, D. R., et al. Storage of pancreatic digest before islet purification. Transplantation. 58 (1), 99-104 (1994).
  17. Amrani, M., et al. Detrimental effects of temperature on the efficacy of the University of Wisconsin solution when used for cardioplegia at moderate hypothermia. Comparison with the St. Thomas Hospital solution at 4 degrees C and 20 degrees C. Circulation. 86, 280-288 (1992).
  18. Fremes, S. E., Li, R. K., Weisel, R. D., Mickle, D. A., Tumiati, L. C. Prolonged hypothermic cardiac storage with University of Wisconsin solution. An assessment with human cell cultures. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 102 (5), 666-672 (1991).
  19. Adewola, A., et al. Comparing cooling systems for the COBE 2991 cell separator used in the purification of human pancreatic islets of Langerhans. Cryo Letters. 31 (4), 310-317 (2010).
  20. Keymeulen, B., et al. Implantation of standardized beta-cell grafts in a liver segment of IDDM patients: graft and recipients characteristics in two cases of insulin-independence under maintenance immunosuppression for prior kidney graft. Diabetologia. 41 (4), 452-459 (1998).
  21. de Kort, H., de Koning, E. J., Rabelink, T. J., Bruijn, J. A., Bajema, I. M. Islet transplantation in type 1 diabetes. BMJ. 342, (2011).
  22. Barbaro, B., et al. Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient. Transplantation. 84 (9), 1200-1203 (2007).
  23. Lemarie, C., et al. A new single-platform method for the enumeration of CD34+ cells. Cytotherapy. 11 (6), 804-806 (2009).

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