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Artigo de método

Isolamento de Núcleos de Células Progenitoras Cardíacas de Camundongos para Perfil de Epigenoma e Expressão Gênica em Resolução Unicelular

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DOI:

10.3791/65328

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12 de maio de 2023

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1Center for Cardiovascular Disease & Nutrition, U1263, Aix-Marseille University, 2Marseille Medical Genetics, U1251, Aix-Marseille University

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo descrevendo a preparação de núcleos celulares. Após microdissecção e dissociação enzimática do tecido cardíaco em células únicas, as células progenitoras foram congeladas, seguidas pelo isolamento de células viáveis puras, que foram usadas para sequenciamento de RNA de núcleo único e o ensaio de núcleo único para cromatina acessível à transposase com análises de sequenciamento de alto rendimento.

Resumo

O coração em desenvolvimento é uma estrutura complexa contendo várias células progenitoras controladas por mecanismos regulatórios complexos. O exame da expressão gênica e do estado da cromatina de células individuais permite a identificação do tipo e estado celular. Abordagens de sequenciamento unicelular têm revelado uma série de características importantes da heterogeneidade de células progenitoras cardíacas. No entanto, esses métodos são geralmente restritos ao tecido fresco, o que limita estudos com diversas condições experimentais, pois o tecido fresco deve ser processado de uma só vez no mesmo período para reduzir a variabilidade técnica. Portanto, procedimentos fáceis e flexíveis para produzir dados de métodos como o sequenciamento de RNA de núcleo único (snRNA-seq) e o ensaio de núcleo único para cromatina acessível à transposase com sequenciamento de alto rendimento (snATAC-seq) são necessários nesta área. Aqui, apresentamos um protocolo para isolar rapidamente núcleos para núcleos únicos subsequentes dual-omics (snRNA-seq e snATAC-seq combinados). Este método permite o isolamento de núcleos de amostras congeladas de células progenitoras cardíacas e pode ser combinado com plataformas que utilizam câmaras microfluídicas.

Introdução

Dentre os defeitos congênitos, os defeitos cardíacos congênitos (DCC) são os mais comuns, ocorrendo em cerca de 1% dos nascidos vivos a cada ano 1,2. Mutações genéticas são identificadas em apenas uma minoria dos casos, implicando que outras causas, como anormalidades na regulação gênica, estão envolvidas na etiologia daCC2,3. O desenvolvimento cardíaco é um processo complexo de tipos celulares diversos e interagentes, tornando desafiadora a identificação de mutações causais não codificantes e seus efeitos na regulação gênica. A organogênese do coração inicia-se com progenitores celulares que dão origem a diferentes subtipos de células cardíacas,incluindo células miocárdicas, fibroblastas, epicárdicas e endocárdicas4,5. A genômica unicelular está emergindo como um método-chave para estudar o desenvolvimento cardíaco e avaliar o impacto da heterogeneidade celular na saúde e na doença6. O desenvolvimento de métodos multi-ômicos para a mensuração simultânea de diferentes parâmetros e a expansão de pipelines computacionais tem facilitado a descoberta de tipos e subtipos celulares no coração normal edoente6. Este artigo descreve um protocolo confiável de isolamento de núcleo único para células progenitoras cardíacas congeladas obtidas de embriões de camundongos que é compatível com snRNA-seq e snATAC-seq a jusante (bem como snRNA-seq e snATAC-seq combinados)7,8,9.

O ATAC-seq é um método robusto que permite a identificação de regiões reguladoras da cromatina aberta e o posicionamento de nucleossomos10,11. Essas informações são usadas para tirar conclusões sobre a localização, identidade e atividade dos fatores de transcrição. A atividade de fatores da cromatina, incluindo remodeladores, bem como a atividade transcricional da RNA polimerase, podem, portanto, ser analisadas, uma vez que o método é altamente sensível para medir mudanças quantitativas na estrutura da cromatina 1,2. Assim, ATAC-seq fornece uma abordagem robusta e imparcial para descobrir os mecanismos que controlam a regulação transcricional em um tipo celular específico. Protocolos ATAC-seq também foram validados para medir a acessibilidade da cromatina em células isoladas, revelando variabilidade na arquitetura da cromatina dentro de populações celulares10,12,13.

Embora tenha havido notáveis avanços no campo das células isoladas nos últimos anos, a principal dificuldade é o processamento das amostras frescas necessárias para a realização dessesexperimentos14. Para contornar essa dificuldade, vários testes têm sido realizados com o objetivo de realizar análises como snRNA-seq e snATAC-seq com tecido cardíaco congeladoou células 15,16.

Várias plataformas têm sido utilizadas para analisar dados de genômica unicelular17. As plataformas amplamente utilizadas para expressão gênica de célula única e perfil ATAC são plataformas para encapsulamento de gotículas microfluídicas múltiplas17. Como essas plataformas utilizam câmaras microfluídicas, detritos ou agregados podem entupir o sistema, resultando em dados inutilizáveis. Assim, o sucesso de estudos unicelulares depende do isolamento preciso de células/núcleos individuais.

O protocolo aqui apresentado utiliza abordagem semelhante a estudos recentes utilizando snRNA-seq e snATAC-seq para compreensão de cardiopatias congênitas 18,19,20,21,22,23. Este procedimento utiliza a dissociação enzimática do tecido cardíaco recém-microdissecado seguido da criopreservação de células progenitoras cardíacas de camundongos. Após o descongelamento, as células viáveis são purificadas e processadas para isolamento nuclear. Neste trabalho, este protocolo foi utilizado com sucesso para obter dados de snRNA-seq e snATAC-seq a partir da mesma preparação nuclear de células progenitoras cardíacas de camundongos.

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Protocolo

O procedimento animal adotado neste estudo foi aprovado pelos comitês de ética animal da Universidade Aix-Marseille (C2EA-14) e foi realizado de acordo com protocolos aprovados pelo comitê nacional de ética para experimentação animal (Ministère de l'Education Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche; Autorização Apafis N°33927-2021111715507212).

1. Configurando o acasalamento cronometrado antes da dissecação

  1. Para gerar embriões de camundongos, realize um acasalamento cronometrado entre camundongos adultos 9,5 dias antes do isolamento da região cardíaca. Neste procedimento, camundongos selvagens C57BL/6J com idade entre 2-6 meses foram usados, e o acasalamento cronometrado foi realizado durante a noite.
  2. Na manhã seguinte, verifique se as ratas fêmeas têm um tampão vaginal. Considere o dia em que o plugue é identificado como dia embrionário (E) 0,5.

2. Preparação de tecidos e isolamento celular

  1. Eutanásia de 2-6 meses de idade fêmea prenhe C57BL/6J no dia 9,5 pós-concepção via CO2 com uma concentração crescente seguida de luxação cervical. Limpe a parte inferior do abdômen com etanol 70%.
    NOTA: O uso de anestésicos antes da luxação cervical não é recomendado, pois exporia os embriões a alterações ambientais que poderiam afetar estudos transcriptômicos e epigenômicos subsequentes.
  2. Abra o abdome e o peritônio com tesoura. Visualize os chifres uterinos e use fórceps para excisar ambos os chifres.
  3. Coloque os chifres em uma placa de Petri contendo meio completo frio com 1% de SFB. Embora nenhum volume específico seja necessário, deve-se tomar cuidado para garantir que os embriões estejam completamente imersos no meio. Um volume aproximado de 10 mL por placa de Petri de 10 cm é apropriado.
  4. Sob o estereomicroscópio regulado em aumento de 5x e usando pinças, remova o tecido endometrial, a placenta e o saco vitelínico de cada embrião.
  5. Coloque os embriões em uma placa de Petri com meio completo frio com FBS a 1%. Dissecar a região embrionária do coração, conforme descrito no esquema embrionário ilustrado na Figura 1, em meio completo a frio.
  6. Agrupe as regiões cardíacas dissecadas de cinco embriões de camundongos em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Centrífugas de balde oscilante pré-refrigeradas a 4 °C.
  7. Centrifugar a 300x g por 1 min em RT em uma centrífuga de balde oscilante. Remova o sobrenadante e lave os tecidos adicionando 1 mL de PBS grau de cultura de tecido.
  8. Centrifugar a 300 x g por 1 min em RT. Retire o sobrenadante e repita as etapas de lavagem para um total de duas lavagens. Repetir a lavagem duas vezes, substituindo o PBS por tripsina/EDTA a 0,05% (1x).
  9. Para digestão dos tecidos, adicionar 50 μL de tripsina a 0,25%/EDTA por 10 min a 37 °C. Aplique dissociação mecânica suave após 5 minutos por gestos para cima e para baixo usando uma ponta de filtro de orifício largo.
  10. Inativar a atividade de digestão de tripsina adicionando 350 μL de meio completo às células dissociadas. Passe as células ressuspensas através de um filtro celular de 40 μm.

3. Contagem de células e avaliação da viabilidade

NOTA: A contagem de células e a viabilidade são parâmetros críticos para o sucesso de experimentos de célula única. A abordagem snATAC-seq é sensível a pequenas variações no número de células. Poucas células levam à digestão excessiva da cromatina, o que resulta em um maior número de leituras e no mapeamento de regiões de cromatina inacessíveis (ruído). Da mesma forma, ter muitas células gera fragmentos de alto peso molecular que são difíceis de sequenciar. Para a determinação precisa das concentrações celulares e nucleares, a contagem e a viabilidade celular foram avaliadas por dois métodos diferentes.

  1. Execute um ensaio de azul de tripano para contagem de células, conforme descrito abaixo.
    1. Solução corante de azul de tripano Vortex 0,4%, girar por 10 s à temperatura ambiente a 2.000 x g e transferir 10 μL para um microtubo.
    2. Usando uma pipeta, misture a suspensão celular e adicione 10 μL de suspensão aos 10 μL já aliquotados da solução azul de tripano. Misture cuidadosamente 10 vezes com uma pipeta.
    3. Transfira 10 μL das células coradas para uma lâmina de contagem. Coloque a lâmina no contador para calcular automaticamente a concentração e a viabilidade da célula.
  2. Realizar uma avaliação da mortalidade baseada em fluorescência, conforme descrito abaixo.
    NOTA: Este ensaio baseia-se no uso de corantes fluorescentes (homodímero de etídio-1, EthD-1 e calceína AM) para avaliar a viabilidade celular. Foi utilizado um kit disponível comercialmente e foram seguidas as instruções do fornecedor para o preparo e uso adequados.
    1. Preparar uma solução de EthD-1 de 10 μM adicionando 5 μL da solução-mãe de EthD-1 de 2 mM fornecida a 1 mL de D-PBS de grau de cultura de tecido estéril e vórtice por 5 s para garantir a mistura completa.
    2. Transferir 2,5 μL da solução-mãe de 4 mM de calceína AM fornecida para a solução EthD-1 já preparada. Vórtice por 5 s para garantir a mistura completa.
    3. Adicionar 10 μL da solução de trabalho resultante de 10 μM de EthD-1 e 10 μM de calceína AM a 10 μL de suspensão celular.
      NOTA: A calceína é altamente suscetível à hidrólise em soluções aquosas, por isso use esta solução de trabalho dentro de 1 dia.
    4. Transfira 10 μL das células coradas para uma lâmina de contagem. Insira a lâmina no contador de células fluorescentes automatizado. Conte as células vivas usando um filtro GFP e as células mortas com um filtro RFP.
      NOTA: Os dois métodos de contagem forneceram contagens e viabilidade celulares semelhantes, e o número total de células recém-dissociadas foi estimado em média em torno de 20.000 células por região embrionária do coração (0,06 mm3).

4. Congelamento celular

  1. Centrifugar a suspensão celular a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Retire cuidadosamente o sobrenadante sem tocar no fundo do tubo e ressuspenda o pellet em 1 mL de meio congelante resfriado.
  2. Transfira a suspensão celular para um criovial pré-resfriado e coloque o criovial em um recipiente de congelamento pré-resfriado.
  3. Coloque o recipiente a −80 ◦C durante 4 h a 8 h. Transferir o nitrogênio criovial para nitrogênio líquido para experimentos de sequenciamento de RNA de núcleo único e ATAC a jusante.
    NOTA: O criovial deve ser transportado em gelo seco antes do uso. Em nossa experiência, as células podem ser armazenadas em nitrogênio líquido por pelo menos 6 meses sem perda de viabilidade celular. A temperatura de armazenamento deve ser mantida abaixo de -150 °C o tempo todo para evitar a formação de cristais de gelo.

5. Descongelamento celular e remoção de células mortas

  1. Colocar os crióvios em banho-maria a 37 °C durante 1-2 min. Removê-lo quando um pequeno cristal permanecer no criovial.
  2. Adicionar 1 ml de meio completo pré-aquecido (37 °C). Misture com uma pipeta três vezes. Transfira a suspensão para um tubo cônico de 15 mL contendo 10 mL de meio completo aquecido.
  3. Passe toda a suspensão da célula sobre um filtro de 30 μm. Enxaguar o filtro com 1-2 mL de meio completo morno e coletar o fluxo no mesmo tubo cônico.
  4. Centrifugar a 300 x g por 5 min e remover o sobrenadante. Lavar uma vez com PBS e transferir a suspensão celular para um microtubo de 1,5 ml.
  5. Centrifugar a 300 x g por 5 min e remover o sobrenadante sem interromper o pellet celular.
  6. Adicionar 100 μL das microesferas magnéticas fornecidas às células peletizadas e homogeneizar cinco vezes usando uma ponta de pipeta de furo largo. Incubar por 15 min no TR.
  7. Enquanto isso, lave a coluna de separação magnética (capacidade: 1 x 107 a 2 x 108 células) com 500 μL de 1x tampão de ligação.
  8. Uma vez concluída a incubação, diluir a suspensão celular contendo as microesferas com 500 μL de tampão de ligação 1x.
  9. Aplicar a suspensão celular (0,6 μL) na coluna de separação magnética preparada. O flow-through é a fração de células vivas selecionadas negativamente, e a fração retida magneticamente é a célula morta positivamente selecionada.
  10. Recolher o efluente de células vivas num tubo de centrifugação de 15 ml. Enxaguar o microtubo de 1,5 mL que continha a suspensão celular e a coluna com 2 mL de tampão de ligação 1x e coletar o efluente no mesmo tubo de 15 mL.
  11. Centrifugar a 300 x g por 5 min. Remova o sobrenadante sem interromper o pellet celular.
  12. Adicionar 1 mL da solução de PBS-BSA e misturar suavemente pipetando cinco vezes usando uma ponta de pipeta de orifício largo. Transfira a suspensão celular para um microtubo de 1,5 mL.
  13. Centrifugar a 300 x g por 5 min. Remova o sobrenadante sem interromper o pellet celular.
  14. Adicionar 1 mL de PBS-BSA para ressuspender o pellet e repetir a etapa de lavagem para um total de duas lavagens.
  15. Ressuspender as células em 100 μL de solução de PBS-BSA. Misture delicadamente pipetando 10 vezes.
  16. Determinar a concentração e a viabilidade das células utilizando os métodos descritos anteriormente (passo 3.1 e passo 3.2). Para prosseguir para a próxima etapa, certifique-se de uma contagem de células de ≥ 100.000 células. Consulte a Figura 2 para obter resultados representativos.
    NOTA: A criopreservação resulta em uma perda de aproximadamente 40% do material de partida inicial de células vivas. Dependendo do número inicial de células, a separação de esferas em uma coluna magnética resulta em alta viabilidade celular, mas divide o número total de células em duas a cinco vezes. A utilização de um kit magnético baseado em coluna para remover as células mortas é aconselhada apenas quando houver material de partida suficiente.

6. Isolamento de núcleos

NOTA: snATAC e snRNA-seq combinados são realizados com uma suspensão de núcleos limpos e intactos. Recomenda-se a otimização das condições de lise (tempo de lise e concentração de NP40) para o tipo celular utilizado. O tempo ótimo de lise e a concentração de detergente são aqueles que resultam no número máximo de células lisadas sem interromper a morfologia nuclear. A perda de células/núcleos pode ser reduzida usando uma centrífuga de balde oscilante em vez de uma centrífuga de ângulo fixo. Para minimizar a retenção de núcleos em plásticos, recomenda-se o uso de pontas de pipeta de baixa retenção e tubos de centrífuga. Isso pode aumentar a recuperação dos núcleos. O revestimento das pontas da pipeta e dos tubos da centrífuga com 5% de BSA é uma alternativa mais barata, mas mais demorada.

  1. Limpe o local de trabalho e os materiais com etanol 70% e solução de remoção de RNase.
  2. Centrífugas de balde oscilante pré-refrigeradas a 4 °C. Prepare recentemente o tampão de lise, o tampão de diluição de lise, o tampão de lise de 0,1x e o tampão de lavagem (ver Tabela 1). Mantenha os buffers no gelo.
  3. Centrifugar a suspensão da célula a 500 x g por 5min a 4 °C em uma centrífuga de balde oscilante. Remova suavemente todo o sobrenadante sem tocar no fundo do tubo para evitar deslocar o pellet de células.
  4. Adicionar 100 μL de tampão de lise 0,1x refrigerado. Misture suavemente pipetando 10 vezes. Incubar por 5 min no gelo.
  5. Adicione 1 mL de tampão de lavagem resfriado e misture delicadamente pipetando cinco vezes. Centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Remova o sobrenadante sem interromper o pellet do núcleo.
  6. Repita as lavagens com tampão de lavagem refrigerado para um total de três lavagens. Preparar o tampão de núcleo diluído. Após a ressuspensão, manter a solução estoque de núcleos no gelo.

7. Avaliação da qualidade e quantidade dos núcleos isolados

NOTA: Com base na contagem inicial de células e estimando aproximadamente 50% de perda de núcleos durante a lise celular, ressuspenda o número apropriado de células em tampão de núcleos diluídos a frio. O cálculo do volume de ressuspensão com tampão de núcleo diluído refrigerado baseia-se na recuperação dos núcleos visados e nas concentrações de reserva de núcleos correspondentes recomendadas pelo guia do utilizador do fabricante. Ver um exemplo deste cálculo no Protocolo Complementar 1.

  1. Com base na contagem inicial de células e estimando aproximadamente 50% de perda de núcleos durante a lise celular, ressuspenda o número apropriado de células em tampão de núcleo diluído a frio.
  2. Determine a concentração real dos núcleos. Misturar 2 μL de solução-mãe de núcleos com 8 μL de tampão de núcleos diluído e adicionar a mistura aos 10 μL pré-aliquotados de azul de tripano ou solução de trabalho EthD-1/calceínaAM. Conte os núcleos usando um contador de células automatizado. Menos de 5% das células devem ser viáveis. Consulte a Figura 3 para obter resultados representativos.
  3. Calcular o volume de reservas de núcleos e o volume de tampão de núcleos diluídos para obter um volume total de 5 μL na concentração recomendada para a reação de transposição (consulte o guia do usuário do fabricante). Proceder imediatamente à reação de transposição de acordo com o guia do usuário17.
    OBS: Todas as etapas desde a reação de transposição até a construção das bibliotecas ATAC e GEX foram realizadas de acordo com o guia do usuário do kit utilizado para snRNA-seq e snATAC-seqcombinados17.

8. Análise da qualidade das bibliotecas snRNA-seq e snATAC-seq

  1. Antes de proceder ao sequenciamento de próxima geração, valide a qualidade e a distribuição de tamanho das bibliotecas finais snATAC-seq e GEX de expressão gênica. Avaliar a qualidade e quantidade de sequências identificadas nas bibliotecas utilizando sistemas de análise de fragmentos. Consulte a Figura 4 para obter resultados representativos da avaliação da qualidade.
    NOTA: O traço final das bibliotecas snATAC-seq deve mostrar a periodicidade do enrolamento nucleossomo, e os tamanhos devem variar de 200 pb a vários Kbp, enquanto os tamanhos na biblioteca de expressão gênica devem variar de 300 pb a 600 pb.

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Resultados

Em comparação com a preparação de suspensões de célula única para abordagens de célula única, a preparação de suspensões de núcleo único é muito mais desafiadora e requer um maior grau de resolução e processamento. O fator chave para o sucesso da combinação combinada de snRNA-seq e snATAC-seq é uma suspensão de núcleos limpa e intacta. O protocolo para isolamento eficiente dos núcleos deve ser adaptado a cada tipo e condição de tecido (fresco ou congelado). Aqui, um protocolo otimizado é descrito para o isolamento de núc...

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Discussão

A análise da composição celular do coração em desenvolvimento por meio de estudos combinados de snRNA-seq e snATAC-seq fornece uma compreensão mais profunda da origem da cardiopatiacongênita26. Vários laboratórios de pesquisa têm estudado os efeitos da criopreservação de tecido cardíaco no snRNA-seq27. A condução de snRNA-seq e snATAC-seq usando tecido fresco microdissecado de modelos murinos de doença humana pode ser logisticamente desafiadora quando se comparam diferentes...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi apoiada por ERA-CVD-2019 e ANR-JCJC-2020 para SS. Agradecemos ao centro de Genômica e Bioinformática (GBiM) do laboratório U 1251/Marseille Medical Genetics e aos revisores anônimos por fornecerem comentários valiosos.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Instrumento Bioanalisador 2100AgilentSem número de catálogo
5M Cloreto de sódio (NaCl)Sigma59222C-500ML 
BSA 10% SigmaA1595-50ML
Chromium Next GEM Chip J Kit de Célula Única, 16 rxns10X Genômica1000230
Cromo Next GEM Multioma de Célula Única ATAC + Pacote de Reagentes de Expressão Gênica, 4 rxns (incluindo Nuclei Buffer 20X)10X Lâminas de câmara de contagem de células Genomics1000285
CountessInvitrogenC10283
Countess III FLThermofisherSem número de catálogo
Digitonina (5%)ThermofisherBN2006
DMSOSigmaD2650-5x5ML
DNA LoBind Tubes Eppendorf22431021
D-PBSThermofisher14190094Estéril e sem RNase
Kit de Índice Duplo TT Set A 96 rxns10X Genomics1000215
Falcon 15 mL Tubos de Centrífuga Cônicos Fisher Scientific 
Falcon 50 mL Tubos de Centrífuga Cônicos Fisher Scientific 
HI-FBSThermofisherA3840001Kit
DNA de alta sensibilidadepor calor Agilent5067-4626
Igepal CA-630SigmaI8896-50ML
VIVO/MORTO Kit de Viabilidade/CitotoxicidadeThermofisherL3224
MACS Kit de Remoção de Células Mortas: MicroEsferas Romoval de Células Mortas, Tampão de Ligação 20XMiltenyi Biotec130-090-101
MACS SmartStrainers (30 µ m)Miltenyi Biotec130-098-458
Cloreto de magnésio (MgCl2)SigmaM1028-100ML
Milieu McCoy 5A Thermofisher16600082
MS ColumnsMiltenyi Biotec130-042-201
NovaSeq 6000 S2IlluminaSem número de catálogo
Penicilina Estreptomicina (Pen/Strep)Thermofisher15070063
PluriStrainer Mini 40µ mPluriSelectV-PM15-2021-12
Inibidor de rochaEnzo Life SciencesALX-270-333-M005
Kit de índice único N Set A, 96 rxn10X Genômica1000212
Placa de Petri padrão de 90 mm SterilinThermofisher101R20
Água estéril bidestiladaThermofisherR0582
Cloridrato de Trizma solução (HCl)SigmaT2194-100ML 
Mancha de Azul de Tripano (0,4%)InvitrogenT10282
Tripsina 0,05% - EDTA 1XThermofisher25300054
Tween20SigmaP9416-50ML 
Pontas de pipeta filtradas por orifício largo 200 μ lLabcon1152-965-008-9
ZEISS SteREO Discovery.V8ZEISSSem número de catálogo
35209610788561 de inativado

Referências

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