Aqui, apresentamos um protocolo descrevendo a preparação de núcleos celulares. Após microdissecção e dissociação enzimática do tecido cardíaco em células únicas, as células progenitoras foram congeladas, seguidas pelo isolamento de células viáveis puras, que foram usadas para sequenciamento de RNA de núcleo único e o ensaio de núcleo único para cromatina acessível à transposase com análises de sequenciamento de alto rendimento.
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Artigo de método
Isolamento de Núcleos de Células Progenitoras Cardíacas de Camundongos para Perfil de Epigenoma e Expressão Gênica em Resolução Unicelular
Neste artigo
Resumo
Resumo
O coração em desenvolvimento é uma estrutura complexa contendo várias células progenitoras controladas por mecanismos regulatórios complexos. O exame da expressão gênica e do estado da cromatina de células individuais permite a identificação do tipo e estado celular. Abordagens de sequenciamento unicelular têm revelado uma série de características importantes da heterogeneidade de células progenitoras cardíacas. No entanto, esses métodos são geralmente restritos ao tecido fresco, o que limita estudos com diversas condições experimentais, pois o tecido fresco deve ser processado de uma só vez no mesmo período para reduzir a variabilidade técnica. Portanto, procedimentos fáceis e flexíveis para produzir dados de métodos como o sequenciamento de RNA de núcleo único (snRNA-seq) e o ensaio de núcleo único para cromatina acessível à transposase com sequenciamento de alto rendimento (snATAC-seq) são necessários nesta área. Aqui, apresentamos um protocolo para isolar rapidamente núcleos para núcleos únicos subsequentes dual-omics (snRNA-seq e snATAC-seq combinados). Este método permite o isolamento de núcleos de amostras congeladas de células progenitoras cardíacas e pode ser combinado com plataformas que utilizam câmaras microfluídicas.
Introdução
Dentre os defeitos congênitos, os defeitos cardíacos congênitos (DCC) são os mais comuns, ocorrendo em cerca de 1% dos nascidos vivos a cada ano 1,2. Mutações genéticas são identificadas em apenas uma minoria dos casos, implicando que outras causas, como anormalidades na regulação gênica, estão envolvidas na etiologia daCC2,3. O desenvolvimento cardíaco é um processo complexo de tipos celulares diversos e interagentes, tornando desafiadora a identificação de mutações causais não codificantes e seus efeitos na regulação gênica. A organogênese do coração....
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Protocolo
O procedimento animal adotado neste estudo foi aprovado pelos comitês de ética animal da Universidade Aix-Marseille (C2EA-14) e foi realizado de acordo com protocolos aprovados pelo comitê nacional de ética para experimentação animal (Ministère de l'Education Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche; Autorização Apafis N°33927-2021111715507212).
1. Configurando o acasalamento cronometrado antes da dissecação
- Para gerar embriões de camundongos, realize um acasalamento cronometrado entre camundongos adultos 9,5 dias antes do isolamento da região cardíaca. Neste procedimento, camundongos selvagens C5....
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Resultados
Em comparação com a preparação de suspensões de célula única para abordagens de célula única, a preparação de suspensões de núcleo único é muito mais desafiadora e requer um maior grau de resolução e processamento. O fator chave para o sucesso da combinação combinada de snRNA-seq e snATAC-seq é uma suspensão de núcleos limpa e intacta. O protocolo para isolamento eficiente dos núcleos deve ser adaptado a cada tipo e condição de tecido (fresco ou congelado). Aqui, um protocolo otimizado é descrito para o isolamento de núc.......
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Discussão
A análise da composição celular do coração em desenvolvimento por meio de estudos combinados de snRNA-seq e snATAC-seq fornece uma compreensão mais profunda da origem da cardiopatiacongênita26. Vários laboratórios de pesquisa têm estudado os efeitos da criopreservação de tecido cardíaco no snRNA-seq27. A condução de snRNA-seq e snATAC-seq usando tecido fresco microdissecado de modelos murinos de doença humana pode ser logisticamente desafiadora quando se comparam diferentes.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi apoiada por ERA-CVD-2019 e ANR-JCJC-2020 para SS. Agradecemos ao centro de Genômica e Bioinformática (GBiM) do laboratório U 1251/Marseille Medical Genetics e aos revisores anônimos por fornecerem comentários valiosos.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Instrumento Bioanalisador 2100 | Agilent | Sem número de catálogo | |
| 5M Cloreto de sódio (NaCl) | Sigma | 59222C-500ML | |
| BSA 10% | Sigma | A1595-50ML | |
| Chromium Next GEM Chip J Kit de Célula Única, 16 rxns | 10X Genômica | 1000230 | |
| Cromo Next GEM Multioma de Célula Única ATAC + Pacote de Reagentes de Expressão Gênica, 4 rxns (incluindo Nuclei Buffer 20X) | 10X Lâminas de câmara de contagem de células Genomics | 1000285 | |
| Countess | Invitrogen | C10283 | |
| Countess III FL | Thermofisher | Sem número de catálogo | |
| Digitonina (5%) | Thermofisher | BN2006 | |
| DMSO | Sigma | D2650-5x5ML | |
| DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 22431021 | |
| D-PBS | Thermofisher | 14190094 | Estéril e sem RNase |
| Kit de Índice Duplo TT Set A 96 rxns | 10X Genomics | 1000215 | |
| Falcon 15 mL Tubos de Centrífuga Cônicos | Fisher Scientific | ||
| Falcon 50 mL Tubos de Centrífuga Cônicos | Fisher Scientific | ||
| HI-FBS | Thermofisher | A3840001 | Kit |
| DNA de alta sensibilidade | por calor Agilent | 5067-4626 | |
| Igepal CA-630 | Sigma | I8896-50ML | |
| VIVO/MORTO Kit de Viabilidade/Citotoxicidade | Thermofisher | L3224 | |
| MACS Kit de Remoção de Células Mortas: MicroEsferas Romoval de Células Mortas, Tampão de Ligação 20X | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| MACS SmartStrainers (30 µ m) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Cloreto de magnésio (MgCl2) | Sigma | M1028-100ML | |
| Milieu McCoy 5A | Thermofisher | 16600082 | |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| NovaSeq 6000 S2 | Illumina | Sem número de catálogo | |
| Penicilina Estreptomicina (Pen/Strep) | Thermofisher | 15070063 | |
| PluriStrainer Mini 40µ m | PluriSelect | V-PM15-2021-12 | |
| Inibidor de rocha | Enzo Life Sciences | ALX-270-333-M005 | |
| Kit de índice único N Set A, 96 rxn | 10X Genômica | 1000212 | |
| Placa de Petri padrão de 90 mm Sterilin | Thermofisher | 101R20 | |
| Água estéril bidestilada | Thermofisher | R0582 | |
| Cloridrato de Trizma solução (HCl) | Sigma | T2194-100ML | |
| Mancha de Azul de Tripano (0,4%) | Invitrogen | T10282 | |
| Tripsina 0,05% - EDTA 1X | Thermofisher | 25300054 | |
| Tween20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Pontas de pipeta filtradas por orifício largo 200 μ l | Labcon | 1152-965-008-9 | |
| ZEISS SteREO Discovery.V8 | ZEISS | Sem número de catálogo |
Referências
- vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews. Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
- Bouma, B. J., Mulder, B. J. Changing landscape of congenital heart disease. Circulation Research. 120 (6), 908-922 (2017).
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Reimpressões e permissões
