Protocolo de ensaio de cisalhamento para a determinação de propriedades de material de célula única

Summary

Este protocolo descreve a quantificação das propriedades mecânicas de linhagens celulares cancerosas e não cancerosas in vitro. Diferenças conservadas na mecânica de células cancerosas e normais podem atuar como um biomarcador que pode ter implicações no prognóstico e diagnóstico.

Abstract

A biomecânica irregular é uma marca da biologia do câncer sujeita a extenso estudo. As propriedades mecânicas de uma célula são semelhantes às de um material. A resistência de uma célula ao estresse e à tensão, seu tempo de relaxamento e sua elasticidade são propriedades que podem ser derivadas e comparadas a outros tipos de células. Quantificar as propriedades mecânicas de células cancerosas (malignas) versus normais (não malignas) permite que os pesquisadores descubram ainda mais os fundamentos biofísicos desta doença. Embora as propriedades mecânicas das células cancerosas sejam conhecidas por diferir consistentemente das propriedades mecânicas das células normais, um procedimento experimental padrão para deduzir essas propriedades das células em cultura está faltando.

Este trabalho descreve um procedimento para quantificar as propriedades mecânicas de células isoladas in vitro usando um ensaio de cisalhamento fluido. O princípio por trás deste ensaio envolve a aplicação de tensão de cisalhamento de fluido em uma única célula e o monitoramento óptico da deformação celular resultante ao longo do tempo. As propriedades mecânicas celulares são posteriormente caracterizadas usando a análise de correlação digital de imagem (DIC) e ajustando um modelo viscoelástico apropriado aos dados experimentais gerados a partir da análise DIC. De modo geral, o protocolo aqui delineado visa fornecer um método mais eficaz e direcionado para o diagnóstico de cânceres de difícil tratamento.

Introduction

O estudo das diferenças biofísicas entre células cancerosas e não cancerosas permite novas oportunidades diagnósticas e terapêuticas¹. A compreensão de como as diferenças na biomecânica/mecanobiologia contribuem para a progressão tumoral e resistência ao tratamento revelará novos caminhos para a terapia-alvo e o diagnóstico precoce².

Embora se saiba que as propriedades mecânicas das células cancerosas diferem das células normais (por exemplo, viscoelasticidade da membrana plasmática e do envelope nuclear)^3,4,5, faltam métodos robustos e reprodutíveis para medir essas propriedades em células ^vivas6. O método de ensaio de cisalhamento é utilizado para quantificar as propriedades mecânicas de células, submetendo células isoladas à tensão de cisalhamento fluida e analisando suas respostas individuais e resistência à tensão aplicada 3,4,5,7,8,9. Embora vários métodos e técnicas tenham sido utilizados para caracterizar as propriedades mecânicas de células isoladas, estes tendem a afetar as propriedades do material celular por i) perfurar/danificar a membrana celular devido à profundidade de indentação, geometrias complexas da ponta ou enrijecimento do substrato associado à microscopia de força atômica (AFM)^10,11, ii) induzir fotodano celular durante o aprisionamento ^{óptico12, 13}, ou iii) indução de estados complexos de estresse associados à aspiração por micropipetas^14,15. Esses efeitos externos estão associados a incertezas significativas na acurácia das medidas de viscoelasticidade celular 6,16,17.

Para resolver essas limitações, o método de ensaio de cisalhamento descrito aqui fornece uma abordagem altamente controlável e simples para simular o fluxo fisiológico no corpo sem afetar as propriedades do material celular no processo. As tensões de cisalhamento de fluidos neste ensaio representam tensões mecânicas experimentadas pelas células do corpo, seja por fluidos dentro do interstício tumoral ou no sangue durante a circulação^18,19,20. Além disso, esses estresses fluidos promovem vários comportamentos malignos nas células cancerosas, incluindo progressão, migração, metástase e morte celular 19,21,22,23, que variam entre células tumorigênicas e não tumorigênicas. Além disso, as características mecânicas alteradas das células cancerosas (isto é, muitas vezes são mais "moles" do que as células normais encontradas dentro do mesmo órgão) permitem que elas persistam em microambientes tumorais hostis, invadam tecidos normais circundantes e metastatizem para locais distantes^24,25,26. Ao criar um ambiente pseudobiológico onde as células experimentam níveis fisiológicos de tensão de cisalhamento de fluidos, um processo que é fisiologicamente relevante e não destrutivo para a célula é alcançado. As respostas celulares a estas tensões de cisalhamento de fluidos aplicadas permitem caracterizar as propriedades mecânicas celulares.

Este trabalho fornece um protocolo de ensaio de cisalhamento para o estudo extensivo das propriedades mecânicas e comportamento de células cancerosas e não cancerosas sob estresse de cisalhamento aplicado. As células respondem às forças externas de forma elástica e viscosa, podendo, portanto, ser idealizadas como um material viscoelástico³. Esta técnica é categorizada em: (i) cultura celular de células isoladas dispersas, (ii) aplicação controlada de tensão de cisalhamento fluido, (iii) imagem in situ e observação do comportamento celular (incluindo resistência ao estresse e deformação), (iv) análise de deformação de células para determinar a extensão da deformação e (v) caracterização das propriedades viscoelásticas de células isoladas. Ao interrogar essas propriedades e comportamentos mecânicos, mecanobiologia celular complexa pode ser destilada para dados quantificáveis. Um protocolo delineando este método permite a catalogação e comparação entre vários tipos de células malignas e não malignas. A quantificação dessas diferenças tem o potencial de estabelecer biomarcadores diagnósticos e terapêuticos.

Protocol

1. Preparação para o ensaio de cisalhamento unicelular

1. Cultura celular
   1. Semeando aproximadamente 50.000 células isoladas suspensas em uma placa de Petri de 35 mm x 10 mm contendo 2 mL de meio de cultura.
      NOTA: Vórtice as células suspensas antes da semeadura para quebrar os agregados celulares.
   2. Incubar as células a 37 °C e permitir entre 10 a 48 h para a ligação celular e formação completa de proteínas do citoesqueleto.
      NOTA: Considere a duração da ligação celular, bem como as taxas de proliferação e crescimento, para garantir o crescimento e a ligação celular adequados, evitando a agregação celular. Esses parâmetros variam de acordo com o tipo de célula.

2. Experimento de ensaio de cisalhamento

1. Preparação de meios viscosos de fluxo para ensaio de cisalhamento
   1. Para garantir um meio de fluxo ligeiramente viscoso (0,015-0,02 Pa·s), medir e adicionar 0,05% em peso de metilcelulose não tóxica e não alergênica (4 Pa·s) aos meios de cultura.
   2. Para garantir uma mistura homogênea, pré-aqueça o meio de cultura base por ~10-20 min a uma temperatura de ~60-70 °C com um agitador magnético/placa quente. Ao agitar continuamente o meio, adicione suavemente a metilcelulose de tal forma que ela se disperse rapidamente, para evitar a coagulação das partículas de metilcelulose. Permita que este processo continue por ~15-24 h para garantir uma solução clara de mídia + celulose.
      NOTA: Evite o aquecimento excessivo da solução.
   3. Para medir a viscosidade do meio de fluxo, teste ~0,5-1 mL do meio de fluxo representativo usando um reômetro. A partir da leitura, determinar a viscosidade do fluido e utilizar este valor para representar a viscosidade do meio fluido de cisalhamento (μ) para calcular a tensão de cisalhamento usando a equação (2).
2. Configuração do aparelho de cisalhamento
   1. Instalar o sistema de ensaio de cisalhamento de seringas duplas (60 mL ou 100 mL) conectadas a uma bomba de seringa programável para infusão e retirada do meio de cultura viscoso (Figura 1).
   2. Conecte ambas as seringas à câmara de fluxo por meio de conectores de tubulação e tubulação de 1/16 polegada.
   3. Fixe uma junta de borracha para fornecer um fluxo controlado e uniforme em células individuais ao longo do caminho de fluxo (Figura 1). A junta de borracha tem tamanhos diferentes dependendo do perfil de fluxo a ser atingido (laminar ou turbulento) e da área de observação desejada (por exemplo, comprimento de 22,5 mm, largura de 2,5 mm e altura de 0,254 mm) (Figura 1).
   4. Programe a bomba para infundir e retirar um determinado volume de líquido (por exemplo, 60 mL) a uma taxa designada (por exemplo, 1 mL/min) e selecione as seringas correspondentes (por exemplo, 60 mL).
      NOTA: Considere as predefinições de volume máximo de perfusão e retirada para evitar emperramento ou mau funcionamento. Use a equação (2) para o cálculo da taxa de cisalhamento da bomba requerida (supondo que a tensão e a viscosidade necessárias sejam conhecidas).
3. Configuração pré-cisalhamento
   1. Encha a seringa com o meio de fluxo viscoso preparado.
   2. Conecte a seringa, preenchida com 60 ou 100 mL (ou conforme necessário) de meio de fluxo viscoso, e uma seringa vazia de 60 mL em seus respectivos locais na bomba de seringa programável. Através de conectores de tubulação e tubulação, conecte ambas as seringas à câmara de fluxo.
   3. Para garantir a fácil identificação de células individuais e uma conexão fixa entre a câmara de fluxo e a placa de Petri, conecte a junta de borracha à câmara de fluxo.
   4. Aspirar o meio de cultura celular da placa de Petri contendo as células de interesse.
   5. Lave as células mortas e as células frouxamente ligadas usando solução salina tamponada com fosfato (PBS).
   6. Aspirar o PBS.
   7. Insira e fixe a câmara de fluxo e a junta de borracha (~34 mm x 9 mm) na placa de Petri (35 mm x 10 mm) que contém as células conectadas.
   8. Coloque a câmara de fluxo microfluídica encaixada + células em uma placa cultivada em um microscópio invertido, com uma objetiva de microscópio alta o suficiente para obter imagens de alta qualidade com altos valores de pixels (geralmente entre 40x e 63x de aumento) e um monitor de exibição.
   9. Selecione a opção de imagem ao vivo (time-lapse em algum software) no software do microscópio no monitor de exibição. Verifique se o software do microscópio no PC tem uma funcionalidade t (time-lapse) ou pode fazer gravações de vídeo.
   10. Focalizar a objetiva do microscópio, garantindo contraste adequado e bordas celulares distintas. Isso é necessário para a análise da imagem pós-cisalhamento. Mova o estágio do microscópio para garantir que as células sejam claramente visíveis no monitor de exibição e sejam imagens ao vivo.
   11. Selecione uma célula ou várias células distintas dentro do caminho de imagem/fluxo da câmara de fluxo encaixada + placa de Petri (a área/caminho criado pelo encaixe da junta na câmara de fluxo).
4. Cisalhamento e geração de imagens
   1. Para manter um fluxo uniforme contínuo, selecione taxas de infusão e retirada semelhantes e garanta o fluxo laminar do fluido, geralmente entre 1 mL/min e 5 mL/min. Para regimes de baixo fluxo laminar, garanta um número de Re < 100 de Reynold.
   2. Clique em Executar na bomba de cisalhamento para injetar e retirar o fluido de cisalhamento (meio viscoso preparado) a uma taxa contínua. Certifique-se de que não haja bolhas durante a infusão de fluidos, pois isso pode introduzir estresse externo não contabilizado nas células.
   3. Comece a gravar um vídeo clicando em gravar no software do microscópio antes que o fluido de cisalhamento infundido entre em contato com a(s) célula(s) de interesse sob o microscópio.
   4. Continue a gravar por 7 min, ou pela duração desejada da exposição ao estresse, ou até que a(s) célula(s) de interesse se desprenda do fundo do prato. Clique em parar a gravação no software do microscópio quando a execução for concluída conforme desejado.
   5. Salve a gravação e extraia como .tiff arquivos. De preferência, extraia imagens a 1 quadro por segundo para facilitar a análise.

3. Processamento de dados

1. Procedimento de correlação de imagem digital (análise de imagem)
   1. Se a gravação do microscópio foi extraída como um arquivo de vídeo, converta-a em quadros de imagem (de preferência .tiff formato de arquivo).
   2. Importar as imagens derivadas da gravação do ensaio de cisalhamento para o software Davis 10.1.2 (software DIC) para rastrear o movimento das estruturas naturalmente padronizadas da célula, localizando cada bloco de pixel (subconjunto) da imagem de referência nas respectivas novas imagens (imagens deformadas) (Figura 2).
   3. Para uma correlação otimizada, utilize um tamanho de subconjunto de 31 x 31 pixels, um tamanho de passo (distância de deformação de cada subconjunto) de 20 pixels e a soma da opção de trilha diferencial , que rastreia a deformação de uma nova imagem em relação à última imagem. O resultado dessa correlação é um gráfico de tempo de deformação (Figura 3) que pode ser exportado como um arquivo .csv para análise posterior no MATLAB.
   4. Mapeie a região de interesse para uma única célula escolhida. Selecione pontos arbitrários dentro da célula mapeada para rastrear a deformação. Para uma forma irregular, como a célula, use uma máscara de polígono para mapear a geometria da célula.
   5. Após o mapeamento, escolha pontos específicos na célula (núcleo ou citoplasma) a serem analisados, clicando em adicionar extensômetro e desenhando extensômetros individuais em pontos dentro do limite celular definido.
   6. Clique em Executar para iniciar o processamento da tensão e obter dados de tensão versus tempo.
   7. Clique duas vezes (ou clique com o botão direito do mouse) no gráfico de tempo de tensão gerado e selecione exportar dados como uma planilha.

4. Caracterização das propriedades mecânicas

1. Caracterização das propriedades viscoelásticas
   1. Salve o arquivo .csv que contém os dados de tempo de tensão do software DIC em uma pasta separada para facilitar a leitura pelo MATLAB.
   2. Execute o MATLAB e clique na guia do editor para abrir uma página do editor para escrever um código que leia a planilha, célula por célula.
   3. Altere o caminho do MATLAB (o caminho da pasta que acessa o arquivo de interesse) para acessar a pasta que contém os dados a serem analisados, por exemplo, Usuários/Nome de usuário/Área de trabalho/dados.
   4. Na página do editor MATLAB, acesse os dados da planilha usando o código personalizado. Por exemplo: a1= xlsread('data','run1','A4:A183'), onde a1 representa o identificador, xlsread é a função MATLAB que lê o arquivo .csv (neste caso, como uma planilha), data é o nome do arquivo, run1 é o nome da planilha e A4:A183 é o intervalo de dados de interesse na célula A dos dados da planilha a serem analisados. Para um ajuste completo, analise x e y (tempo e tensão, respectivamente). Por exemplo:
      a1=xlsread('dados','run1','A4:A183');
      b1=xlsread('dados','run1','B4:B183');
      a1 = x (tempo) e b1 = y (tensão).
   5. No MATLAB, clique em Aplicativos | Montador de Curvas | Equação personalizada. Limpe a equação personalizada representativa e insira a equação do modelo viscoelástico [equação (1)], onde ε representa a variável x e t representa a variável y.
      (1º)
      Aqui, ε representa a deformação, σ representa a tensão de cisalhamento, η₁ representa a viscosidade, E representa a elasticidade, t representa o tempo e τ representa o tempo de relaxação, que caracteriza o tempo máximo necessário para que a célula retorne à sua forma original após a deformação primária. É expresso como τ = , onde η₂ é o termo de viscosidade secundária para o segundo dashpot (Figura 4).
   6. Reatribua novas variáveis aos parâmetros viscoelásticos dentro da interface de equação personalizada. (ε, η₁, E, σ, t e τ = ) representará (x, a, b, K, y e c), respectivamente. Aqui, x e y são as variáveis independentes e dependentes, respectivamente. A tensão de cisalhamento (σ) pode ser determinada usando a equação (2):
      (2º)
      Aqui, μ representa a viscosidade do meio fluido de cisalhamento, Q é a vazão da bomba, e w e h são a largura e a altura do canal de fluxo mostradas na Figura 1C, respectivamente.
   7. Clique em Selecionar Dados para selecionar a Hora (a1) e a Tensão (b1) para cada conjunto de dados.
   8. Verifique se a opção Caixa de ajuste automático está marcada. Isso executa o ajuste automaticamente quando os dados (x e y) são selecionados.
   9. Selecione os métodos de ajuste para apertar as condições de contorno. Clique em Opções avançadas na categoria Métodos e selecione Mínimos quadrados não lineares. Em Robusto, selecione Desativado e, em Algoritmo, selecione Região de Confiança. Deixe todos os outros parâmetros como estão.
   10. As novas variáveis pós-ajuste (a, b e c) representam as propriedades viscoelásticas, viscosidade, elasticidade e tempo de relaxação (η₁, E, EQUAT) da célula, respectivamente (Figura 5).
   11. Procure um alto valor R-quadrado do ajuste (R² > 80%) para garantir que a saída de dados possa ser considerada um ajuste verdadeiro do modelo viscoelástico (Figura 3)

Results

O protocolo de ensaio de cisalhamento acoplado à análise de deformação usando DIC e um modelo viscoelástico é bem sucedido em quantificar as propriedades mecânicas de uma única célula in vitro. Esse método foi testado em linhagens celulares humanas e murinas, incluindo células mamárias humanas normais (MCF-10A)^3,4,9, células de câncer de mama triplo-negativas menos metastáticas (MDA-MB-468)3, células de câncer de mama triplo-negativas (MDA-MB-231)3, células de osteossarcoma

Discussion

O método de ensaio de cisalhamento, que inclui a criação de um ambiente pseudomecanobiológico para simular a interação das células com o microambiente mecânico circundante e suas respostas a estresses mecânicos, produziu um catálogo de propriedades mecânicas celulares, cujos padrões mostram atipias físicas conservadas entre linhagens de células cancerosas3,4,5,7,8

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CULTURA CELULAR
,25% Tripsina, 2,21 mM EDTA, 1x[-] bicarbonato de sódio	Corning	25-053-ci	Para desprendimento celular do substrato em cultura de células
15 mL Tubos de centrífuga	Falcon by Corning	05-527-90
Placas de Petri de 35 mm	Corning	430165
50 mL Tubos de	centrífugaFalcon by Corning	14-432-22
Centrífuga	qualquer		Para cultura de células estéreis
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) 1x	Corning	10-013-cv	Ou qualquer outro meio para cultura de células. O DMEM foi usado para cultura de células U87
Luvas	qualquer		Para cultura de células estéreis
Heracell Vios 160i CO2 Incubadora	Thermo Scientific	51033770	Para incubação durante a cultura de células
Capuz	qualquer		Para cultura de células estéreis
Micropipeta	qualquer		Para cultura de células estéreis
micropipeta	qualquer		Para cultura de células estéreis
Microscópio	Leica/any		Para cultura de células estéreis
Tamponamento fosfato Salina sem cálcio e magnésio PBS, 1x	Corning	21-040-CM
Pipetman	qualquer		Para cultura de células estéreis
Pontas de pipeta	qualquer		Para cultura de células estéreis
Incubadora de líquidos Precision GP 10	Thermo Scientific	TSGP02
T25 Frasco	Corning	430639
T75 Frasco	Corning	430641U
SHEAR ASSAY
100 mL	béquer qualquer		Para criar DMEM + metilcelulose viscosa mídia de cisalhamento
DMEM	Corning
Câmara de fluxo + junta de borracha	Glycotech	31-001	Kit de câmara de fluxo circular (para placas de cultura de tecidos de 35 mm)
Reômetro híbrido	HR-2 Discovery Reômetro		Para determinação da viscosidade do fluido de cisalhamento
Barra de agitação magnética	qualquer		Para criar mídia de cisalhamento viscosa DMEM + metilcelulose
Placa de agitação magnética	qualquer		Para a criação de meios de cisalhamento viscosos DMEM + metilcelulose
Metilcelulose	qualquer		Para aumentar a viscosidade do DMEM em meios de fluxo Bomba de
seringa	KD Scientific Geminin 88 plus	788088	Para programar a infusão e retirada de fluidos
Seringas, tubos e conectores			Para configuração do aparelho de cisalhamento
SOFTWARE
Software ABAQUS	Simulia
Software de correlação de imagem digital	LaVision, Alemanha	DAVIS 10.1.2
Software de imagem	Leica/qualquer software
MATLAB	MATLAB	MATLAB_R2020B