Detecção de Mitofagia em Caenorhabditis elegans e Células de Mamíferos Usando Corantes Organel-Específicos

Resumo

Explorar a mitofagia por meio de microscopia eletrônica, sensores genéticos e imunofluorescência requer equipamentos caros, pessoal qualificado e um investimento de tempo significativo. Aqui, demonstramos a eficácia de um kit comercial de corante de fluorescência na quantificação do processo de mitofagia em ambos Caenorhabditis elegans e uma linhagem celular de câncer de fígado.

Resumo

As mitocôndrias são essenciais para várias funções biológicas, incluindo produção de energia, metabolismo lipídico, homeostase do cálcio, biossíntese do heme, morte celular regulada e geração de espécies reativas de oxigênio (EROs). As ROS são vitais para os principais processos biológicos. No entanto, quando não controladas, podem levar a lesões oxidativas, incluindo danos mitocondriais. As mitocôndrias danificadas liberam mais EROs, intensificando assim a lesão celular e o estado da doença. Um processo homeostático chamado autofagia mitocondrial (mitofagia) remove seletivamente as mitocôndrias danificadas, que são então substituídas por novas. Existem múltiplas vias de mitofagia, com o objetivo comum sendo a quebra das mitocôndrias danificadas nos lisossomos.

Várias metodologias, incluindo sensores genéticos, imunofluorescência de anticorpos e microscopia eletrônica, usam esse desfecho para quantificar a mitofagia. Cada método para examinar a mitofagia tem suas vantagens, como o direcionamento específico de tecido/célula (com sensores genéticos) e grande detalhe (com microscopia eletrônica). No entanto, esses métodos geralmente exigem recursos caros, pessoal treinado e um longo tempo de preparação antes do experimento real, como para a criação de animais transgênicos. Aqui, apresentamos uma alternativa custo-efetiva para medir mitofagia usando corantes fluorescentes comercialmente disponíveis visando mitocôndrias e lisossomos. Este método mede efetivamente a mitofagia no nematoide Caenorhabditis elegans e em células hepáticas humanas, o que indica sua potencial eficiência em outros sistemas modelo.

Introdução

As mitocôndrias são essenciais para todos os animais aeróbicos, incluindo os seres humanos. Eles convertem a energia química das biomoléculas em trifosfato de adenosina (ATP) via fosforilação oxidativa¹, sintetizam heme², degradam ácidos graxos através da oxidação β³, regulam a homeostase do cálcio⁴ e ferro⁵, controlam a morte celular pela apoptose⁶ e geram espécies reativas de oxigênio (EROs), que desempenham um papel vital na homeostase redox7. Dois processos complementares e opostos mantêm a integridade e o bom funcionamento das mitocôndrias: a síntese de novos componentes mitocondriais (biogênese) e a remoção seletiva dos danificados através da autofagia mitocondrial (i.e., mitofagia)⁸.

Várias vias mitofágicas são mediadas por enzimas, como PINK1/Parkin, e receptores, incluindo FUNDC1, FKBP8 e BNIP/NIX ^9,10. Notadamente, a degradação seletiva de componentes mitocondriais pode ocorrer independentemente da maquinaria autofagossomal (isto é, através de vesículas derivadas da mitocôndria)¹¹. No entanto, os desfechos das diferentes vias de mitofagia seletiva são semelhantes (i.e., degradação mitocondrial por enzimas lisossômicas)^12,13. Por essa razão, vários métodos de identificação e mensuração da mitofagia dependem da colocalização de marcadores mitocondriais e lisossômicos 14,15,16,17 e diminuição dos níveis de proteínas mitocondriais/DNA mitocondrial ¹⁸.

A seguir, uma descrição concisa das metodologias experimentais existentes para medir a mitofagia em células animais usando microscopia de fluorescência, enfatizando a fase final da mitofagia.

Biossensores de mitofagia
A degradação mitocondrial ocorre no ambiente ácido do lisossomo¹⁹. Portanto, os componentes mitocondriais, incluindo proteínas, experimentam uma mudança de um pH neutro para um pH ácido no final do processo de mitofagia. Esse padrão sustenta o mecanismo de ação de vários biossensores mitofágicos, incluindo mito-Rosella¹⁸ e mCherry-GFP-FIS1 em tandem1¹⁴. Esses sensores contêm uma proteína de fluorescência verde sensível ao pH (GFP) e uma proteína de fluorescência vermelha (RFP) insensível ao pH. Portanto, no final da mitofagia, a razão de fluorescência verde-vermelho cai significativamente devido à extinção do fluoróforo GFP. As principais limitações desses sensores são (1) possível transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) entre os fluoróforos; (2) a taxa de maturação diferencial de GFP e RFP; (3) dissociação entre GFP e RFP devido à clivagem proteolítica do polipeptídeo que as conecta; (4) sobreposição de fluorescência-emissão; e (5) brilho diferencial do fluoróforo e têmpera^15,16.

Um sensor que supera algumas dessas limitações é o sensor mitocondrial^Keima17. O sensor mt-Keima (derivado da proteína coral Keima) exibe um único pico de emissão (620 nm). No entanto, seus picos de excitação são sensíveis ao pH. Como resultado, há uma transição de uma excitação verde (440 nm) para uma excitação vermelha (586 nm) ao mudar de um pH elevado para um pH ácido^16,17. Um sensor de mitofagia mais recente, o Mito-SRAI, tem avançado o campo ao permitir medições em amostras biológicas fixas²⁰. No entanto, apesar das muitas vantagens dos sensores genéticos, como a capacidade de expressá-los em tecidos/células específicos e direcioná-los para compartimentos mitocondriais distintos, eles também apresentam limitações. Uma limitação é que os sensores genéticos precisam ser expressos em células ou animais, o que pode ser demorado e intensivo em recursos.

Além disso, a expressão dos sensores dentro das próprias mitocôndrias pode influenciar a função mitocondrial. Por exemplo, a expressão de GFP mitocondrial (mtGFP) nos músculos da parede do corpo do verme C. elegans expande a rede mitocondrial²¹. Esse fenótipo depende da função do fator de transcrição ativado por estresse ATFS-1, que desempenha um papel essencial na ativação da resposta proteica desdobrada na mitocôndria (UPR^mt)²¹. Portanto, embora os biossensores mitocondria/mitofagia codificados geneticamente sejam extremamente úteis para monitorar a homeostase mitocondrial in vivo, eles podem afetar o próprio processo que são projetados para medir.

Anticorpos e corantes mitocondria/lisossomos específicos
Outra estratégia para testar a colocalização mitocondrial/lisossomal é a utilização de anticorpos contra proteínas mitocondriais/lisossomais, como a proteína de membrana externa mitocondrial TOM20 e a proteína de membrana associada lisossomal 1 (LAMP1)²². Na maioria dos casos, anticorpos secundários que são conjugados a um fluoróforo são usados para detectar o sinal de fluorescência via microscopia. Outra estratégia é combinar construções genéticas com corantes mitocondriais/lisossomais, como expressar uma fusão LAMP1::GFP em células enquanto as cora com um corante mitocondrial vermelho (por exemplo, Mitotracker Red)¹⁶. Essas metodologias, embora eficazes, requerem anticorpos específicos e muitas vezes envolvem o trabalho com espécimes fixos ou a geração de células/animais transgênicos expressando mitocôndrias/lisossomos marcados fluorescentemente.

Neste artigo, descrevemos a utilização de um kit comercial de coloração lisossomos/mitocôndrias/nucleares para avaliar as propriedades ativadoras da mitofagia da diamina sintética O,O (octano-1,8-diil)bis(hidroxilamina), doravante denominada VL-850²³, em vermes de C. elegans e na linhagem de células cancerígenas humanas Hep-3B (Figura 1). O kit de coloração contém uma mistura de corantes lisossômicos/mitocondriais/nuclear-direcionados que coram especificamente essas organelas²³. Utilizamos previamente este kit para demonstrar a atividade mitofágica de 1,8 diaminooctano (doravante denominada VL-004) em C. elegans²³. É importante ressaltar que validamos os resultados do kit de coloração com o biossensor mito-Rosella e medidas de qPCR do conteúdo de DNA mitocondrial:nuclear²³. Este kit de coloração oferece as seguintes vantagens. Primeiro, não há necessidade de gerar animais transgênicos ou células expressando um biossensor mitocondrial. Portanto, podemos estudar animais ou células selvagens não modificados e, assim, economizar muito tempo, dinheiro e trabalho. Além disso, como mencionado, a expressão de biossensores mitocondriais pode alterar a função mitocondrial. Em segundo lugar, o kit é econômico, fácil de usar e rápido. Terceiro, embora demonstremos o método em células de C. elegans e humanas, ele poderia ser modificado para outros tipos celulares e organismos.

Dito isso, como qualquer método, o protocolo do kit de coloração tem desvantagens. Por exemplo, a incubação dos vermes com o reagente é realizada na ausência de alimento (vimos que mesmo bactérias mortas diminuem significativamente a eficiência de coloração). Embora o tempo de incubação seja relativamente curto, é possível que, mesmo nesse período de tempo, as respostas homeostáticas possam estar alteradas, incluindo a mitofagia. Além disso, a ligação dos corantes às proteínas ER/mitocondriais/nucleares e outras biomoléculas pode afetar as atividades dessas organelas. Além disso, ao contrário da medição da mitofagia com sensores genéticos, trabalhamos com vermes e células que sofreram fixação química. Portanto, é impossível continuar monitorando os mesmos vermes/células em momentos diferentes. Assim, recomenda-se a combinação de diferentes metodologias para validar a função da mitofagia em um determinado processo fisiológico. A seguir, apresentamos novos dados demonstrando que o VL-850 induz mitofagia robusta em vermes C. elegans e células Hep-3B. Portanto, esses dados apoiam ainda mais a hipótese de que o VL-850 estende a vida útil de C. elegans e protege C. elegans de danos oxidativos através da indução de mitofagia saudável . Utilizamos o ionóforo de prótons carbonil cianeto 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona (FCCP), que é um potente indutor de mitofagia²⁴, como controle positivo.

Protocolo

NOTA: Para maior comodidade dos leitores, dividimos o protocolo em duas partes: uma enfoca o protocolo de medição de mitofagia em C. elegans, e a outra foca o protocolo de medição de mitofagia em células hepáticas. A lista de materiais pode ser encontrada na Tabela de Materiais fornecidos.

1. O protocolo de C. elegans

1. Preparo das placas de meio de cultura do nematoide (NGM) e do estoque bacteriano OP50 de Escherichia coli
   OBS: A título de esclarecimento, embora tenhamos seguido protocolos padronizados para a preparação das placas NGM e estoque bacteriano OP5025,26^, reconhecemos que pode haver variações nesses protocolos entre diferentes laboratórios. Portanto, incluímos os protocolos completos para garantir a replicação precisa do experimento.
   1. Fazer um tampão fosfato de potássio 1 M, pH 6, adicionando ~150 mL de 1 M K 2 HPO 4 a 500 mL de 1 M KH₂PO₄ solução até atingir pH 6. Esterilize o tampão passando-o através de um filtro/sistema de armazenamento a vácuo de 0,22 μm.
   2. Fabricar 0,1 M de cloreto de cálcio (CaCl 2) e sulfato de magnésio (MgSO₄) e esterilizá-los com um filtro de seringa de_0,2 μm.
   3. Preparar 5 mg/mL de colesterol em etanol absoluto.
      NOTA: Como o colesterol é preparado em etanol, não o filtre.
   4. Preparar NGM-ágar dissolvendo 1,5 g de cloreto de sódio (NaCl), 1,25 g de peptona e 8,5 g de ágar em 500 mL de água bidestilada (DDW). Autoclave e deixe esfriar até ~55 °C.
   5. Em condições estéreis, adicionar 12,5 mL de tampão fosfato de potássio (pH 6), 0,5 mL de CaCl₂ 0,1 M, 0,5 mL de MgSO₄ 0,1 M e 1 mL de colesterol 5 mg/mL. Misture bem após cada adição.
   6. Adicionar 4 mL do ágar-NGM fundido a cada placa de 35 mm. Deixe os pratos durante a noite para solidificar à temperatura ambiente (RT, ~21 °C).
   7. Para fazer placas de ágar Luria-Bertani (LB), dissolver 5 g de NaCl, 5 g de triptona, 2,5 g de extrato de levedura e 7,5 g de ágar em 400 mL de água destilada e deionizada (DDW), ajustar o pH da solução para 7,0, levar o volume até 500 mL com DDW e autoclave. Uma vez arrefecida a solução a 55 °C, deite 25 ml da mistura em cada placa de Petri de 90 mm e deixe secar as placas durante 2 dias à temperatura ambiente. Em seguida, estique as bactérias OP50 nas placas de LB secas do estoque de glicerol e incube a 37 °C durante a noite para obter colônias únicas.
   8. Preparar 2x triptona de levedura (YT) dissolvendo 8 g de triptona, 5 g de extrato de levedura e 2,5 g de cloreto de sódio (NaCl) em 0,5 L de DDW. Ajuste o pH para 7 e autoclave.
   9. Após o resfriamento, inocular uma colônia de bactérias OP50 da placa LB recém-estriada em 50 mL de meio 2x YT em um frasco de Erlenmeyer de 250 mL. Agitar a 37 °C e 250 rpm até uma densidade óptica (OD₆₀₀) de aproximadamente 0,6.
2. Preparação do veículo e das placas experimentais
   1. Adicionar 100 μL de bactérias OP50 ao centro de cada placa de ágar-NGM de 35 mm. Secar durante a noite em RT (temperatura ambiente, 21 °C).
   2. Preparar 0,5 M VL-850 em DMSO e diluir para 10 mM VL-850 usando tampão M9 (22 mM KH 2 PO 4, 42 mM Na₂HPO 4, 86 mM NaCl, pH 7e 1 mM MgSO ₄)²⁶. Confirme se o pH é 7,0 (caso contrário, titular com HCl 0,1 M) e filtre e esterilize a solução com um filtro de seringa de 0,22 μm. Prepare o veículo como descrito acima, mas sem a droga (neste caso, VL-850). Fazer FCCP 50 mM em DMSO, diluir para FCCP 1 mM com tampão M9 e filtrar-esterilizar a solução com um filtro de seringa de 0,22 μm.
   3. Adicionar 25 μL de veículo (controle negativo), FCCP (controle positivo; 5 μM) ou VL-850 (tratamento experimental; 62,5 μM) às placas NGM semeadas separadamente no gramado bacteriano.
   4. Cubra as placas com papel alumínio e deixe-as secar em RT (temperatura ambiente, 21 °C). Use as placas após ~16 h.
3. Obtenção sincronizada de adultos jovens hermafroditas de C. elegans
   1. Faça 1 L de tampão M9 com 22 mM KH 2 PO 4, 42 mM Na₂HPO₄ e 86 mM NaCl. Esterilizar em autoclave e deixar esfriar. Uma vez resfriado, adicionar 1 mL de 1 mM de MgSO₄ (0,22 μm esterilizado por filtro).
   2. Misturar 0,8 ml de hidróxido de sódio a 2,5 N e 1 ml de uma solução a 5% de hipoclorito de sódio com 2,2 ml de DDW para criar 4 ml de solução alcalina de hipoclorito (concentração final de 0,5 N para hidróxido de sódio e 1,25% para hipoclorito de sódio).
   3. Coletar os vermes (hermafroditas gravídicos) em um tubo cônico de 15 mL lavando as placas de NGM com 1 mL de tampão M9 3x para garantir que todas as mães tenham sido coletadas no tubo.
   4. Sedimentar os vermes por centrifugação a 500 × g por 1 min e descartar o sobrenadante até restar um volume de 1 mL.
   5. Adicionar 1 mL de solução alcalina de hipoclorito e misturar invertendo o tubo 5x. Vórtice suavemente o tubo por 3 minutos para auxiliar a liberação de ovos e observe o estado dos vermes sob um estereoscópio dissecante.
   6. Quando aproximadamente 50% dos vermes estiverem quebrados, adicionar 5 mL de tampão M9 e sedimentar imediatamente os ovos centrifugando por 1 min a 500 × g.
   7. Retire o sobrenadante cuidadosamente sem perturbar o pellet. Adicionar 5 mL de tampão M9 e repetir o procedimento de lavagem 2x.
   8. Remova o sobrenadante até restar 2 mL e gire o tubo (rotação de 360°) a 20 rpm por ~16 h (TR, 21 °C) para obter larvas L1 sincronizadas. A partir deste tubo, pegue uma gota de 5 μL em uma lâmina de vidro, conte o número de larvas sob um estereoscópio, repita este passo 3x, faça uma média das três contagens e estime o número de vermes por microlitro (μL). Com base nesses cálculos, adicione ~200 larvas por placa NGM semeada com bactérias OP50.
   9. Cultivar as larvas L1 a 21 °C por ~48 h até a fase adulta jovem.
4. Tratamento medicamentoso e procedimento microscópico
   1. Coloque 100 vermes em cada uma das placas experimentais ou de controle. Certifique-se de que as placas negativas, positivas e experimentais contenham o veículo, 5 μM FCCP e 62,5 μM VL-850, respectivamente. Incubar a 21 °C durante 6 h.
   2. Use 1 mL de tampão M9 para lavar os vermes de cada placa em um tubo de microcentrífuga de 1,7 mL. Gire o tubo brevemente (~3 s) em uma minicentrífuga. Em seguida, descarte o sobrenadante pipetando o tampão M9 suavemente sem perturbar a pelota de verme. Repita este passo de lavagem 2x e, em seguida, remova suavemente o sobrenadante sem perturbar a pastilha de minhoca.
   3. Adicionar 200 μL de tampão M9, que contém 0,1% v/v Poloxamer 188, 0,1% v/v Pluronic F127 e 2 μL do reagente do kit de coloração, à pastilha de minhoca. Deixe a mistura girar a 20 rpm (rotação de 360°) por 1 h em RT (temperatura ambiente, 21 °C). Para proteger os corantes da luz, cubra os tubos com papel alumínio.
   4. Gire os vermes suavemente, conforme descrito na etapa 1.3.4. Em seguida, remova a solução de coloração sem perturbar a pastilha de verme. Em seguida, lave as minhocas conforme descrito na etapa 1.3.2 e transfira-as para uma placa de ágar-NGM semeada contendo o tratamento adequado - por exemplo, as minhocas tratadas com FCCP são transferidas para uma placa contendo FCCP. Cubra as placas com papel alumínio porque o reagente de coloração é sensível à luz.
      OBS: Transferimos os vermes para placas de cultura contendo bactérias e o agente de tratamento correspondente para minimizar o ruído de fundo devido ao excesso de corante. Por exemplo, vermes tratados com FCCP foram transferidos para placas suplementadas com FCCP, e assim por diante.
   5. Lave as minhocas das placas em tubos de microcentrífuga frescos usando 1 mL de tampão M9; Lave as minhocas da mesma maneira 2x. Em seguida, fixar os vermes com formol a 1% no gelo por 30 min e lavar os vermes com 1 mL de tampão M9 3x para remover o formaldeído residual. Após as lavagens, gire os vermes até um pellet e aspirar a quantidade máxima de sobrenadante, mantendo o pellet de verme intacto em 10 μL de M9.
   6. Para preparar a agarose a 2,5%, pesar 0,125 g de agarose num tubo de ensaio de vidro borossilicato de 10 ml, adicionar 5 ml de tampão M9 e dissolver a agarose aquecendo suavemente o tubo com um queimador de Bunsen. Transfira a agarose derretida para um banho seco regulado a 75 °C e, com uma ponta de 1 mL, coloque 100 μL da agarose derretida em um vidro de cobertura do microscópio Deckgläser (24 mm x 60 mm). Imediatamente, coloque outra lâmina perpendicularmente sobre a gota de agarose, formando uma forma de cruz. Aguarde ~2 min, e separe suavemente as lâminas empurrando (suavemente) o vidro da tampa superior, deixando assim a almofada de agarose na tampa inferior.
      NOTA: Tenha cuidado ao aquecer a agarose no tubo e certifique-se de que o tubo é mantido longe do corpo. Cortar a borda da ponta de 1 mL para minimizar a coagulação da agarose.
   7. Transfira os vermes para a almofada de agarose com uma pipeta de vidro Pasteur (ou seja, toda a quantidade no tubo, ~10 μL). Retire o excesso de líquido com um pavio feito de um lenço de laboratório e, em seguida, cubra as minhocas com uma lâmina de cobertura menor (24 mm x 40 mm). Aplique esmalte transparente na periferia da lâmina de cobertura menor para evitar a evaporação. Coloque o slide em uma caixa escura para protegê-lo da luz.
   8. Use um microscópio confocal para obter imagens dos vermes dentro de 24 h nos comprimentos de onda apropriados (veja abaixo) usando uma lente de aumento de 60x.
      1. Coloque a lâmina no palco do microscópio.
      2. Abra o software de imagem e clique com o botão direito do mouse na área cinza do software. Aquisição Aberta | Almofada Completa Ti2 | Aquisição ND | LUTs clicando nas opções no pop-up que surge como resultado do clique direito.
      3. Em Ti2 Full Pad, selecione 60x.
      4. Em Aquisição, selecione Ocular DIA e coloque os vermes em foco usando o botão de foco fino do microscópio. Em Aquisição, selecione Disco giratório e escolha a opção 16 bits - Sem binning. Para cada filtro de fluorescência, defina o Tempo de exposição para 500 ms e 20 ms para Brightfield. Depois que esses parâmetros estiverem definidos, selecione Executar agora e aguarde até que a imagem de saída seja gerada como um arquivo ND2.
         NOTA: O tempo de exposição precisa ser determinado experimentalmente, pois diferentes configurações de imagem têm características diferentes. Use tabelas de pesquisa (LUTs) para examinar a intensidade de fluorescência para cada comprimento de onda.
5. Análise das imagens
   1. Abra as imagens confocais (aqui, arquivos Nikon ND2) no ImageJ²⁷ com o plugin de colocalização. Cada arquivo ND contém planos de imagem obtidos em três comprimentos de onda (usando filtros DAPI, GFP/FITC [verde] e Texas Red [vermelho]) e luz visível. Para acessar essas imagens, abra o arquivo ND no servidor ImageJ e selecione Dividir imagens na caixa de diálogo. Trabalhe com imagens de campo brilhante (BF), canal verde e canal vermelho.
   2. Gere duplicatas dessas imagens para manter a imagem original intocada clicando em Imagem | Duplique ou use o atalho de teclado Shift + D.
   3. Para reduzir o plano de fundo, gere outra duplicata da imagem, como mencionado acima. Subtraia o plano de fundo com um raio de rolagem de 100 e selecione a opção Criar plano de fundo (não subtrair) para gerar uma imagem com o plano de fundo da imagem fornecida. Em seguida, vá para Processo | Calculadora de Imagem e subtraia a primeira imagem duplicada da segunda imagem duplicada. Use as imagens resultantes para a análise de colocalização.
   4. Para usar o plugin de colocalização, converta as imagens do canal verde e vermelho em 8 bits. Para isso, clique em Imagem | Tipo | 8 bits.
   5. Clique em Plugins | Colocalização. Para medir a colocalização de mitocôndrias e sinais lisossômicos usando o plugin de colocalização (veja acima), use os seguintes parâmetros: Razão = 75%, Canal vermelho limiar = 80,0, Canal verde limiar = 50,0. A saída é uma imagem binária de 8 bits contendo puncta colocalizado e uma combinação das três imagens de 8 bits (verde, vermelho e a imagem colocalizada) em uma imagem RGB.
   6. Concentre-se na puncta no músculo da parede do corpo da cabeça dos vermes selecionando manualmente esta área e criando uma máscara clicando em Editar | Seleção | Create Mask, que seleciona a região de interesse (Figura 2A, B). Remova seletivamente outras entidades coradas (por exemplo, os músculos faríngeos) para analisar a região muscular da parede do corpo da cabeça.
   7. Para selecionar as partículas na região de interesse (ROI), selecione as imagens de 8 bits e máscara colocalizadas usando a calculadora de imagens. Em seguida, use a operação AND (Figura 3A) para selecionar o ponto na ROI. Isso gera uma imagem com pontos na ROI (Figura 3B).
   8. Para analisar a área das mitocôndrias e lisossomos colocalizados, selecione Analisar | Analise as partículas e meça a soma dos pontos entre 0,1625 μm 2 e 4 μm².

2. O protocolo de células cancerosas Hep-3B

1. Preparando a solução estoque de medicamentos
   1. Preparar 100 mM VL-850 em DMSO. Diluir a 5 mM com tampão HEPES 0,5 M, pH 7,3, e esterilizar a solução com filtro de seringa de 0,22 μm. Em seguida, prepare o veículo como descrito anteriormente, mas sem a droga (neste caso, VL-850).
2. Cultura de células Hep-3B para experimento, tratamento medicamentoso e procedimento de microscopia
   1. Cultivar células Hep-3B em placas de cultura de tecidos de 10 cm contendo o meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) inativado pelo calor, 2% de L-glutamina e 1% de tetraciclina (doravante denominada DMEM completo). Incubar as células a 37 °C e 5% de CO₂.
   2. Escolha uma placa de células Hep-3B que exiba 70%-80% de confluência celular (fase logarítmica de crescimento), remova o meio e lave a placa com 5 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) pré-aquecida. Remover o PBS e incubar as células com 1 mL de tripsina 0,25% pré-aquecida/EDTA 0,02% por ~3 min a 37 °C; observar as células ao microscópio de cultura de tecidos (10x). Pare a digestão de tripsina quando as células se tornam redondas e comece a dissociar-se da placa adicionando 5 mL de DMEM completo. Centrifugar as células a 1.000 × g por 5 min, remover o sobrenadante e ressuspender as células em 5 mL de DMEM completo.
   3. Determine a concentração celular. Misturar 50 μL da suspensão celular com 50 μL de azul de tripano. Conte as células usando um contador de células automatizado ou usando um hemocitômetro 5x, e faça uma média dessas contagens para garantir a precisão das contagens.
   4. Semeando 42.000 células Hep3G em cada lâmina de μ de 8 poços em 400 μL de DMEM completo (conforme descrito acima). Incubar as células durante 24 h a 37 °C e 5% CO₂.
   5. Após 24 h com ~80%-85% de confluência, remova 250 μL de meio de cada um dos poços e adicione 50 μL de meio com o tratamento ou veículo apropriado. Para seguir este protocolo, tratar as células com 100 μM VL-850, 5 μM FCCP e um veículo como controle.
   6. Após 6 h de incubação com os compostos, adicionar 50 μL de meio a cada poço contendo o reagente corante (0,5 μL de corante para 250 μL em cada poço). Incubar as células com o corante durante 30 min a 37 °C e 5% de CO₂.
      NOTA: Como o reagente de coloração é sensível à luz, minimize a exposição à luz cobrindo as amostras com papel alumínio e trabalhando em um ambiente de pouca luz (se possível).
   7. Usando uma pipeta de 200 μL, remova suavemente todo o meio (250 μL) de cada poço e, em seguida, lave as células com 200 μL de PBS pré-aquecido.
   8. Fixar as células com 200 μL de solução fixadora contendo formaldeído a 4% e glutaraldeído a 2,5% preparada em PBS por 15 min em TR.
   9. Decantar a solução fixadora e lavar brevemente com 200 μL de PBS.
   10. Adicionar 200 μL de PBS, manter as células cobertas e protegidas da luz a 4 °C e imagem dentro de 24 h.
       OBS: Utilizamos o microscópio confocal de disco giratório em quatro canais, incluindo DIC, TRITC, FITC e DAPI, conforme passo 1.4.8. Obtivemos imagens de ~300 células por tratamento.
3. Análise das imagens
   1. Execute as etapas 1.5.1-1.5.5. Para obter a ROI das células, gere uma imagem que destaque a área das células. Para isso, escolha uma imagem de pontos colocalizados (RGB) (Figura 4A). Para selecionar toda a área da célula, selecione Processo | Binário | Crie Mask para obter uma imagem binária (Figura 4B). Para analisar a área da célula, selecione Analisar | Analise partículas e meça todas as partículas na imagem de 0 ao infinito, que é a configuração padrão para Analisar partículas.
   2. Para analisar a área das mitocôndrias e lisossomos colocalizados, selecione uma imagem colocalizada de 8 bits, converta-a em binária selecionando Processo | Binário | Tornar binário, selecione Analisar | Analise as partículas e meça a soma dos pontos entre 0,1625 μm 2 e 4 μm². Para medir os pontos colocalizados, divida a área das mitocôndrias e lisossomos colocalizados pela área celular total.

Resultados

Indução de uma resposta robusta de mitofagia em vermes C. elegans e células Hep-3B com VL-850
O VL-850 protege vermes C. elegans e queratinócitos humanos (células HaCaT) do estresse oxidativo²³. Para explorar melhor seu mecanismo de ação, examinamos se o VL-850 induz mitofagia em C. elegans e outras células humanas. Para testar isso, expomos vermes C. elegans (adultos jovens, 3 dias pós-L1) a 62,5 μM VL-850, 5 μM FCCP (controle positivo) e ve...

Discussão

Múltiplas vias de mitofagia envolvem várias proteínas e biomoléculas (por exemplo, cardiolipina²⁹). Entretanto, o desfecho dessas vias é semelhante, a degradação das mitocôndrias por enzimas lisossômicas^12,13. De fato, vários métodos utilizam esse desfecho para quantificar a mitofagia. No entanto, alguns métodos, como a microscopia eletrônica, exigem acesso a equipamentos caros, especialistas treinados e um tempo de preparação prolongado p...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagente ou recurso
Balança analítica	Mettler-Toledo
Bacto Agar	BD-Difco	214010
Bacto Peptona	BD-Difco	211677
Bacto Triptona	BD-Difco	211705
Extrato de levedura Bacto	BD-Difco	212750
Cloreto de cálcio	Sigma	C1016
Cianeto de carbonila 4- (trifluorometoxi) fenilhidrazona (FCCP)	Sigma	C2920
< forte > produtos químicos< / forte >
colesterol	Thermo Fisher	C / 5360/48
DMEM alta glicose	Indústrias biológicas	01-055-1A
Água destilada dupla (DDW)
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Biological Industries	02-023-1A
FBS inativado por calor	Invitrogen	M7514
Gluteradeído (25%)	Sigma	G5882
HEPES Buffer 1 M	Biological Industries	03-025-1B
L-gluatamina	Biological Industries	03-020-1B
Lisossomo/Mitocôndria/Coloração Nuclear Reagente Citopintor	Abcam	ab139487
Sulfato de Magnésio	Sigma	M7506
Nonidet P 40	Sigma	74385
Paraformalydehyde (16%)	Electron Microscopy Sciences	15720
Poloxamer 188 Solution	Sigma	P5556
Di-hidrogenofosfato de potássio	Millipore	1.04873.1000
Fosfato de potássio dibásico	Sigma	P3786
SeaKem LE Agarose	Lonza	50004
Cloreto de sódio	Bio-Lab	1903059100
Hidróxido de sódio	Gadot	1310732
Fosfato de sódio dibásico dodecahidratado	Sigma	4273
Cloridrato de tetraciclina	Sigma	87128-25G
Tripsina-EDTA	Biological Industries	03-052-1A
VL-850: 1,8-diaminooxi-octano	Patenteado
Vidro/Plástico Descartáveis
0,22 μ filtro de seringa Millex	GV	SLGV033RS
1,7 mL Tubos de Micro Centrífuga	Lifegene	LMCT1.7B-500
Placas de Petri de 10 cm	Corning	430167
1.000 mL Frasco Erlenmeyer	IsoLab, Alemanha
Tubo de polipropileno estéril de 15 mL	Lifegene	LTB15-500
Placas de Petri de 35 mm	Bar Naor
500  mL sistema de filtro de vácuo/garrafa de armazenamento, 0.22  μ m	Lifegene	LG-FPE205500S
Tubo de polipropileno estéril de 50 mL	Lifegene	LTB50-500
Deckglä ser Vidro de cobertura do microscópio 24 x 60 mm	Marienfeld	101152
Tubos de ensaio de vidro (10 mL- 13 x 100 mm) Vidro borossilicato	Pyrex	99445-13
iBiDi 8 lâminas de 8 poços	iBiDi	80826
Vidro de cobertura do microscópio 24 x 40 mm	Bar Naor	BN1052421ECALN
Fio de platina irídio 0,25 mM	Precision Instruments	PT1002
Instrumentoscontador de
células CellDrop BF	DeNovix	CellDrop BF-UNLTD
Microspin FV-2400	Biosan	BS-010201-AAA
Microscópio confocal de disco giratório Nikon Yokogawa W1 com filtros DAPI, FITC e TRITC e campo claro, com uma lente tipo CFI Plan-Apochromat Lambda de 60x (lente aérea) e software	NIS-ElementsNikon	CSU-W1
Olympus SZ61 microscópio estéreo	Olympus	SZ61
medidor de pH	Mettler-Toledo	MT30019032
Revólver Rotador de Laboratório Ajustável	Labnet	H5600