É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Enriquecimento de mRNA e preparação de bibliotecas de bissulfito-mRNA para sequenciamento de próxima geração

1.9K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/65352

⸱

7 de julho de 2023

 , 
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine, National Cheng Kung University

Neste artigo

Resumo

Este protocolo fornece um fluxo de trabalho fácil de seguir para conduzir a purificação de RNA poli(A), conversão de bissulfito e preparação de biblioteca usando equipamentos padronizados para uma amostra biológica de interesse.

Resumo

Modificações pós-transcricionais de RNA em vários tipos de transcritos de RNA estão associadas à regulação de diversos RNA em células eucarióticas. Modificações aberrantes do RNA 5-metilcitosina e a expressão desregulada de RNA metiltransferases têm se mostrado associadas a várias doenças, incluindo cânceres. O sequenciamento de bissulfito transdescritor largo foi desenvolvido para caracterizar as posições e os níveis quantitativos de metilação da citosina no RNA convertido em bissulfito na resolução do par de bases. Este protocolo apresenta os procedimentos de duas rodadas de purificação de RNA poli(A), três ciclos de reação de bissulfito e preparação de biblioteca em detalhes para permitir o mapeamento em todo o transcriptoma dos sítios de modificação do RNAm 5-metilcitosina. A avaliação da quantidade e qualidade do RNA após a reação principal é essencial para monitorar a integridade do RNA e é um passo crítico para garantir bibliotecas de sequenciamento de alta qualidade. O ideal é que os procedimentos possam ser concluídos em até três dias. Com este protocolo, o uso de RNA total de alta qualidade como entrada pode praticamente construir bibliotecas robustas de bissulfito-mRNA para sequenciamento de próxima geração a partir da amostra de interesse.

Introdução

Entre mais de 150 tipos de modificações pós-transcricionais1, a modificação da 5-metilcitosina (m5C) foi identificada em vários tipos de RNAs, incluindo RNA ribossomal, RNA de transferência, RNA mensageiro, micro RNA, RNA longo não codificante, RNA de abóbada, RNA intensificador e RNAs específicos do corpo cajalpequeno 2. O RNA m 5 C está associado a diversos mecanismos biológicos e patológicos, tais como regulação do desenvolvimento radicular de plantas3, expressão gênica viral4 e progressão do câncer5. O objetivo deste protocolo é fornecer pipelines simplificados para caracterizar o perfil de modificação do mRNA m5C do transcriptoma de amostras biológicas em diferentes estágios de desenvolvimento ou no cenário da doença. O sequenciamento transcriptoma-amplo de bissulfito foi desenvolvido para caracterizar as posições e os níveis quantitativos de metilação da citosina no RNA convertido em bissulfito na resolução do par de bases 6,7,8,9. Isto é particularmente útil quando se estuda a associação de m5C com a expressão gênica e o destino do RNA que está envolvido nos mecanismos biológicos regulatórios em células. Na célula de mamíferos, existem dois leitores m 5 C conhecidos: ALYREF pode reconhecer m 5 C no núcleo e serve como um transportador de núcleo de RNAm para citosol10, enquanto YBX1 pode reconhecer m5C no citoplasma e aumentar a estabilização de RNAm11. Foram relatados mRNAs5 Caberrantes relacionados a vias imunes em células T CD4+ do lúpus eritematoso sistêmico12. Estudos têm revelado associação entre modificação do RNAmm 5C e modulação da imunidade do câncer e progressão do câncer13,14. Assim, o mapeamento do perfil demodificação dom5 C no RNAm pode fornecer informações cruciais para elucidar o potencial maquinário regulatório.

Para investigar os papéis funcionais da modificação do RNAm 5 C sob certas condições biológicas, as abordagens baseadas na conversão de bissulfito (bsRNA-seq) e no enriquecimento por afinidade de anticorpos, como m 5 C-RIP-seq, miCLIP-seq e 5-Aza-seq, podem ser combinadas com a plataforma de sequenciamento de alto rendimento para fornecer detecção eficiente de regiões e sequências alvo com as modificações de m5C em uma escala de transcriptoma15, 16º. A vantagem deste protocolo fornece a paisagem abrangente do RNA m 5 C em uma resolução de base única, uma vez que a abordagem baseada no enriquecimento por afinidade de anticorpos depende da disponibilidade de anticorpos de alta qualidade e poderia alcançar a resolução de fragmentoúnico da paisagem de metilação de m5C17.

Todas as amostras de RNA serão processadas com duas rodadas de enriquecimento de RNAm usando esferas de oligo(dT), três ciclos de reação de bissulfito e a preparação da biblioteca de sequenciamento. Para monitorar a qualidade do RNA, cada amostra de RNA será examinada por eletroforese em gel capilar antes e após os procedimentos de purificação do RNAm e reação de bissulfito para avaliar a distribuição dos fragmentos. As bibliotecas purificadas serão examinadas por suas qualidades de amplificação de PCR, fragmentos de distribuição de tamanho de DNA por eletroforese em gel capilar e suas quantidades totais examinadas por ensaios quantitativos baseados em corantes de fluorescência antes do sequenciamento. O sistema também pode ser usado para analisar um amplo espectro de amostras biológicas, como produtos agrícolas, vírions isolados, linhagens celulares, organismos modelo e espécimes patológicos.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

1. Purificação do RNA poli(A)

NOTA: Use o RNA total tratado com DNase I e examine a qualidade e integridade do RNA total por eletroforese capilar ou gel convencional antes de proceder à purificação do RNA poli(A). Os investigadores devem ser capazes de identificar as bandas ribossomais 28S e 18S rRNA no campo de alto peso molecular e a banda 5.8S rRNA no campo de baixo peso molecular sem bandas de esfregaço significativas no eletroferograma. As etapas de purificação seguem essencialmente as instruções do fabricante, com pequenas modificações indicadas nas etapas específicas. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais e instrumentos utilizados neste protocolo.

  1. Preparação
    1. Aquecer o reagente, tampão de lavagem, esferas de oligo(dT) e tampão de lise à temperatura ambiente por 30 minutos antes de realizar os procedimentos a seguir.
    2. Para o isolamento de RNA enriquecido com poli(A), prepare 10-20 μg de uma alíquota de RNA total de alta qualidade como material de partida, transferindo uma quantidade adequada de RNA para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL livre de nuclease. Incubar no bloco de calor a 70 °C durante 5 minutos e, em seguida, manter no gelo durante 2 minutos.
      NOTA: As quantidades de ARN total como material de partida devem ser ajustadas adequadamente em função da quantidade desejada de ARNm e da natureza das células utilizadas. Empiricamente, o RNA enriquecido com poli(A) pode ser responsável por 1-5% de abundância no RNA total. Uma alíquota de 10 μg de RNA total de alta qualidade deve fornecer RNA enriquecido com poli(A) de alta qualidade na faixa de 100-500 ng para a conversão de bissulfito a jusante.
    3. Enquanto isso, ressuspenda totalmente as contas oligo(dT). Transfira as quantidades necessárias de suspensão de contas para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e, em seguida, coloque no ímã por 3 minutos até que as esferas magnéticas formem um grânulo.
      NOTA: Use 50 μL de esferas oligo(dT) para 10 μg de entrada total de RNA. O volume de contas nesta etapa pode ser ainda mais otimizado dependendo das células usadas.
    4. Retire o sobrenadante e ressuspenda as esferas oligo(dT) com quantidades iguais (o volume da suspensão de esferas utilizada na etapa 1.1.3.) do tampão de lise e coloque no íman durante 3 minutos antes de remover o sobrenadante.
      OBS: Não seque demais as contas; O usuário deve avançar rapidamente para a etapa 1.2.1.
  2. A primeira rodada de purificação
    1. Adicione tampão de lise ao tubo de amostra de RNA (relação de volume 4:1) e misture completamente antes de transferir para as esferas de oligo(dT).
      NOTA: Se o volume da amostra de ARN for de 20 μL, adicione 80 μL de tampão de lise.
    2. Ressuspenda totalmente a mistura de RNA: tampão de lise e esferas de oligo(dT) pipetando pelo menos 10x.
    3. Deixar incubar as amostras com rotação contínua durante 15 min à temperatura ambiente.
    4. Colocar a amostra no íman durante 5 min ou até que o sobrenadante esteja límpido; Descarte o sobrenadante.
    5. Adicione 600 μL de Wash Buffer 1 às contas e misture cuidadosamente para ressuspender as contas.
    6. Colocar o tubo sobre o íman durante 5 minutos ou até que o sobrenadante esteja límpido, elimine o sobrenadante e repita o passo de lavagem 1.2.5 uma vez.
    7. Lave as contas adicionando 300 μL de Wash Buffer 2 e ressuspenda suavemente as contas.
    8. Colocar o tubo no iman durante 5 minutos ou até que o sobrenadante esteja límpido, eliminar o sobrenadante e repetir o passo de lavagem 1.2.7 uma vez.
    9. Adicionar 30 μL de Tris-HCl (tampão de eluição) a frio de 10 mM ao tubo de amostra e incubar a 70 °C durante 5 minutos.
    10. Transfira rapidamente o tubo para o ímã e, quando a suspensão estiver límpida após 20 s ou mais, transfira o sobrenadante contendo RNA enriquecido com poli(A) eluído para o novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
  3. A segunda rodada de purificação
    1. Adicionar 120 μL (4x o volume da amostra eluída) tampão de lise à amostra de RNA eluída e misturar completamente.
    2. Lave as contas usadas na primeira rodada de purificação com uma quantidade igual de tampão de lise como etapa 1.1.4, pipetar 10x para ressuspender as contas e, em seguida, colocá-las no ímã por 5 min antes de descartar o sobrenadante.
    3. Transfira a mistura de RNA: tampão de lise para as esferas lavadas e misture completamente pipetando pelo menos 10x.
    4. Incubar a amostra com rotação contínua durante 15 min à temperatura ambiente.
    5. Repita as etapas 1.2.4 a 1.2.8 para remover o sal e outros subtipos de RNA.
      NOTA: O volume do tampão de lavagem pode ser reduzido para 300 μL de tampão de lavagem 1 e 150 μL de tampão de lavagem 2.
    6. Adicionar 25 μL (volume desejado) de Tris-HCl (tampão de eluição) a frio de 10 mM ao tubo de amostra e incubar a 70 °C durante 5 minutos.
    7. Transfira rapidamente o tubo para o ímã e, quando a suspensão estiver límpida após 20 s ou mais, transfira o sobrenadante contendo RNA enriquecido com poli(A) eluído para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
    8. Transferir tubos de 2,2 μL para 8 tiras para avaliação da qualidade da quantidade e qualidade do RNA usando ensaios de alta sensibilidade de RNA.
    9. Conservar a amostra a -20 °C por curtos períodos e -70 °C por um período mais longo.
      Observação : isso pode ser um ponto de pausa no protocolo.

2. Conversão de bissulfito

OBS: As etapas de centrifugação foram todas realizadas à temperatura ambiente. Os procedimentos são essencialmente realizados de acordo com as instruções do fabricante, mas com uma etapa adicional 2.2 para adicionar a(s) sequência(s) de mRNA de controle spike-in antes da etapa 2.3 da reação de bissulfito.

  1. Transfira 19 μL de amostra purificada de RNA enriquecido com poli(A) para um tubo de 8 tiras de 0,2 mL.
  2. Adicionar 1,0 μL de controle spike-in, que está livre de quaisquer modificações na razão de quantidade predeterminada de 1:10.000 (ou seja, 0,1 ng de mRNA de luciferase: 1 μg de RNA purificado enriquecido com poli(A) na amostra de RNA da etapa 2.1.
    NOTA: A sequência de controle de spike-in pode ser Firefly luciferase RNA, Renilla luciferase, ou sequência de RNA transcrito in vitro sem citosinas metiladas.
  3. Adicione 130 μL de regente de conversão ao tubo e inverta suavemente várias vezes para uma mistura completa.
  4. Coloque o tubo na máquina de PCR e execute três ciclos de aquecimento a 70 °C por 10 min, seguido de incubação a 64 °C por 45 min cada e, em seguida, uma etapa final para resfriar até 4 °C.
  5. Coloque a coluna no tubo de coleta e transfira 250 μL de tampão de ligação de RNA para a coluna.
  6. Transferir a amostra do passo 2.4 para a coluna do passo 2.5 e pipetar completamente.
  7. Adicione 400 μL de 95-100% de etanol à coluna, feche rapidamente a tampa e inverta várias vezes.
  8. Centrifugar a 10.000 × g por 30 s a 25 °C e descartar o fluxo.
  9. Adicionar 200 μL de tampão de lavagem de RNA à coluna.
  10. Centrifugar a 10.000 × g por 30 s a 25 °C e descartar o fluxo.
  11. Adicionar 200 μL de tampão de dessulfonação e incubar à temperatura ambiente durante 30 minutos.
  12. Centrifugar a 10.000 × g por 30 s a 25 °C e descartar o fluxo.
  13. Adicionar 400 μL de tampão de lavagem de ARN e centrifugar a 10.000 × g durante 30 s a 25 °C e eliminar o fluxo. Repita esta etapa uma vez.
  14. Centrifugar novamente a 10.000 × g durante 2 min a 25 °C para remover completamente o tampão de lavagem residual.
    NOTA: O outro passo de centrifugação 2.14 durante 2 minutos antes da eluição é remover completamente o tampão de lavagem. A etapa de lavagem é realizada duas vezes para lavar o componente com alto teor de sal do reagente de bissulfito e o tampão de dessulfonação na coluna.
  15. Transfira a coluna para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
  16. Adicionar 20-30 μL de H2O sem nuclease à coluna e repousar à temperatura ambiente durante 1 min.
  17. Centrifugar a 10.000 × g por 30 s a 25 °C.
  18. Transferir 2,2 μL para tubos de 8 tiras para a avaliação da quantidade e qualidade do RNA.
  19. Conservar a amostra de ARN tratada com bissulfito a -20 °C por curtos períodos e -70 °C por um período mais longo.
    Observação : isso pode ser um ponto de pausa no protocolo.

3. Preparação da biblioteca de mRNA tratada com bissulfito

NOTA: Siga a seção 4 do protocolo de instrução de preparação da biblioteca para uso com mRNA purificado ou RNA depletado. O primeiro priming deve seguir o protocolo de RNA FFPE, uma vez que o tratamento com bissulfito fragmenta o RNA. Execute cada etapa na capela de fluxo laminar e adicione a mistura de reação em um rack de resfriamento refrigerado por gelo.

  1. Priming do RNA de entrada
    1. Transfira a quantidade desejada de amostra de mRNA tratada com bissulfito em um máximo total de 5 μL ou adicione H2O livre de nuclease para fazer um total de 5 μL.
      NOTA: Um mínimo de 10 ng de mRNA tratado com bissulfito como entrada é recomendado para este tipo de preparação de biblioteca de RNA e para gerar a molaridade final do produto de biblioteca de 4nM.
    2. Adicionar 1 μL de primer aleatório (lilás) à amostra e misturar por pipetagem.
    3. Colocar o tubo de amostra na máquina de PCR preajustada a 65 °C e tampar a 105 °C durante 5 min e segurar a 4 °C.
  2. Síntese de cDNA de primeira fita
    1. Adicionar 4 μL de tampão de reação de síntese (lilás), 8 μL de reagente de especificidade de fita (marrom) e 2 μL de mistura enzimática de síntese (marrom) à amostra, o que perfaz um volume total de 20 μL. Misture bem pipetando pelo menos 10x e gire rapidamente para baixo.
    2. Colocar o tubo de amostra na máquina de PCR predefinida a 25 °C durante 10 min, 42 °C durante 50 min, 70 °C durante 15 min e segurar a 4 °C.
      NOTA: Para pastilhas acima de 200 bases, sugere-se um período de incubação de 42 °C de 50 min; para o tamanho da pastilha inferior a 200 bases, sugere-se um período de incubação de 42 °C de 15 min.
  3. Síntese de cDNA de segunda fita
    1. Adicionar 8 μL de tampão de reação de síntese com mistura de dUTP (laranja), 4 μL de mistura de enzimas de síntese (laranja) e 48 μL de H2O livre de nuclease. Misture completamente pipetando pelo menos 10x e gire rapidamente para baixo.
    2. Colocar o tubo de amostra na máquina de PCR preajustada a 16 °C durante 1 h com a tampa afastada ou ≤40 °C.
  4. Purificação de cDNA de fita dupla com esferas de purificação de DNA
    1. Pré-aqueça as contas de purificação de DNA 30 minutos antes de realizar a purificação e vórtice para ressuspender as contas.
    2. Adicionar 144 μL de contas de purificação de ADN ressuspensas à amostra de cADN do passo 3.3.2 e misturar cuidadosamente pipetando pelo menos 10x.
    3. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
    4. Coloque o tubo de amostra em um rack magnético por 5 min até que a solução esteja límpida e, em seguida, remova o sobrenadante e mantenha as esferas que contêm DNA.
    5. Adicionar 200 μL de etanol 80% recém-feito ao tubo com as contas, mantendo a amostra no rack magnético e incubar à temperatura ambiente por 30 s.
    6. Retire o sobrenadante e repita o passo 3.4.5 uma vez, mas desta vez remova cuidadosamente todo o sobrenadante residual.
    7. Seque as contas ao ar por 1-5 min, mantendo a amostra no ímã.
      OBS: Não seque demais as contas; A cor deve ser marrom escuro.
    8. Remova a amostra do rack magnético e elute o DNA adicionando 53 μL de tampão 0,1x TE (10 mM Tris-HCl e 1 mM EDTA, pH 8,0) às contas. Misture bem pipetando pelo menos 10x e incube à temperatura ambiente durante 2 min.
    9. Coloque o tubo no rack magnético por 5 min ou até que a solução esteja límpida.
    10. Transferir 50 μL de sobrenadante contendo cDNA de fita dupla para um novo tubo de 8 tiras.
      NOTA: O protocolo pode ser interrompido neste ponto e a amostra pode ser armazenada a -30 °C.
  5. Preparação final da biblioteca de cDNA
    1. Adicionar 7 μL de tampão de reação de polimento final (verde) e 3 μL de mistura enzimática de polimento final (verde) à amostra de cDNA de fita dupla eluída.
    2. Misture a mistura pipetando 10x com uma configuração de volume de 50 μL sem criar bolhas e, em seguida, gire rapidamente a amostra.
    3. Colocar a amostra numa máquina de PCR e incubar a 20 °C durante 30 min, 65 °C durante 30 minutos e segurar a 4 °C.
  6. Ligadura do adaptador
    1. Diluir o adaptador (vermelho) de acordo com as instruções do fabricante.
    2. Adicionar 2,5 μL do adaptador diluído, 1 μL de intensificador de ligadura (vermelho) e 30 μL de Ligation Master Mix (vermelho) à amostra.
    3. Misture a mistura pipetando 10x com uma configuração de volume de 80 μL sem criar bolhas e, em seguida, gire rapidamente a amostra.
    4. Colocar a amostra numa máquina de PCR e incubar a 20 °C durante 15 minutos.
    5. Adicionar 3 μL da mistura de uracila DNA glicosilase e DNA glicosilase-liase endonuclease VIII (azul) à amostra e pipetar completamente.
    6. Recolocar a amostra na máquina de PCR e incubar a 37 °C durante 15 min com a tampa regulada para 75 °C.
  7. Purificação de cDNAs tratados com reação de ligadura
    NOTA: A seleção de tamanho com contas SPRIselect ou, opcionalmente, com contas AMpure XP pode ser usada para essa finalidade18.
    1. Pré-aqueça as contas 30 min antes de realizar a purificação e vórtice para ressuspendê-las.
    2. Transferir 25 μL de contas ressuspensas para a amostra de cDNA a partir do passo 3.6.6 e misturar cuidadosamente pipetando pelo menos 10x.
    3. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
    4. Coloque o tubo de amostra em um rack magnético por 5 min até que a solução esteja límpida e, em seguida, transfira o sobrenadante para um novo tubo de 8 tiras e descarte as contas.
    5. Adicionar 10 μL de contas ressuspensas ao sobrenadante e misturar cuidadosamente pipetando pelo menos 10x.
    6. Coloque o tubo de amostra num rack magnético durante 5 minutos até que a solução esteja límpida e, em seguida, elimine o sobrenadante e não perturbe as contas.
    7. Adicionar 200 μL de etanol 80% recém-feito ao tubo com as contas, mantendo a amostra no rack magnético e incubar à temperatura ambiente por 30 s.
    8. Remova o sobrenadante e repita o passo 3.7.7 uma vez, mas desta vez remova cuidadosamente todo o sobrenadante residual.
    9. Seque as contas ao ar por 1-5 min, mantendo a amostra no ímã.
      OBS: Não seque demais as contas; A cor deve ser marrom escuro.
    10. Remova a amostra do rack magnético e elimine o DNA adicionando 17 μL de tampão 0,1x TE às contas. Misture bem pipetando pelo menos 10x e incube à temperatura ambiente durante 2 min.
    11. Coloque o tubo no rack magnético por 5 min até que a solução esteja límpida.
    12. Transferir 15 μL de sobrenadante, que contém dsDNA preparado para o alvo para um novo tubo de 8 tiras.
  8. Enriquecimento por PCR de DNA ligado a adaptadores
    1. Adicionar 25 μL da mistura principal (azul), 5 μL do primer adaptador de 5' e 5 μL do primer do adaptador de 3' à amostra de ADN ligada ao adaptador. Misture bem pipetando pelo menos 10x.
    2. Colocar a amostra na máquina de PCR e realizar a amplificação da PCR seguindo os seguintes passos: (1) 98 °C por 30 s, (2) 98 °C por 10 s, (3) 65 °C por 75 s, (4) 65 °C por 5 min e (5) segurar a 4 °C; em que os passos (2) e (3) devem repetir-se para um número de ciclo N+2 em que N é igual à quantidade de RNA de entrada no manual de instruções. Isso significa que 2 ciclos adicionais são necessários devido à seleção de tamanho de dupla face das amostras realizada na etapa 3.7.
      NOTA: Por exemplo, 8 ng da entrada de mRNA purificada seriam recomendados com 9-10 ciclos de PCR; mas com cDNA ligado, selecionado em tamanho duplo, na etapa 3.7, o ciclo de PCR recomendado seria de 11-12 ciclos.
  9. Purificação de bibliotecas amplificadas por PCR
    1. Pré-aqueça as contas de purificação de DNA por 30 minutos antes de realizar a purificação e o vórtice para ressuspender as contas.
    2. Transferir 45 μL (0,9x) de contas ressuspensas para o produto de PCR a partir da etapa 3.8.2 e misturar completamente pipetando pelo menos 10x.
    3. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
    4. Coloque o tubo de amostra em um rack magnético por 5 min até que a solução esteja límpida e, em seguida, remova o sobrenadante e mantenha as contas que contêm DNA.
    5. Adicione 200 μL de etanol 80% recém-feito ao tubo com as contas, deixe a amostra no rack magnético e deixe repousar à temperatura ambiente por 30 s.
    6. Retire o sobrenadante e repita o passo 3.9.5 uma vez, mas desta vez remova cuidadosamente todo o sobrenadante residual.
    7. Seque as contas ao ar por 1-5 min, mantendo a amostra no ímã.
      OBS: Não seque demais as contas; A cor deve ser marrom escuro.
    8. Retire a amostra do rack magnético e adicione 22 μL de tampão 0,1x TE às esferas para eluir o DNA. Misture bem pipetando pelo menos 10x e incube à temperatura ambiente durante 2 min.
    9. Coloque o tubo no rack magnético e deixe-o repousar por 5 min ou até que a solução esteja límpida à temperatura ambiente.
    10. Transfira 20 μL de sobrenadante para um novo tubo de 8 tiras.
    11. Transferir tubos de 2,2 μL para 8 tiras para avaliação da qualidade da quantidade e qualidade da biblioteca.
      NOTA: A quantidade da biblioteca também pode ser detectada por qPCR (consulte a Tabela de Materiais).
    12. Conservar a amostra da biblioteca bsRNA-seq a -20 °C.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Uma série de bibliotecas bsRNA-seq de linhagens celulares19 foi gerada seguindo os procedimentos deste relatório (Figura 1). Após purificação total do RNA acompanhada do tratamento com DNase realizado em amostras de linhagem celular e a qualidade verificada por eletroforese em gel e espectrofotometria UV-Vis (A260/A280), a amostra de RNA pode prosseguir para o enriquecimento de RNA poli(A). Para determinar se a purificação dupla poderia remover a maio...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Neste protocolo, um pipeline detalhado de enriquecimento de poli(A), conversão de bissulfito e preparação de bibliotecas foi obtido utilizando componentes padronizados. Análises posteriores de sequenciamento forneceram a identificação do RNAm 5-metilcitosina nas amostras de interesse.

A etapa crítica é a qualidade do material de partida - RNA total - uma vez que a degradação do RNA impactaria a taxa de recuperação da purificação do RNA poli(A). A amostra deve ser cuidadosamente manuseada e a c...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Conselho Nacional de Ciência e Tecnologia de Taiwan. [NSTC 111-2314-B-006-003]

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Sistema de bioanalisador de eletroforese Agilent 2100Agilent, Santa Clara, CADetecção de qualidade de RNA
Grânulos AMpure XPBeckman CoulterA63881purificar
DNA Bioanalyzer DNA kit de alta sensibilidadeAgilent, Santa Clara, CA5067-4626 Detecção dequalidade de DNA
Bioanalyzer RNA 6000 Pico kitAgilent, Santa Clara, CA5067-1513RNA detecção de qualidade
DiaMag02 - rack magnéticoDiagenode, Denville, NJB04000001auxiliar na preparação da biblioteca
DiaMag1.5 - rack magnéticoDiagenode, Denville, NJB04000003auxiliar a purificação de RNA poli(A)
Kit de purificação Dynabeads mRNA DIRECTThermo Fisher Scientific, Waltham, MA61011purificação de RNA poli(A); Tampão de Lavagem 1 e Tampão de Lavagem 2
EtanolJ.T.Baker64-17-5
Kit de metilação de RNA EZZymo, Irvine, CAbissulfitoR5002
Firefly luciferase mRNAPromega, Madison, WI, EUAL4561pico na seqüência de controle 
Kits de quantificação da biblioteca KAPARoche, SuíçaQuantificação da bibliotecaKK4824
Espectrofotômetro NanodropThermo Fisher Scientific, Waltham, MADetecção total da quantidade de RNA
NEBNext multiplex Oligos para illumina (índice Primer set1)New England Biolabs, Ipswich, MAPreparação da
biblioteca E7335SNEBNext Ultra figure-materials-1 Kit de Preparação de Biblioteca de RNA Direcional para IlluminaNew England Biolabs, Ipswich, MAE7760S
preparação de biblioteca Água livre de nucleaseThermo Fisher ScientificAM9932
P2 pipetmanThermo Fisher Scientific, Waltham, MA4641010
Qubit 2.0 fluorômetro Thermo Fisher Scientific, Waltham, MADetecção de quantidade de RNA
Qubit dsDNA HS Assay KitThermo Fisher Scientific, Waltham, MAQ32854Detecção de quantidade de DNA
Qubit RNA HS Assay KitThermo Fisher Scientific, Waltham, MAQ32852Detecção de quantidade de RNA
Tratamento com

Referências

  1. Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2021 update. Nucleic Acids Research. 50, D231-D235 (2022).
  2. Bohnsack, K. E., Höbartner, C., Bohnsack, M. T. Eukaryotic 5-methylcytosine (m5C) RNA Methyltransferases: Mechanisms, Cellular Functions, and Links to Disease. Genes. 10 (2), 102(2019).
  3. Shinde, H., Dudhate, A., Kadam, U. S., Hong, J. C. RNA methylation in plants: An overview. Frontiers in Plant Science. 14, 1132959(2023).
  4. Courtney, D. G., et al. Epitranscriptomic addition of m5C to HIV-1 transcripts regulates viral gene expression. Cell Host & Microbe. 26 (2), 217-227 (2019).
  5. Jonkhout, N., et al. The RNA modification landscape in human disease. RNA. 23 (12), 1754-1769 (2017).
  6. Legrand, C., et al. Statistically robust methylation calling for whole-transcriptome bisulfite sequencing reveals distinct methylation patterns for mouse RNAs. Genome Research. 27 (9), 1589-1596 (2017).
  7. Schaefer, M. RNA 5-methylcytosine analysis by bisulfite sequencing. Methods in Enzymology. 560, 297-329 (2015).
  8. Amort, T., et al. Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain. Genome Biology. 18 (1), 1(2017).
  9. Schumann, U., et al. Multiple links between 5-methylcytosine content of mRNA and translation. BMC Biology. 18 (1), 40(2020).
  10. Yang, X., et al. 5-Methylcytosine promotes mRNA export - NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader. Cell Research. 27, 606(2017).
  11. Chen, X., et al. 5-Methylcytosine promotes pathogenesis of bladder cancer through stabilizing mRNAs. Nature Cell Biology. 21 (8), 978-990 (2019).
  12. Guo, G., et al. Disease activity-associated alteration of mRNA m(5) C methylation in CD4(+) T cells of systemic lupus erythematosus. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8 (5), 430(2020).
  13. Song, H., et al. Biological roles of RNA m5C modification and its implications in cancer immunotherapy. Biomarker Research. 10 (1), 15(2022).
  14. Xue, C., Zhao, Y., Li, L. Advances in RNA cytosine-5 methylation: detection, regulatory mechanisms, biological functions and links to cancer. Biomarker Research. 8 (1), 43(2020).
  15. Helm, M., Motorin, Y. Detecting RNA modifications in the epitranscriptome: predict and validate. Nature Reviews Genetics. 18 (5), 275-291 (2017).
  16. Guo, G., et al. Advances in mRNA 5-methylcytosine modifications: Detection, effectors, biological functions, and clinical relevance. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 26, 575-593 (2021).
  17. Saplaoura, E., Perrera, V., Colot, V., Kragler, F. Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (159), e61231(2020).
  18. Quail, M. A., Swerdlow, H., Turner, D. J. Improved protocols for the illumina genome analyzer sequencing system. Current Protocols in Human Genetics. , Chapter 18, Unit 18.12 (2009).
  19. Chen, S. -Y., et al. RNA bisulfite sequencing reveals NSUN2-mediated suppression of epithelial differentiation in pancreatic cancer. Oncogene. 41 (22), 3162-3176 (2022).
  20. Squires, J. E., et al. Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA. Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).
  21. Han, X., et al. Dynamic DNA 5-hydroxylmethylcytosine and RNA 5-methycytosine reprogramming during early human development. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. , (2022).
  22. Amort, T., et al. Long non-coding RNAs as targets for cytosine methylation. RNA biology. 10 (6), 1003-1008 (2013).
  23. Sun, Z., et al. Effects of NSUN2 deficiency on the mRNA 5-methylcytosine modification and gene expression profile in HEK293 cells. Epigenomics. 11 (4), 439-453 (2019).
  24. Huang, T., Chen, W., Liu, J., Gu, N., Zhang, R. Genome-wide identification of mRNA 5-methylcytosine in mammals. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (5), 380-388 (2019).
  25. Rieder, D., Amort, T., Kugler, E., Lusser, A., Trajanoski, Z. meRanTK: methylated RNA analysis ToolKit. Bioinformatics. 32 (5), 782-785 (2015).
  26. Kraus, A. J., Brink, B. G., Siegel, T. N. Efficient and specific oligo-based depletion of rRNA. Scientific Reports. 9 (1), 12281(2019).
  27. Edelheit, S., Schwartz, S., Mumbach, M. R., Wurtzel, O., Sorek, R. Transcriptome-wide mapping of 5-methylcytidine RNA modifications in bacteria, archaea, and yeast reveals m(5)C within archaeal mRNAs. PLoS Genetics. 9 (5), e1003602(2013).
  28. Furlan, M., et al. Computational methods for RNA modification detection from nanopore direct RNA sequencing data. RNA Biology. 18, 31-40 (2021).
  29. Leger, A., et al. RNA modifications detection by comparative Nanopore direct RNA sequencing. Nature Communications. 12 (1), 7198(2021).
  30. Mateos, P. A., et al. Identification of m6A and m5C RNA modifications at single-molecule resolution from Nanopore sequencing. bioRxiv. , (2022).
  31. Johnson, Z., Xu, X., Pacholec, C., Xie, H. Systematic evaluation of parameters in RNA bisulfite sequencing data generation and analysis. NAR Genomics and Bioinformatics. 4 (2), 045(2022).
  32. Zhang, Z., et al. Systematic calibration of epitranscriptomic maps using a synthetic modification-free RNA library. Nature Methods. 18 (10), 1213-1222 (2021).
  33. Chao, H. -P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571(2019).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Sequenciamento de RNA por BissulfitoMetila o de RNAModifica o de 5 MetilcitosinaRNA MetiltransferasePurifica o de RNA Poly AMetila o de CitosinaIntegridade do RNAC ncer Pancre tico
Enriquecimento de mRNA e preparação de bibliotecas de bissulfito-mRNA para sequenciamento de próxima geração
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.