Enriquecimento de mRNA e preparação de bibliotecas de bissulfito-mRNA para sequenciamento de próxima geração

Resumo

Este protocolo fornece um fluxo de trabalho fácil de seguir para conduzir a purificação de RNA poli(A), conversão de bissulfito e preparação de biblioteca usando equipamentos padronizados para uma amostra biológica de interesse.

Resumo

Modificações pós-transcricionais de RNA em vários tipos de transcritos de RNA estão associadas à regulação de diversos RNA em células eucarióticas. Modificações aberrantes do RNA 5-metilcitosina e a expressão desregulada de RNA metiltransferases têm se mostrado associadas a várias doenças, incluindo cânceres. O sequenciamento de bissulfito transdescritor largo foi desenvolvido para caracterizar as posições e os níveis quantitativos de metilação da citosina no RNA convertido em bissulfito na resolução do par de bases. Este protocolo apresenta os procedimentos de duas rodadas de purificação de RNA poli(A), três ciclos de reação de bissulfito e preparação de biblioteca em detalhes para permitir o mapeamento em todo o transcriptoma dos sítios de modificação do RNAm 5-metilcitosina. A avaliação da quantidade e qualidade do RNA após a reação principal é essencial para monitorar a integridade do RNA e é um passo crítico para garantir bibliotecas de sequenciamento de alta qualidade. O ideal é que os procedimentos possam ser concluídos em até três dias. Com este protocolo, o uso de RNA total de alta qualidade como entrada pode praticamente construir bibliotecas robustas de bissulfito-mRNA para sequenciamento de próxima geração a partir da amostra de interesse.

Introdução

Entre mais de 150 tipos de modificações pós-transcricionais¹, a modificação da 5-metilcitosina (m⁵C) foi identificada em vários tipos de RNAs, incluindo RNA ribossomal, RNA de transferência, RNA mensageiro, micro RNA, RNA longo não codificante, RNA de abóbada, RNA intensificador e RNAs específicos do corpo cajal^{pequeno 2}. O RNA m 5 C está associado a diversos mecanismos biológicos e patológicos, tais como regulação do desenvolvimento radicular de plantas³, expressão gênica viral⁴ e progressão do câncer⁵. O objetivo deste protoco....

Protocolo

1. Purificação do RNA poli(A)

NOTA: Use o RNA total tratado com DNase I e examine a qualidade e integridade do RNA total por eletroforese capilar ou gel convencional antes de proceder à purificação do RNA poli(A). Os investigadores devem ser capazes de identificar as bandas ribossomais 28S e 18S rRNA no campo de alto peso molecular e a banda 5.8S rRNA no campo de baixo peso molecular sem bandas de esfregaço significativas no eletroferograma. As etapas de purificação seguem essencialmente as instruções do fabricante, com pequenas modificações indicadas nas etapas específicas. Consulte a Tabela de Materiais par....

Resultados

Uma série de bibliotecas bsRNA-seq de linhagens celulares¹⁹ foi gerada seguindo os procedimentos deste relatório (Figura 1). Após purificação total do RNA acompanhada do tratamento com DNase realizado em amostras de linhagem celular e a qualidade verificada por eletroforese em gel e espectrofotometria UV-Vis (A260/A280), a amostra de RNA pode prosseguir para o enriquecimento de RNA poli(A). Para determinar se a purificação dupla poderia remover a maio.......

Discussão

Neste protocolo, um pipeline detalhado de enriquecimento de poli(A), conversão de bissulfito e preparação de bibliotecas foi obtido utilizando componentes padronizados. Análises posteriores de sequenciamento forneceram a identificação do RNAm 5-metilcitosina nas amostras de interesse.

A etapa crítica é a qualidade do material de partida - RNA total - uma vez que a degradação do RNA impactaria a taxa de recuperação da purificação do RNA poli(A). A amostra deve ser cuidadosamente manuseada e a c.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sistema de bioanalisador de eletroforese Agilent 2100	Agilent, Santa Clara, CA		Detecção de qualidade de RNA
Grânulos AMpure XP	Beckman Coulter	A63881	purificar
DNA Bioanalyzer DNA kit de alta sensibilidade	Agilent, Santa Clara, CA	5067-4626 Detecção de	qualidade de DNA
Bioanalyzer RNA 6000 Pico kit	Agilent, Santa Clara, CA	5067-1513	RNA detecção de qualidade
DiaMag02 - rack magnético	Diagenode, Denville, NJ	B04000001	auxiliar na preparação da biblioteca
DiaMag1.5 - rack magnético	Diagenode, Denville, NJ	B04000003	auxiliar a purificação de RNA poli(A)
Kit de purificação Dynabeads mRNA DIRECT	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	61011	purificação de RNA poli(A); Tampão de Lavagem 1 e Tampão de Lavagem 2
Etanol	J.T.Baker	64-17-5
Kit de metilação de RNA EZ	Zymo, Irvine, CA	bissulfito	R5002
Firefly luciferase mRNA	Promega, Madison, WI, EUA	L4561	pico na seqüência de controle
Kits de quantificação da biblioteca KAPA	Roche, Suíça	Quantificação da biblioteca	KK4824
Espectrofotômetro Nanodrop	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA		Detecção total da quantidade de RNA
NEBNext multiplex Oligos para illumina (índice Primer set1)	New England Biolabs, Ipswich, MA	Preparação da
biblioteca E7335SNEBNext Ultra Kit de Preparação de Biblioteca de RNA Direcional para Illumina	New England Biolabs, Ipswich, MA	E7760S
preparação de biblioteca Água livre de nuclease	Thermo Fisher Scientific	AM9932
P2 pipetman	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	4641010
Qubit 2.0 fluorômetro	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA		Detecção de quantidade de RNA
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	Q32854	Detecção de quantidade de DNA
Qubit RNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	Q32852	Detecção de quantidade de RNA

Tratamento com