Um sistema normotérmico ex vivo de perfusão hepática (NEVLP) foi criado para fígados de camundongos. Este sistema requer experiência em microcirurgia, mas permite resultados reprodutíveis de perfusão. A capacidade de utilizar fígados de camundongos facilita a investigação de vias moleculares para identificar novos aditivos de perfusato e permite a execução de experimentos focados no reparo de órgãos.
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Artigo de método
Perfusão de máquina hepática normotérmica ex vivo em camundongos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Este protocolo apresenta um sistema NEVLP livre de eritrócitos otimizado usando fígados de camundongos. A preservação ex vivo de fígados de camundongos foi obtida empregando-se cânulas modificadas e técnicas adaptadas de equipamentos comerciais convencionais de perfusão ex vivo . O sistema foi utilizado para avaliar os resultados de preservação após 12 h de perfusão. Camundongos C57BL/6J serviram como doadores de fígado, e os fígados foram explantados canulando a veia porta (VP) e o ducto biliar (BD) e, posteriormente, lavando o órgão com solução salina heparinizada aquecida (37 °C). Em seguida, os fígados explantados foram transferidos para a câmara de perfusão e submetidos à máquina de perfusão oxigenada normotérmica (NEVLP). Amostras de perfusato de entrada e saída foram coletadas em intervalos de 3 h para análise do perfusato. Ao término da perfusão, amostras de fígado foram obtidas para análise histológica, com integridade morfológica avaliada pelo Suzuki-Score modificado através da coloração pela Hematoxilina-Eosina (HE). Os experimentos de otimização produziram os seguintes achados: (1) camundongos pesando mais de 30 g foram considerados mais adequados para o experimento devido ao maior tamanho de seu ducto biliar (BD). (2) uma cânula de poliuretano 2 Fr (diâmetro externo = 0,66 mm) foi mais adequada para canulação da veia porta (VP) quando comparada a uma cânula de polipropileno. Isso foi atribuído à maior aderência do material de poliuretano, resultando em menor deslizamento do cateter durante a transferência do corpo para a câmara do órgão. (3) para a canulação do ducto biliar (BD), uma cânula de poliuretano 1 Fr (diâmetro externo = 0,33 mm) mostrou-se mais eficaz em comparação com a cânula de polipropileno UT - 03 (diâmetro externo = 0,30 mm). Com este protocolo otimizado, fígados de camundongos foram preservados com sucesso por uma duração de 12 h sem impacto significativo na estrutura histológica. A coloração pela hematoxilina-eosina (HE) revelou uma arquitetura morfológica do fígado bem preservada, caracterizada por hepatócitos predominantemente viáveis com núcleos claramente visíveis e discreta dilatação dos sinusóides hepáticos.
Introdução
O transplante hepático representa o tratamento padrão-ouro para indivíduos com doença hepática terminal. Lamentavelmente, a demanda por órgãos de doadores supera a oferta disponível, levando a uma escassez significativa. Em 2021, aproximadamente 24.936 pacientes estavam na lista de espera por um enxerto de fígado, enquanto apenas 9.234 transplantes foram realizados com sucesso1. A significativa disparidade entre a oferta e a demanda de enxertos hepáticos destaca a necessidade premente de investigar estratégias alternativas para ampliar o pool de doadores e melhorar a acessibilidade dos enxertos hepáticos. Uma forma de ampliar o pool de doadores....
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Protocolo
Os experimentos com animais foram realizados de acordo com os regulamentos e diretrizes alemães atuais para o bem-estar animal e as diretrizes ARRIVE para relatar pesquisas com animais. O protocolo de experimentação animal foi aprovado pelo Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz, Turíngia, Alemanha (Número de aprovação: UKJ - 17 - 106).
NOTA: Camundongos machos C57BL/6J pesando 34 ± 4 g (média ± erro padrão da média [EPM]) foram utilizados como doadores de fígado. Eles foram mantidos sob condições ambientais controladas (50% de umidade e 18 - 23 °C) com livre acesso à ração padrão e água. Durante todo o procedimento cirúrgico, manteve-se....
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Resultados
Estabelecimento do procedimento cirúrgico
Um total de 17 animais foi utilizado para este experimento: 14 camundongos foram empregados para otimizar o processo de captação de órgãos, incluindo a canulação da veia porta (PV) e do ducto biliar (BD), enquanto 3 camundongos foram usados para validar o procedimento (Tabela 1). Os resultados histológicos (Figura 3) foram comparados para facilitar a identificação da condição ótima de perfusão.
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Discussão
Etapas críticas do protocolo
As duas etapas cruciais no explante hepático são a canulação da veia porta (VP) e a subsequente canulação do ducto biliar (BD). Essas etapas são de suma importância para garantir o sucesso da recuperação de órgãos e subsequentes procedimentos de perfusão ou transplante.
Desafios e soluções
A canulação das VVPP apresenta três desafios: lesão da parede do vaso, deslocamento do cateter e praticabilidade do processo de inserção. .......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse financeiros a serem divulgados.
Agradecimentos
Ao longo da redação deste artigo, recebi muito apoio e assistência. Eu particularmente gostaria de agradecer ao meu companheiro de equipe XinPei Chen por sua maravilhosa colaboração e apoio ao paciente durante minha operação.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Micro Tubo PP de 0,5 ml | Sarstedt | 72699 | |
| 1 Fr Cânula de Borracha | Vygon | Amostra Cânula | |
| 10 µ L Micro Seringa | Hamilton | 701N | |
| 2 Fr Cânula de Borracha | Vygon | Cânula | |
| 24 G Cânula Borboleta | Terumo | SR+OF2419 | |
| 26 G Cânula Borboleta | Terumo | SR+DU2619WX | |
| 30 G Agulha Hipodérmica | Sterican | 100246 | |
| 50 ml Bomba de Seringa | Braun | 110356 | |
| 6-0 Perma-Hand Seide | Ethicon | 639H | |
| Clipe Arterial | Braun | BH014R | |
| Câmara Úmida Autoclavável | Hugo Sachs Elektronik | 73-4733 | |
| Aplicador de Algodão Grande | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974018 | |
| Armadilha de Bolhas | Hugo-Sachs-Elektronik | V83163 | |
| Buprenovet (0,3 mg / ml) | Solução de OPA Elanco | / | |
| CIDEX (2 L) | Cilag GmbH | 20391 | |
| Unidade Eletrocirúrgica para Corte Monopolar VIO® 50 C | ERBE | / | |
| Soro Fetal Bovino(500 ml) | Sigma-Aldrich | F7524-500ML | |
| Mistura de Gases (95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono) | Banhos de Circulação de Abastecimento | Doméstico/ | |
| Aquecimento | Harvard-Apparatus | 75-0310 | |
| Heparina 5000 (ou seja, /5 ml) | Braun | 1708.00.00 | |
| Hidrocortisona (100 mg / 2 ml) | Pfizer | 15427276 | |
| Insulina(100 IE / ml) | Tesoura de | I0516-5ML | |
| Instrumentos de Ciência Fina | 15000-03 | ||
| Isofluran (250 ml) | Cp-Pharma | 1214 | |
| Oxigenador de Membrana | Hugo Sachs Elektronik | T18728 | |
| Microscópio de Microcirurgia | M60 | ||
| Esponjas Carfil Quality | 180000056 | ||
| NanoZoomer 2.0 HT | Hamamatsu | / | |
| Não-Tecidas | Kompressen | 866110 | |
| Penicilina Estreptomicina (1 mg / ml) | Tubo | C.C.Pro Z-13-M | |
| (30 cm) | Braun | 4256000 | |
| Bomba Peristáltica | Harvard-Apparatus | P-70 | |
| Petri Dishc 100x15 mm | VWR® | 391-0578 | |
| Povidon-Jod (Vet-Sep Spray) | Livisto | 799-416 | |
| Simulador de Transdutor de Pressão | UTAH Medical Products | 650-950 | |
| Transdutores de Pressão Arterial Reutilizáveis | AD Instruments | MLT-0380 / D | |
| S & Pinça de Punção de Vaso T | Fine Science Instruments | 00608-11 | |
| Aplicador de Algodão Pequeno | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974116 | |
| Pinça Reta 10 cm | Fine Science Instruments | 00632-11 | |
| Sutura Amarrando Fórceps | Fine Science Instruments | 11063-07 | |
| Seringa 50ml Original Perfusor | Braun | 8728810F-06 | |
| UT - 03 Cânula | Unique Medical, Japão | / | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Instruments | 15018-10 | |
| Solução Salina Veterinária (500 ml) | WDT | 18X1807 | |
| Reservatório com Camisa de Água 2 L | Harvard-Apparatus | 73-3441 | |
| William's E Medium (500 ML) | Thermofischer Scientific | A1217601 |
Referências
- Kwong, A. J., et al. OPTN/SRTR 2021 Annual data report: liver. American Journal of Transplantation. 23 (2), S178-S263 (2023).
- Linares, I., Hamar, M., Selzner, N., Selzner, M. Steatosis in Liver Transplantation: Current Limitations and Future Strategies. <....
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Reimpressões e permissões
