Artigo de método

Estabelecimento e Confirmação de um Modelo de Sobrecarga de Volume do Ventrículo Direito Pós-Natal em Camundongos

DOI:

10.3791/65372

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9 de junho de 2023

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1Department of Pediatric Intensive Care Unit, Shanghai Children’s Medical Center, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, 2Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Shanghai Children’s Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, 3Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Shanghai Ninth People’s Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, 4Department of Radiology, Huangpu Branch, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 5Institute of Pediatric Translational Medicine, Shanghai Children’s Medical Center, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, 6Shanghai Institute for Pediatric Congenital Heart Disease, Shanghai Children’s Medical Center, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo apresenta o estabelecimento e a confirmação de um modelo de sobrecarga de volume (VO) do ventrículo direito pós-natal em camundongos com fístula arteriovenosa (FAV) abdominal, que pode ser aplicado para investigar como a VO contribui para o desenvolvimento cardíaco pós-natal.

Resumo

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A sobrecarga de volume (VO) do ventrículo direito (VD) é comum em crianças com cardiopatia congênita. Tendo em vista os distintos estágios de desenvolvimento, o miocárdio do VD pode responder diferentemente à VO em crianças em comparação com adultos. O presente estudo tem como objetivo estabelecer um modelo de VO do VD pós-natal em camundongos utilizando uma fístula arteriovenosa abdominal modificada. Para confirmar a confecção da VO e as seguintes alterações morfológicas e hemodinâmicas do VD, foram realizadas ultrassonografia abdominal, ecocardiograma e coloração histoquímica durante 3 meses. Como resultado, o procedimento em camundongos pós-natais mostrou uma taxa aceitável de sobrevivência e sucesso da fístula. Em camundongos VO, a cavidade do VD foi aumentada com uma parede livre espessada, e o volume sistólico foi aumentado em cerca de 30%-40% dentro de 2 meses após a cirurgia. A partir daí, a pressão sistólica do VD aumentou, observou-se regurgitação valvar pulmonar correspondente e surgiu pequeno remodelamento da artéria pulmonar. Em conclusão, a cirurgia de fístula arteriovenosa (FAV) modificada é viável para estabelecer o modelo de VO do VD em camundongos pós-natais. Considerando a probabilidade de fechamento da fístula e elevação da resistência da artéria pulmonar, a ultrassonografia abdominal e o ecocardiograma devem ser realizados para confirmar o status do modelo antes da aplicação.

Introdução

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A sobrecarga de volume (VO) do ventrículo direito (VD) é comum em crianças com cardiopatia congênita (CC), o que leva a remodelamento miocárdico patológico e mau prognóstico em longo prazo 1,2,3. Uma compreensão profunda do remodelamento do VR e das intervenções direcionadas precoces relacionadas é essencial para um bom desfecho em crianças com CC. Existem várias diferenças nas estruturas moleculares, funções fisiológicas e respostas a estímulos no coração de adultos e crianças 1,4,5,6. Por exemplo, sob a influência da sobrecarga pressórica, a proliferação de cardiomiócitos é a principal resposta em corações neonatais, enquanto a fibrose ocorre em corações adultos 5,6. Além disso, muitas drogas eficazes no tratamento da insuficiência cardíaca em adultos não têm efeito terapêutico sobre a insuficiência cardíaca em crianças, podendo até causar danos adicionais 7,8. Por conseguinte, as conclusões retiradas de animais adultos não podem ser aplicadas directamente a animais jovens.

O modelo de fístula arteriovenosa (FAV) tem sido utilizado para induzir VO cardíaco crônico e disfunção cardíaca correspondente há décadas em animais adultos de diferentes espécies9,10,11,12,13. No entanto, pouco se sabe sobre o modelo em camundongos pós-natais. Em nossos estudos anteriores, um modelo de VO pós-natal em camundongos foi gerado com sucesso pela criação de uma FAV abdominal. A alteração do trajeto do desenvolvimento do VD no coração pós-natal também foi demonstrada14,15,16,17.

Para explorar o processo cirúrgico modificado subjacente e as características do presente modelo, um protocolo detalhado é apresentado; O modelo é avaliado por 3 meses neste estudo.

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Protocolo

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Todos os procedimentos aqui apresentados estavam em conformidade com os princípios descritos na Declaração de Helsinque e foram aprovados pelo Comitê de Bem-Estar Animal e Estudos Humanos do Shanghai Children's Medical Center (SCMC-LAWEC-2023-003). Filhotes de camundongos C57BL/6 (P7, machos, 3-4 g) foram utilizados para o presente estudo. Os animais foram obtidos de fonte comercial (ver Tabela de Materiais). Os filhotes de camundongos e suas nutrizes (filhotes:mães = 6:1 em uma única gaiola) foram mantidos em condições laboratoriais livres de patógenos específicos sob um ciclo claro e escuro de 12 h a 22 ± 2 °C com livre acesso à água e dieta nutricional. Os filhotes foram randomizados em dois grupos: um grupo VO e um grupo sham-operado (sham).

1. Preparação de equipamentos e ferramentas cirúrgicas

NOTA: Os detalhes comerciais de todos os materiais/equipamentos estão listados na Tabela de Materiais.

  1. Certifique-se de que os seguintes tipos de equipamentos estejam prontos e funcionando corretamente: mesa cirúrgica (painel plástico de espuma), máquina de anestesia inalatória, microscópio com iluminação vertical e câmera embutida, aparelho de ultrassom com transdutor de 24 MHz e plataforma de aquecimento termostático.
  2. Esterilize os instrumentos cirúrgicos (ou seja, um suporte de microagulha, pinça de ponta fina e tesoura de mola Vannas de cabo redondo).
  3. Montar os seguintes consumíveis: agulhas de sutura cirúrgica 11-0 e 9-0 (ponto cone) com fio, fitas adesivas, agulhas de seringa de 5 mL, seda 2-0 (fixação cirúrgica), cotonetes estéreis e gel de ultrassom.
  4. Certifique-se de que os seguintes reagentes estejam presentes: Betadine, etanol 70%, soro fisiológico estéril, isoflurano, paracetamol, pomada oftálmica e creme para depilação.

2. Procedimento cirúrgico

OBS: O procedimento cirúrgico da fístula foi modificado de acordo com o método descritoanteriormente11. A Figura 1 mostra um diagrama esquemático da operação da FAV em camundongos pós-natais.

  1. Anestesia e contenção
    1. Coloque os filhotes de camundongos em uma caixa de indução anestésica fornecida com isoflurano a 2%, oxigênio a 2% por 2 minutos com o fluxo ajustado para 1 L/min. Administrar paracetamol (0,1 ml via oral de 80 mg/2,5 ml) utilizando uma seringa para TB.
    2. Colocar os filhotes em decúbito dorsal na mesa cirúrgica com inalação nasal de isoflurano a 1,5% com fluxo de 0,8 L/min para manutenção da anestesia. Ajuste a posição do filhote amarrando as pernas às agulhas fixas da seringa. Aplique pomada oftálmica nos olhos dos filhotes para evitar a dessecação da córnea.
    3. Aperte a cauda do filhote anestesiado para verificar sua responsividade à dor; nenhum movimento corporal óbvio indica anestesia adequada.
  2. Cirurgia de fístula
    1. Desinfetar a pele com três esfoliantes alternados de betadina e etanol 70% e, em seguida, borrar o local cirúrgico. Corte a parede abdominal e o peritônio do abdome inferior ao subxifóide para expor totalmente a cavidade peritoneal, tomando cuidado para não lesionar os órgãos abdominais. Gotejamento de soro fisiológico estéril normal para umedecer órgãos exteriorizados.
    2. Puxe suavemente o trato gastrointestinal e a bexiga para longe do local cirúrgico usando cotonetes para visualizar a aorta abdominal vertical (AA) e a veia cava inferior (VCI) sob o retroperitônio. Gire a mesa cirúrgica 90° no sentido anti-horário e ajuste a ampliação do microscópio para visualizar claramente os dois vasos horizontais.
    3. Punção da fístula do AA para a VCI em sentido oblíquo 1 cm distal à artéria renal com agulha de sutura 11-0 (diâmetro = 0,07 mm). Verificar o sucesso da criação de fístula com base no inchaço e mistura de sangue venoso e arterial na VCI.
    4. Em seguida, comprimir rapidamente o ponto de sangramento usando uma força apropriada aplicada com cotonetes secos por 15 s. Substitua o estômago, intestinos e bexiga na cavidade abdominal o mais rápido possível para promover a compressão hemostática.
    5. Sutura da parede abdominal e peritônio com um ponto de manta com fio de sutura 9-0. Interrompa a anestesia e forneça oxigênio a 100% dos filhotes por 1 min.
  3. Reanimação anestésica
    1. Coloque os filhotes em uma plataforma de aquecimento de 38 °C. Após um despertar completo com vitalidade, devolva os filhotes à mãe que amamenta. Todo o procedimento dura aproximadamente 15 min.
      OBS: No presente estudo, o grupo simulado é submetido ao mesmo procedimento, exceto pela etapa de punção.

3. Confirmação ultrassonográfica da fístula

LEGENDA: O funcionamento geral do aparelho de ultrassom foi idêntico a relatos anteriores18,19.

  1. Confirmação de fístula por ultrassonografia abdominal
    1. Após a indução anestésica (passo 2.1.1), fixar os ratos com fitas adesivas na posição supina sobre a plataforma aquecida. Em seguida, conecte os camundongos a um monitor de eletrocardiograma (ECG) com gel de ultrassom. Manter a anestesia com isoflurano a 1,5% com fluxo de 0,8 L/min.
    2. Prepare a pele do peito e do abdômen usando creme de depilação. Após alguns segundos, retire o creme com uma ponta de algodão morna embebida em água. Coloque o transdutor (24 MHz) na linha abdominal média e gire o marcador do transdutor para a cabeça dos camundongos.
    3. Mover a plataforma para o lado esquerdo ou direito dos camundongos e usar o modo B e o modo Doppler colorido para visualizar a visão de eixo longo dos vasos e sinais sanguíneos18,19. Medir a velocidade do fluxo sanguíneo dos AA, VCI e fístula para confirmar a patência da FAV através do modo Doppler pulsado.
      OBS: O sucesso da formação de fístula no ultrassom foi indicado por um sinal de fluxo turbulento visível entre o AA e a VCI (Figura 2C). A velocidade do fluxo sanguíneo com Doppler no local da FAV foi significativamente elevada em comparação com uma velocidade sistólica relativamente menor no AA (Figura 2A,C). Além disso, em contraste com os padrões normais de fluxo na VCI (Figura 2B), a onda pulsátil do fluxo sanguíneo da VCI proximal à FAV também confirmou o sucesso da criação da fístula (Figura 2D).
  2. Confirmação da VO pela ecocardiografia
    1. Mova a parte final da plataforma para baixo, coloque o transdutor (24 MHz) no peito e gire o marcador do transdutor para o ombro direito dos ratos. Visualize a visão paraesternal modificada de eixo longo da artéria pulmonar (AP) usando modo B e modo Doppler colorido.
    2. Usando o modo Doppler pulsado, meça os sinais de fluxo sanguíneo na AP, incluindo a integral de velocidade de tempo (PA-VTI), diâmetro da válvula PA (DAP), tempo de aceleração arterial pulmonar (PAT) e tempo de ejeção do VD (RVED) (Figura 2E,F e Figura 3A,B).
    3. Medir os parâmetros ultrassonográficos a partir da média de três medidas consecutivas. Calcular o volume sistólico do VD (VSVD, mL) e a pressão sistólica do VD (PSVD, mmHg) utilizando as seguintes fórmulas20:
      VSVD [mL] =1/4 × πD2 × ITVPA
      PSVD [mmHg] = -83,7 × PAT/TVR - índice + 63,7
      OBS: Considerando o viés de mensuração ultrassonográfica, um aumento de >15% no VSVD ou VTIPA em camundongos VO em comparação com camundongos no grupo sham foi considerado VO no VR (Figura 2E,F).

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Resultados

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Taxa de sobrevida e perviedade da FAV em 3 meses
Um total de 30 (75%) camundongos no grupo VO e 19 (95%) no grupo sham sobreviveram à cirurgia de FAV (Figura 4A). No grupo VO, oito camundongos morreram dentro de 1 dia após a cirurgia devido a sangramento excessivo (n = 5) ou canibalização (n = 3), enquanto dois camundongos morreram de causas desconhecidas em 1 mês.

Dos camundongos VO sobreviventes (n = 30), a ultrassonografia confirmou o estabe...

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Discussão

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Anteriormente, o modelo clássico VO do VD foi criado utilizando regurgitação valvar21; no entanto, em comparação com a FAV, a cirurgia valvar cardíaca aberta pode exigir técnicas mais sofisticadas e pode estar associada a mortalidade significativamente maior, particularmente em camundongos pós-parto. Como estudos em animais demonstraram que o mesmo efeito da VO foi alcançado pela FAV22, a cirurgia de fístula abdominal modificada com menos trauma foi utilizada neste estudo.<...

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Divulgações

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Não há conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência da China (nº 82200309) e pelo Projeto de Inovação da Distinguished Medical Team em Ningbo (nº 2022020405)

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
70% EtanolTiandz, Chia
ACETAMINOPHEN Solução OralVistaPharm, Inc. Largo, FL 33771, EUANDC 66689-054-01
Máquina de anestesiaRWD Life Science, ChinaR550IP
Máscara de anestesiaRWD Life Science, China68680
C57BL / 6 camundongosXipu ' er-bikai Experimental Animal Co., Ltd (Shanghai, China)
Creme de depilaçãoVeet, FrançaVT-200
Kit de hematoxilina e eosina Biotecnologia Beyotime C0105M 
IsofluranoRWD Ciência da Vida, ChinaR510-22-10
Microscópio  Yuyan Instruments, ChinaSM-301
Agulhas de sutura cirúrgicaNINGBO MEDICAL NEEDLE CO., LTD, China
Plataforma de aquecimento termostáticoQingdao Juchuang Environmental Protection Group Co., Ltd, China
Dispositivo de ultrassomFUJIFILM VisualSonics, Inc.Vevo 2100incluem modo B, modo Doppler colorido e modo Doppler de onda pulsada
Gel de ultrassomParker Laboratories, Estados UnidosREF 01-08
Transdutor de ultrassomFUJIFILM VisualSonics, Inc.EM 400
Os modos de imagem

Referências

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