Este protocolo descreve a utilização da transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens (AMT) para integrar gene(s) de interesse no genoma nuclear da microalga verde Chlorella vulgaris, levando à produção de transformantes estáveis.
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Artigo de método
Engenharia Genética Mediada por Agrobacterium tumefaciens de Microalgas Verdes, Chlorella vulgaris
Neste artigo
Resumo
Resumo
A transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens (AMT) serve como uma ferramenta amplamente empregada para manipular genomas de plantas. No entanto, A. tumefaciens exibe a capacidade de transferência gênica para diversas espécies. Numerosas espécies de microalgas carecem de métodos bem estabelecidos para integrar de forma confiável genes de interesse em seu genoma nuclear. Para aproveitar os benefícios potenciais da biotecnologia de microalgas, ferramentas simples e eficientes de manipulação do genoma são cruciais. Neste trabalho, um protocolo AMT otimizado é apresentado para a espécie de microalgas industriais Chlorella vulgaris, utilizando a proteína fluorescente verde repórter (mGFP5) e o marcador de resistência a antibióticos para Hygromycin B. Os mutantes são selecionados através de plaqueamento em meio Tris-Acetato-Fosfato (TAP) contendo Higromicina B e cefotaxima. A expressão de mGFP5 é quantificada via fluorescência após mais de dez gerações de subcultivo, indicando a transformação estável do de T-DNA. Este protocolo permite a geração confiável de múltiplas colônias transgênicas de C. vulgaris em menos de duas semanas, empregando o vetor de expressão vegetal pCAMBIA1302 comercialmente disponível.
Introdução
Agrobacterium tumefaciens, uma bactéria gram-negativa transmitida pelo solo, possui uma capacidade única de transferência de genes entre reinos, o que lhe rendeu o título de "engenheiro genético natural"1. Essa bactéria pode transferir DNA (T-DNA) de um plasmídeo indutor de tumor (Ti-Plasmid) para as células hospedeiras através de um sistema de secreção Tipo IV, resultando na integração e expressão do DNA-T no genoma do hospedeiro1,2,3,4. No ambiente natural, esse processo leva à formação de tumores em planta....
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Protocolo
Todos os suportes e soluções devem ser autoclavados antes da utilização, salvo indicação em contrário. Todos os tubos de centrífuga, pontas de pipeta, etc., devem ser estéreis ou autoclavados antes do uso. Para facilitar a consulta, as receitas de mídia utilizadas neste protocolo estão listadas na Tabela 1.
1. Preparação de células eletrocompetentes de A. tumefaciens
- Inocular Agrobacterium (AGL-1) em um frasco de 25 mL de agitador estéril de meio LB (suplementado com rifampicina, 20 mg/L-1) a partir de um estoque congelado de glicerol e crescer durante a noite a 28-30....
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Resultados
Para mostrar sucesso na transformação usando o método acima, C. vulgaris foi cocultivada com AGL-1 contendo o plasmídeo pCAMBIA1302 ou sem o plasmídeo (selvagem e plaqueado em ágar TAP suplementado com higromicina B e cefotaxima (Figura 1A). A placa mais à esquerda mostra as colônias transformadas capazes de crescer nas placas de higromicina B/cefotaxima, e a placa do meio mostra que a AGL-1 selvagem não pode crescer nas placas de higromicina B/cefotaxima. A placa mais à direita mos.......
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Discussão
A eficiência da transformação está associada a vários parâmetros diferentes. A escolha das cepas de A. tumefaciens utilizadas para TMA é crucial. A AGL-1 é uma das cepas mais invasivas descobertas e, por esse motivo, tem sido rotineiramente utilizada em plantas AMT. A suplementação do meio de indução com glicose (15-20 mM) também é importante para a eficiência da AMT. Considerando que C. vulgaris pode crescer em condições fototróficas e heterotróficas, glicose ou outras fontes de carbono são frequenteme.......
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Divulgações
Não foram declarados conflitos de interesse.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer ao Prof. Paul Hooykaas por gentilmente fornecer o vetor pCAMBIA1302 e Agrobacterium tumefaciens AGL1 do Instituto de Biologia de Leiden, Universidade de Leiden, Holanda. Os autores também gostariam de agradecer a Eva Colic por sua ajuda no crescimento dos transformantes fluorescentes. Este trabalho foi financiado pelo Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá e pelo programa Mitacs Acelerar.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Escada de DNA de 1 Kb Plus | FroggaBio | DM015 | |
| Acetosiringona | Fisher Scientific | D26665G | |
| Agrobacterium tumefaciens | Gold Biotechnologies | Cepa: AGL-1; Presente do Prof. Paul Hooykaas | Genótipo: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA |
| Biotina | Enzo Life Sciences | 89151-400 | |
| CaCl2· 2H2O | VWR | BDH9224-1KG | |
| Cefotaxima | AK Scientific | J90010 | |
| Chlorella vulgaris | Coleção de Cultura da Universidade do Texas em Austin Cepa de Algas | : UTEX 395 | Cepa de tipo selvagem |
| CoCl2· 6H2O | Sigma Aldrich | C8661-25G | |
| CuSO4· 5H2O | EMD Millipore | CX2185-1 | |
| FeCl3· 6H2O | VWR | BDH9234-500G | |
| Pulsador de genes Xcell Electroporator | Bio-Rad | 1652662 | Unidade principal equipada com módulo PC. |
| Kit de purificação do genoma da planta GeneJET | Thermo Scientific | K0791 | |
| Ácido acético glacial | VWR | CABDH3093-2.2P | |
| Glicerol | BioBasic | GB0232 | |
| HEPES Buffer | Sigma Aldrich | H-3375 | |
| Higromicina B | Fisher Scientific | AAJ6068103 | |
| K2HPO4 | VWR | BDH9266-500G | |
| Kanamycin | Gold Biotechnologies | K-250-25 | |
| KH2PO4 | VWR | BDH9268-500G | |
| MgSO4· 7H2O | VWR | 97062-134 | |
| MnCl2· 4H2O | JT Baker | BAKR2540-01 | |
| Na2CO3 | VWR | BDH7971-1 | |
| Na2EDTA· 2H2O | JT Baker | 8993-01 | |
| Na2MoO4· 2H2O | JT Baker | BAKR3764-01 | |
| NaCl | VWR | BDH7257-7 | |
| NaH2PO4 H2O | Millipore Sigma | CA80058-650 | |
| NaNO3 | VWR | BDH4574-500G | |
| NEBExpress Ni Resin | NewEngland BioLabs | NEB #S1427 | |
| NH4Cl | VWR | BDH9208-500G | |
| pCAMBIA1302 | Leiden University | Presente do Prof. Paul Hooykaas | pBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, CaMV 35S promoter/mgpf5-6xhis/NOS terminator) |
| Colunas de Polipropileno (5 mL) | QIAGEN | 34964 | |
| Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, recombinante marcada com estreptococos, 1 mL | Bio-Rad | 1610363 | |
| Rifampicina | Millipore Sigma | R3501-1G | |
| SunBlaster LED Strip Light 48 Polegadas | Microplate SunBlaster | ||
| Synergy 4 | BioTEK | S4MLFPTA | |
| Tetraciclina | Thermo Scientific Chemicals | CAAAJ61714-14 | |
| TGX Kit de Acrilamida FastCast Sem Manchas, 12% | Bio-Rad | 1610185 | |
| Tiamina | TCI America | T0181-100G | |
| Base Tris | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Triptona | BioBasic | TG217 (G211) | |
| Vitamina B12 (cianocobalamina) | Enzo Life Sciences | 89151-436 | |
| Extrato de Levedura | BioBasic | G0961 | |
| ZnSO4· 7H2O | JT Baker | 4382-01 |
Referências
- Smith, E. F., Townsend, C. O. A plant tumor of bacterial origin. Science. 25 (643), 671-673 (1907).
- Chilton, M. D., et al. Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells: The molecular basis of tumorigenesis. Cell. 11 (2), 263-271 (1977).
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Reimpressões e permissões
