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Criação da Borboleta Branca de Repolho (Pieris rapae) em Condições Controladas: Um Estudo de Caso com Tolerância a Metais Pesados

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DOI:

10.3791/65383

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18 de agosto de 2023

 , 
1Deptartment of Ecology, Evolution and Behavior, University of Minnesota, 2Biology, Sweet Briar College

Neste artigo

Resumo

Este trabalho apresenta um protocolo detalhado para a criação da borboleta branca repolho em condições controladas de laboratório com uma dieta artificial, que permite manipulações precisas da nutrição precoce e exposição a toxinas. Os resultados representativos mostram como a toxicidade por metais pesados pode ser avaliada com este protocolo.

Resumo

A borboleta-branca (Pieris rapae) é um importante sistema aplicado para pesquisa de controle de pragas e pesquisa básica em ecologia comportamental e nutricional. As brancas de repolho podem ser facilmente criadas em condições controladas em uma dieta artificial, tornando-as um organismo modelo do mundo das borboletas. Neste trabalho, uma manipulação da exposição a metais pesados é usada para ilustrar métodos básicos para a criação desta espécie. O protocolo geral ilustra como as borboletas podem ser capturadas no campo, induzidas a colocar ovos em gaiolas de estufa e transferidas como larvas para dietas artificiais. Os métodos mostram como as borboletas podem ser marcadas, medidas e estudadas para uma variedade de questões de pesquisa. Os resultados representativos dão uma ideia de como dietas artificiais que variam em componentes podem ser usadas para avaliar o desempenho de borboletas em relação a uma dieta controle. Mais especificamente, as borboletas foram mais tolerantes ao níquel e menos tolerantes ao cobre, com uma tolerância ao zinco em algum lugar no meio. Possíveis explicações para esses resultados são discutidas, incluindo o hiperacúmulo de níquel em algumas plantas hospedeiras de mostarda e evidências recentes em insetos de que o cobre pode ser mais tóxico do que se imaginava. Finalmente, a discussão primeiro revisa as variações do protocolo e as direções para a solução desses métodos, antes de considerar como pesquisas futuras podem otimizar ainda mais a dieta artificial usada neste estudo. Em geral, ao fornecer uma visão detalhada em vídeo da criação e medição de brancos de repolho em dietas artificiais, este protocolo fornece um recurso para o uso desse sistema em uma ampla gama de estudos.

Introdução

A borboleta-branca (Pieris rapae, doravante denominada "repolho branco") é uma espécie praga cosmopolita das culturas de mostarda, como repolho, brócolis e canola 1,2,3. Ao mesmo tempo, o branco repolho é um poderoso sistema para pesquisa em biologia e um modelo de borboleta comumente usado, pois pode ser facilmente criado e manipulado em experimentos controlados de laboratório 4,5. Pesquisas sobre borboletas brancas de repolho forneceram insights críticos com relação à busca de hospedeiros 6,7,8, uso de recursos de néctar9,10,11, escolha de parceiros e seleção sexual 12,13,14, desenvolvimento e evolução do padrão alar 15,16,17 e respostas a mudanças novas e variáveis ambientes18,19. Muitos desses conhecimentos baseiam-se no fato de que as brancas de repolho podem ser criadas em dietas artificiais 4,20,21, que podem ser manipuladas com precisão para refletir más condições nutricionais 22,23, níveis de poluentes ecologicamente relevantes 24,25,26,27 ou transições para novas plantas hospedeiras28,29. O presente estudo utiliza um experimento sobre exposição a metais pesados para ilustrar métodos básicos de criação de borboletas brancas de repolho em dieta artificial em laboratório e medidas-chave de desempenho de larvas e adultos. Muitos aspectos desses métodos aplicam-se a outras borboletas30,31 e mariposas32,33,34 que podem ser criadas em dieta artificial.

Neste artigo, um experimento sobre tolerância a metais é usado para ilustrar os métodos gerais de criação de borboletas brancas de repolho. Os metais pesados são um poluente antrópico comum decorrente da degradação de produtos humanos, processos industriais e contaminação herdada pelo uso histórico em pesticidas, tintas e outros produtos35,36,37,38. Muitos metais pesados, incluindo chumbo, cobre, zinco e níquel, podem se mover do solo e da água para o tecido vegetal 39,40,41,42, e metais na poeira podem ser depositados nas folhas das plantas 43,44,45, resultando em múltiplas vias de exposição a larvas de insetos fitófagos. A exposição precoce a metais pesados pode ter efeitos negativos sobre o desenvolvimento animal, especialmente sobre o tecido neural, e níveis elevados podem ser letais 35,36,46,47,48. Vários estudos têm demonstrado os efeitos negativos da exposição a metais sobre insetos em desenvolvimento, incluindo tanto pragas quanto insetos benéficos 49,50,51. O grande número de poluentes de metais pesados e o fato de que eles frequentemente co-ocorrem em ambientes humanos52, significa que métodos de laboratório precisos são necessários nos quais os pesquisadores podem expor insetos em desenvolvimento a diferentes níveis e combinações de metais diversos para entender e mitigar seus efeitos ambientais.

O presente trabalho contrasta os impactos dos metais comuns na sobrevivência e desenvolvimento do repolho, com foco no cobre (), zinco (Zn) e níquel (Ni), três poluentes comuns em ambientes humanos. Por exemplo, forbes de estradas rurais de Minnesota contêm até 71 ppm Zn, 28 ppm e 5 ppm Ni53. Este experimento manipula os níveis desses metais em dietas artificiais de borboletas brancas de repolho em níveis correspondentes e superiores aos níveis observados no ambiente. Uma dieta artificial é usada para contrastar a toxicidade relativa desses metais, prevendo que os brancos de repolho seriam mais sensíveis a poluentes metálicos que não são parte integrante de sua fisiologia (níquel) em relação àqueles que ocorrem, embora em níveis pequenos, em enzimas e tecidos (cobre e zinco; Gráfico 1). Ao longo do texto, este texto fornece detalhes metodológicos e visualizações em vídeo para ilustrar os métodos de criação e pesquisa deste importante sistema modelo de borboletas.

Protocolo

Esta pesquisa foi conduzida sob a licença APHIS do USDA P526P-13-02979.

1. Coleta de borboletas experimentais

  1. Pegue borboletas fêmeas adultas com uma rede aérea de insetos. As brancas de repolho são geralmente encontradas em habitats abertos e perturbados com plantas néctares e plantas hospedeiras (da família Brassicaceae) presentes.
    1. Procure quando o sol está fora e a temperatura está quente. Para atingir as fêmeas, procure indivíduos que tremulem lentamente, perto do chão, e pousam nas plantas para "tambor" (provar) as folhas com seus foretarsi.
  2. Coloque as fêmeas em gaiolas para colher os ovos.
    OBS: As fêmeas coletadas em campo, em média, acasalaram com um ou dois machos12, e devem começar a colocar ovos férteis logo após a captura. As fêmeas capturadas na natureza precisam de luz natural para ovipositar e acasalar, então coloque a gaiola em uma estufa ou peitoril de janela.
  3. Fêmeas domésticas com uma planta hospedeira para colher ovos.
    NOTA: As fêmeas aceitarão uma variedade de plantas hospedeiras, incluindo repolho verde, rabanete, couve, couve e Arabidopsis, mas certifique-se de que as plantas não foram tratadas com pesticidas.
    1. Apresentar as plantas hospedeiras em vasos ou em recipientes com água para manter a pressão foliar, como caules de couve em tubos de água florais.
    2. Se o pesquisador desejar coletar ovos e transferi-los diretamente para a dieta, primeiro use um elástico para prender uma folha de planta hospedeira ao topo de um copo plástico de água e, em seguida, estique um pedaço de parafilme ao redor da borda - as fêmeas que tocam a folha irão ovipositar no parafilme (ver5).
  4. Certifique-se de que a gaiola também contenha algo para manter a umidade relativa alta, por exemplo, através da rega diária de um vaso de planta ou umedecimento de uma toalha, especialmente em condições secas. Se os vasos de plantas forem regados na gaiola, certifique-se de que uma toalha esteja sob o vaso, pois as borboletas podem ficar presas na água da piscina.
  5. Alimente as borboletas com uma solução de água de mel diluída a 10% apresentada em uma esponja amarela, que as borboletas aprendem rapidamente a usar, especialmente se alojadas com indivíduos experientes.
    1. Para incentivar as borboletas a se alimentarem de esponjas, coloque-as diretamente no comedouro, especialmente depois de borrifar levemente com uma garrafa de água, o que muitas vezes faz com que elas coloquem para fora sua probóscide.
    2. Para montar o comedouro, primeiro enxágue bem as esponjas amarelas ou laranjas e, em seguida, corte-as em pequenos quadrados que se encaixam em placas de Petri de plástico de 60 mm. Troque os comedouros diariamente e limpe as esponjas em uma solução de água sanitária suave, seguida de enxágue completo para evitar o crescimento de mofo.

2. Fazer dietas artificiais

  1. Primeiro, use a receita na Tabela 1, ou outras fontes relevantes, para determinar a receita relevante para um experimento. Fazer as modificações necessárias específicas para a espécie focal ou experimento. Imprima uma receita para seguir enquanto pesa os ingredientes.
  2. Pese todos os ingredientes secos, exceto o ágar, em um recipiente. Certifique-se de que os ingredientes sejam colocados novamente em seu respectivo local de armazenamento, observando que vários ingredientes são armazenados a 4° C. Coloque a mistura de ingredientes secos e pré-pesados em um liquidificador com 5 mL de óleo de linhaça.
  3. Para cada lote de dieta, siga as etapas detalhadas abaixo.
    1. Misturar 15 g de ágar de malha fina com 400 ml de água destilada num copo de pelo menos 1 L. Leve ao micro-ondas até que o ágar esteja perto de ferver, com bolhas finas por toda a mistura, mexendo a mistura a cada 30-60 s para evitar ferver.
    2. A esta mistura de ágar quente, adicione 400 mL de água destilada à temperatura da torneira para levá-la a uma temperatura adequada para misturar com os ingredientes secos, pois a mistura de vitaminas é sensível ao calor.
    3. Adicione a mistura de ágar ao liquidificador e misture bem, raspando as bordas do liquidificador se necessário.
  4. Como o ágar está aquecendo, coloque pelo menos setenta e quatro xícaras de dieta no balcão com as bordas tocando. Depois de misturar bem a dieta, despeje a mistura do liquidificador em xícaras diet, garantindo que a dieta cubra o fundo de cada xícara.
  5. Depois que a dieta esfriar, coloque tampas nos copos, rotule os copos dietéticos com o tipo de dieta, empilhe-os em bandejas e guarde por até 1 mês a 4 °C até o uso.

3. Transferência e criação em dietas artificiais

  1. Folhas da planta hospedeira da casa com ovos de borboleta em copos de 30 oz deli com uma cobertura de malha em uma câmara climática de 24 °C. Após 1 semana, verifique as xícaras – garantindo que as larvas estejam eclodidas e no final do primeiro ou início do segundo estádio de ínstar, um bom momento para transferência para a dieta artificial.
  2. Transfira as larvas para a dieta artificial com um pincel, desinfetando-a com spray de água sanitária e um enxágue com água entre os recipientes de larvas. Transfira três larvas para cada xícara de 4 oz. Embora a dieta artificial seja densa em energia e possa suportar altas densidades de larvas, evite embalar larvas em xícaras, pois doenças e mofo podem se espalhar em copos com alta densidade larval.
  3. Coloque os copos em uma lixeira de plástico de lado para que o frass caia no fundo dos copos e longe da dieta, reduzindo o risco de mofo e doenças.
    1. Aconchegue as xícaras dietéticas em condições de temperatura controlada, com níveis de luz baixos a moderados. Monitore os copos para mofo e doença a cada 1-2 dias, espreitando através das tampas transparentes do copo.
    2. Copos com mofo ou doença podem ser colocados em quarentena ou congelados para evitar a propagação para outros copos.

4. Emergência e manejo de adultos

  1. Deixe as larvas puparem e emergirem nos copos de dieta. Quando os adultos emergirem, dê-lhes algumas horas para que suas asas endurecam antes de removê-las para marcação. Remova as borboletas adultas dos copos com as mãos limpas, segurando suavemente suas asas, observando que agarrar as quatro asas mais perto de seu corpo é uma fixação mais estável.
  2. Para marcar as borboletas, segure os indivíduos secos pela cabeça e tórax e use um sharpie de ponta fina para marcar levemente um número em sua asa traseira.
    1. Indivíduos do sexo usando uma combinação de marcas de asas e genitália; As fêmeas geralmente têm duas manchas pretas em sua asa anterior dorsal e asas traseiras mais escuras e amareladas, enquanto os machos geralmente têm uma mancha preta menor na asa anterior dorsal em um fundo branco mais brilhante54.
    2. Dado que esta coloração apresenta variação individual e sazonal, confirme o sexo usando traços abdominais - os machos têm dois claspers na extremidade distal do abdome e um abdome mais estreito em geral, enquanto as fêmeas têm uma única abertura genital.
  3. Transfira os adultos para envelopes de vidro de cera abrindo o envelope com uma mão, segurando a borboleta pela cabeça e tórax, deslizando-a para dentro do envelope e agarrando as asas através do envelope com a outra mão.
    1. Certifique-se de que todas as quatro asas estão fechadas normalmente dentro do envelope.
    2. Mantenha as borboletas em condições frias (5-6 °C) por até 1 semana antes da experimentação, mas deixe pelo menos 1 dia para se aclimatar quando retirado da geladeira.

5. Medidas de desempenho

  1. Para medir as características das asas em indivíduos mortos, remova as asas da borboleta segurando o tórax em uma das mãos e usando pinças para remover cada asa em sua base. Coloque as asas planas em uma caixa de luz e tire fotos para medições posteriores.
  2. Para obter estimativas de fecundidade, alojar os adultos em gaiolas de acasalamento, permitindo pelo menos 1 dia para a maturação reprodutiva dos machos e 1 dia para o acasalamento. Sacrificar fêmeas em pontos de tempo definidos para contagem de ovos através de dissecção, ou coletar ovos todos os dias em plantas hospedeiras.
  3. Para estimar a carga de ovos, remova o abdômen da fêmea, coloque-o em 1x tampão PBS e corte uma fenda ao longo do lado ventral.
    1. Use pinças para separar as vísceras da cutícula e, em seguida, puxe os ovários para longe do intestino, tracha e outros conteúdos do abdômen.
    2. Desenrole os quatro ovaríolos enrolados dentro de cada um dos dois ovários, observando onde os óvulos maduros, gemados e descascados fazem a transição para folículos imaturos. Use um contador para ajudar a contar o total de ovos maduros, geralmente variando de 0 a 200 ovos.
  4. Para determinar o estado de acasalamento de uma fêmea dissecada, abra a bursa copulatrix e separe os espermatóforos em seu interior. À medida que os espermatóforos são digeridos, eles geralmente desenvolvem uma "cauda" e estão aninhados uns nos outros.

6. Estudo de caso

NOTA: Borboletas brancas adultas de repolho fêmea foram coletadas na natureza em 2014 para encontrar as populações experimentais. Fêmeas adultas originárias de Davis, Califórnia (N = 8 fêmeas fundadoras).

  1. Abrigando as borboletas
    1. Aloja as fêmeas em gaiolas de malha "BugDorm" (61 cm x 61 cm x 61 cm) sob luz natural em uma estufa. Fornecer uma folha orgânica do repolho da planta hospedeira (Brassica oleracea) para oviposição.
    2. Para manter a umidade nas gaiolas, inclua um pequeno vaso de planta (Cosmos), regado diariamente, colocado em cima de uma toalha dentro de cada gaiola.
    3. Coletar ovos diariamente transferindo folhas com ovos novos para copos plásticos de 473 mL com furos na tampa e colocar em uma câmara climática.
    4. Forneça às borboletas acesso ad libitum a uma solução de água de mel a 10% (feita pela diluição do mel orgânico com água destilada), acessível através de uma esponja amarela em uma pequena placa de Petri que é trocada diariamente.
  2. Preparação de dietas artificiais
    1. Preparar dietas artificiais para larvas brancas de repolho utilizando modificações de dietas de lepidópteros previamente desenvolvidas4. Um lote de dieta continha 50 g de gérmen de trigo, 27 g de caseína, 10 g de celulose, 24 g de sacarose, 15 g de farinha de repolho, 9 g de mistura de sal de Wesson, 12 g de levedura Torula, 3,6 g de colesterol, 10,5 g de mistura vitamínica Vanderzant, 1,1 g de parabeno metílico, 1,5 g de ácido sórbico, 3 g de ácido ascórbico e 0,175 g de estreptomicina (ver Tabela de Materiais).
    2. Pré-pesar os ingredientes secos para vários lotes de dieta (Tabela 1) e misturar cuidadosamente para aumentar a homogeneidade entre os tipos de dieta antes de ser subdividido em lotes separados para mistura com soluções metálicas.
    3. Coloque os ingredientes secos no liquidificador com óleo de linhaça e a mistura de metais correspondente.
      NOTA: O óleo de linhaça foi usado no presente experimento por ter sido vendido por um fornecedor anterior de dietas para insetos. Agora, o óleo de linhaça orgânico é usado exclusivamente, que é feito da mesma planta, mas é menos provável que contenha quaisquer aditivos como fornecedores comerciais de óleo de linhaça.
    4. Despeje a dieta preparada em copos plásticos de 118 mL (4 oz). Use sais metálicos solúveis para adicionar metais focais a dietas artificiais. Buscar concentrações de metais com base em observações prévias do teor de metais das plantas (por exemplo, acúmulo de níquel 55,56,57 ou contaminação de plantas na beira da estrada 58,59,60) e tolerância de metais em outros lepidópteros 49,50,51.
    5. Dissolva sais metálicos em 500-1.000 mL de água destilada antes de tomar as quantidades correspondentes para adicionar a dietas artificiais. Por exemplo, para fazer a dieta de níquel de 100 ppm, adicione 317,6 mL de solução de NiCl2 1 M à dieta artificial antes de misturar para obter uma concentração final da dieta de 100 mg/g de peso seco de Ni (aproximadamente 53 mg/g de peso úmido). Essa quantidade se traduz em uma concentração média medida de 109,6 ppm (Tabela 2) com base na espectroscopia de emissão atômica com plasma indutivamente acoplado.
      NOTA: Os níveis de metais foram estimados pelos Laboratórios Analíticos de Pesquisa da Universidade de Minnesota com seis amostras.
  3. Manutenção
    1. Manter os ovos colhidos nas plantas hospedeiras em câmaras climáticas a 23 °C em fotoperíodos 14:10 por 7 dias. Depois disso, transfira as larvas iniciais do segundo ínstar para a dieta artificial.
    2. Na transferência, divida uniformemente as larvas de uma determinada planta nos quatro tipos de dieta para evitar confundir lotes de larvas com o tipo de dieta. Transfira as larvas (N = 346 no total) como dois indivíduos por copo de dieta de 118 mL para reduzir a incidência de doenças por superlotação e permitir amplo espaço para os adultos eventualmente se fecharem.
    3. Furos (três por tampa) nas tampas dos copos de criação. Coloque os copos em caixas plásticas do tamanho de uma caixa de sapatos para a criação, com as diferentes dietas intercaladas para evitar quaisquer efeitos sistemáticos de localização na câmara de criação.
    4. Aconchegue as xícaras de larvas em câmaras climáticas a 23 °C em fotoperíodos de 14:10 (com caixas de água no fundo da câmara para manter a umidade em torno de 50%-60%, monitoradas com um sensor de umidade doméstico). Caso os copos fiquem mofados, (cerca de oito copos totais neste estudo de caso), retire os copos da câmara e retire esses indivíduos do experimento.
    5. Permitir que as larvas pupem e emergirem nas copas de criação (N = 162 no total).
      NOTA: Para as condições de criação neste estudo, o tempo de desenvolvimento desde a coleta dos ovos até a emergência dos adultos foi em média em torno de 25-30 dias (variando de 20-40 dias, por exemplo,25,28).
    6. À medida que as pupas se aproximam da emergência adulta, verifique diariamente as xícaras para indivíduos recém-fechados e remova os adultos com asas secas. Rotule os adultos em suas asas traseiras com seu número individual correspondente (atribuído na transferência de larvas) usando um sharpie preto de ponta fina. Determine o sexo de cada indivíduo e marque em um envelope de vidro juntamente com seu número e data de emergência. Coloque as borboletas adultas em envelopes de vidro e guarde a -20° C até processamento posterior.
      NOTA: Uma pequena fração de adultos emergentes apresenta deformidades nas asas que interfeririam no voo e na sobrevivência dos adultos (5%-8%); Esses indivíduos são excluídos das análises de sobrevida desses experimentos.
  4. Medição e análise de dados
    1. Medir a sobrevivência como sobrevivência do segundo ínstar (quando as lagartas foram colocadas em dieta) até a emergência de adultos.
      OBS: O presente estudo teve como foco a sobrevivência e o tempo de desenvolvimento como medidas de desempenho nas diferentes dietas.
    2. Medir o tempo de desenvolvimento como o número de dias entre a transferência para dietas e a emergência de adultos na câmara climática.
    3. Para a análise dos dados, executar dois conjuntos de modelos que incluíram interações entre o metal e a concentração.
      OBS: Como ambas as interações foram significativas (F 2.194 = 4,56, p = 0,01 para tempo de desenvolvimento e X2 = 12,1, p = 0,002 para sobrevivência), o estudo prosseguiu com a análise separada de cada metal.
    4. Para analisar a sobrevivência, execute testes de qui-quadrado para cada metal para testar os efeitos da dose de metal (tratada como quatro categorias) na sobrevivência à idade adulta com as asas totalmente intactas.
    5. Quando um efeito significativo da dose for detectado, realizar um acompanhamento do qui-quadrado para comparar cada nível com a dieta controle. Para analisar o tempo de desenvolvimento (desde o momento da transferência até o surgimento como adulto), teste os efeitos do sexo no tempo de desenvolvimento.
      OBS: Como não houve efeito do sexo sobre o tempo de desenvolvimento (p > 0,10) para nenhum metal neste experimento, deixamos de ser considerado no modelo.
    6. Execute uma ANOVA separada para cada metal para testar o efeito das quatro concentrações no tempo de desenvolvimento. Além disso, execute testes t para cada concentração relativa ao controle para determinar a concentração mínima onde um efeito de desempenho é visto.
      OBS: Neste estudo, o JMP v16 foi utilizado para todas as análises. Todos os dados brutos estão disponíveis no Mendeley61.

Resultados

Visão geral
A dieta artificial pode ser usada para criar borboletas brancas de repolho em condições padrão para testar os efeitos de certos ingredientes da dieta no desempenho das borboletas. No presente trabalho, dietas artificiais foram utilizadas para estudar a toxicidade de diferentes metais encontrados em plantas hospedeiras que crescem em áreas poluídas (Figura 1). As larvas foram criadas em dietas contendo concentrações crescentes de três metais diferentes (Figura 2; detalhes metodológicos específicos apresentados na seção 6 do protocolo). A sobrevivência e o desenvolvimento das borboletas foram mais impactados pelo cobre e zinco e menos impactados pelo níquel (Figura 3 e Figura 4), com sensibilidade comparável a outros estudos com borboletas e mariposas criadas em dietas artificiais (Figura 5).

Sobrevivência
Larvas de borboletas foram transferidas para dietas artificiais contendo cobre, níquel, zinco ou controle, onde cada tipo metálico variou em concentração em três níveis (Tabela 3). Uma imagem representativa das larvas em uma dose crescente de toxina é mostrada na Figura 2. Não houve efeito da concentração do metal na sobrevivência do níquel, mas houve efeito significativo tanto para cobre quanto para zinco (Tabela 3 e Figura 3). Comparações post-hoc de qui-quadrado demonstraram que o zinco apresentou declínio na sobrevida em relação à dieta controle apenas com o maior nível de zinco (1.000 ppm, comparação post-hoc X12 = 8,41, p = 0,004; Gráfico 1). O cobre também mostrou um declínio significativo na sobrevivência apenas nos níveis mais altos utilizados (500 ppm, X12 = 7,00, p = 0,008), embora tenha havido um aumento benéfico não significativo na sobrevivência nos dois níveis mais baixos (50 ppm e 100 ppm; Gráfico 3).

Tempo de desenvolvimento
Houve efeito significativo das concentrações de cobre e zinco sobre o tempo de desenvolvimento (Tabela 4 e Figura 4). Com o aumento da concentração de cobre, houve aumento no tempo de desenvolvimento, com desvio significativo do controle a partir de 50 ppm (p = 0,027; Gráfico 3). Com o aumento da concentração de zinco, houve aumento no tempo de desenvolvimento, com desvio significativo do controle a partir de 100 ppm (p = 0,03; Gráfico 4). Houve tendência ao aumento do níquel para resultar em maior tempo de desenvolvimento (p = 0,08; Tabela 4), e as comparações de cada dieta com o controle mostraram efeitos significativos a partir de 100 ppm (p = 0,022; Gráfico 4).

figure-results-1
Figura 1: Níveis observados de metais focais no tecido de borboletas e plantas hospedeiras. (Dados de62.) Os níveis de cobre, níquel e zinco são mostrados para o tecido da borboleta Pieris (criado em bok choy no laboratório) e mostardas coletadas na natureza (Bertorea sp.). Os carros indicam os níveis observados nas folhas de plantas ao longo de estradas de alto tráfego53. Os teores de metais nas dietas artificiais utilizadas neste estudo estão descritos na Tabela 1; os pontos representam as médias e as barras de erro representam o erro padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Imagem de larvas brancas de repolho transferidas no mesmo dia para dietas artificiais de concentração crescente de uma toxina. Esta imagem mostra larvas de um estudo dose-resposta (apresentado em 28 usando material vegetal seco para a planta tóxica Aristolochia). Foto por ESR. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 3: Variação na sobrevivência entre dietas metálicas de concentrações crescentes. Os asteriscos indicam desvio significativo na sobrevivência em relação à dieta controle. As concentrações exatas de metais nas dietas estão listadas na Tabela 2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Efeitos da concentração de metais no tempo de desenvolvimento. Os asteriscos indicam a menor concentração de metais para os quais há diferença significativa em relação ao controle (usando um teste t). As concentrações exatas de metais nas dietas estão listadas na Tabela 2. Os pontos representam as médias e as barras de erro representam o erro padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Resumo da tolerância ao metal em outros lepidópteros. São apresentados dados compostos de sobrevida plotados a partir de 11 estudos existentes 49,50,51,56,63,64,65,66,67,68. A variável resposta é o nível (em ppm) de concentração do metal onde os efeitos negativos sobre a sobrevivência são vistos pela primeira vez. As borboletas indicam os resultados deste estudo, observando que os valores de tolerância para níquel foram maiores do que os medidos neste estudo. Os pontos representam as médias e as barras de erro representam o erro padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

IngredientePesar comogMl
Gérmen de trigoingredientes secos50
Celuloseingredientes secos10
Farinha de repolhoingredientes secos15
Caseínaingredientes secos27
Sacaroseingredientes secos24
Wesson Sal Mixingredientes secos9
Levedura de Torulaingredientes secos12
Colesterolingredientes secos3.6
Mix de Vitaminasingredientes secos10.5
Parabenos Metílicosingredientes secos0.75
Ácido sórbicoingredientes secos1.5
Ácido ascórbicoingredientes secos3
Estreptomicinaingredientes secos0.175
Óleo de linhaçaingredientes úmidos5
ÁgarÁgar15

Tabela 1: Receita para dieta artificial. São mostrados os pesos (e volumes) dos ingredientes em um lote de dieta de borboleta branca de repolho. Os ingredientes secos (e óleo de linhaça) são preparados separadamente da mistura de ágar (dissolvidos em 400 mL de água fervente, em seguida, levados a uma temperatura mais fria com 400 mL de água à temperatura ambiente).

Tipo de dietaCobre (ppm)Níquel (ppm)Zinco (ppm)
Cobre-"100 ppm"96.11.7569.9
Níquel-"100 ppm"7.29109.668.9
Zinco-"100 ppm"7.961.06186.2
Zinco-"500 ppm"6.511.16708
Controle5.890.5959.3

Tabela 2: Medidas de metais nas dietas. São apresentados os níveis médios de cobre, níquel e zinco em um subconjunto das dietas artificiais utilizadas no estudo. O nome da dieta ("tipo" na análise) é mostrado à esquerda, com valores entre aspas sendo o nível calculado. A concentração-alvo é mostrada entre aspas. Um subconjunto de dietas utilizadas no estudo foi analisado para garantir que os valores calculados estivessem dentro do alvo com os valores realizados; Deve-se notar que muitas vezes há algum pequeno grau de variação na composição dos componentes da dieta, e cada linha relatada representa apenas uma réplica.

EutalPearson X32P
Cobre (n = 118)17.820.0005
Níquel (n = 152)3.450.33
Zinco (N = 152)12.520.006

Tabela 3: Efeitos da concentração de metais na sobrevivência. São apresentados os resultados de um teste de qui-quadrado para cada metal, contrastando três concentrações de metal em relação a uma dieta controle.

MetalFP
Cobre (N = 61)F3,57 = 9,84<0,0001
Níquel (n = 75)F3,71 = 2,350.079
Zinco (N = 64)F3,60= 3,790.015

Tabela 4: Efeitos da concentração de metais no tempo de desenvolvimento. São mostrados os resultados de ANOVAs individuais para cada metal.

Disponibilidade de dados:

Todos os dados estão disponíveis no Mendeley61.

Discussão

Nesta pesquisa, borboletas brancas de repolho (Pieris rapae) foram criadas em uma dieta artificial para examinar diferenças na toxicidade de metais pesados. Ao fazê-lo, este estudo fornece métodos gerais para a criação e estudos laboratoriais deste sistema de borboletas de fácil manipulação. Essa discussão primeiro considera questões mais gerais sobre os métodos aqui revisados, depois revisa nossos achados científicos antes de concluir com reflexões sobre os componentes da dieta artificial.

O protocolo revisado aqui dá passos de um método geral de criação para borboletas brancas de repolho, mas há muitos pontos dentro desse protocolo que podem ser ajustados. Por exemplo, enquanto o estudo de caso aqui apresentado utiliza esponjas para alimentação, outros pesquisadores tiveram sorte com mechas dentárias e flores de seda preenchidas com água de mel5. Enquanto o presente estudo usa água de mel como alimento, outros pesquisadores usaram soluções de açúcar e até Gatorade. Se as pupas precisarem ser pesadas, ou movidas para outras condições de emergência (por exemplo, induzindo diapausa e precisando armazenar frio por 1 mês), o pesquisador pode facilmente removê-las dos copos borrifando-as com água para umedecer seus acessórios de seda e agarrá-las com pinças de penas, depois pendurando-as novamente usando fita dupla face. Se os pesquisadores precisam de mais flexibilidade em termos de quando as borboletas adultas são movidas para gaiolas para o comportamento adulto, elas podem ser mantidas na geladeira por várias semanas, mas precisam ser alimentadas. A cada vários dias, as borboletas devem ser retiradas para serem alimentadas com uma solução de água de mel diluída. Sob iluminação interna, isso pode ser feito usando um alfinete para desenrolar sua probóscide no alimento. No final do desempenho adulto, uma ampla gama de medidas de condicionamento físico pode ser tomada em borboletas brancas de repolho. O tamanho corporal pode ser medido como a massa úmida ou seca de larvas em determinados estágios, pupas ou adultos (sacrificados ou mantidos em envelopes de vidro), ou através da medição do comprimento das asas no programa ImageJ (ver 12,24,25,28). A fecundidade ao longo da vida das fêmeas pode ser medida através de coletas diárias de ovos nas plantas hospedeiras 25,69,70, e o tamanho das características específicas pode ser medido como uma métrica de desempenho; por exemplo, a massa ou volume do cérebro ou regiões cerebrais individuais 62,71,72, ou a massa ou conteúdo proteico do tórax ou músculo de voo 62,70. Finalmente, adultos podem ser usados em estudos comportamentais para testar qualquer número de questões que examinem o efeito da manipulação da dieta no forrageamento ou na escolha da oviposição27,73.

Se o protocolo de criação não estiver funcionando conforme o esperado, há alguns aspectos a serem solucionados. Primeiro, pode-se perguntar se os níveis de luz são altos o suficiente para provocar um comportamento adulto normal. Enquanto as linhas de Pieris adaptadas em laboratório colocarão ovos sob luz fluorescente, a única luz artificial que funciona para linhas selvagens são poderosas luzes de estufa de amplo espectro. A luz natural em estufas, peitoris de janelas ou ao ar livre funciona melhor para provocar o comportamento de acasalamento e postura de ovos. Em segundo lugar, se os ovos não estão eclodindo ou se as larvas estão morrendo no início do desenvolvimento, há algumas coisas a considerar. O material da planta hospedeira deve ser orgânico, observando que as plantas "orgânicas" das lojas às vezes são tratadas com produtos químicos que podem matar as larvas, então criar as próprias plantas hospedeiras geralmente é melhor. Se a taxa de aceitação do hospedeiro for menor, folhas mais jovens com maior teor de nitrogênio podem ser tentadas, apresentando plantas em vasos em vez de folhas individuais e garantindo que as fêmeas sejam acasaladas. As fêmeas aceitarão semear Brassica, mesmo brotos pequenos que têm 2 semanas de idade. O método da parafina funciona bem para transferir ovos para diferentes condições, mas deve-se notar que a taxa de aceitação tende a ser menor do que plantas inteiras. Terceiro, todos os componentes da dieta devem ser de alta qualidade e não expirados. O óleo de linhaça deve ser substituído anualmente e armazenado na geladeira24,25. O gérmen de trigo, a mistura de vitaminas e antibióticos também devem ser mantidos frescos. Quarto, pode-se considerar ajustar a configuração do copo de dieta. Qualquer número de tipos de copos plásticos descartáveis pode ser usado para a criação, de 1 oz a 15 oz. Descobrimos que 4 oz é um bom tamanho para permitir a emergência de adultos e embala bem em nossas câmaras climáticas. Furos nas tampas permitem o fluxo de ar, mas muitos furos podem secar a dieta em condições de baixa umidade, então esse número pode precisar ser ajustado. Em quinto lugar, as condições na câmara climática podem precisar ser ajustadas em combinação com as condições do copo. Se as condições forem muito secas, as plantas hospedeiras com ovos podem secar antes que as larvas possam ser transferidas, e as xícaras com dieta podem secar antes que as borboletas surjam. Por outro lado, se as condições estiverem muito molhadas, os copos podem abrigar mofo e doenças. Os pesquisadores podem precisar ajustar o fluxo de ar em copos através do uso de tampas de malha, ou mais ou menos furos nas tampas. Outro problema comum são as luzes da câmara que são brilhantes o suficiente para causar oscilações de temperatura nos copos e um acúmulo de condensação; O uso de luzes mais fracas é uma opção fácil para a criação de larvas.

Com relação às questões de pesquisa deste artigo, este estudo constatou que os brancos de repolho foram relativamente mais sensíveis ao cobre do que ao níquel ou ao zinco. O cobre teve impactos negativos significativos no tempo de desenvolvimento em concentrações tão baixas quanto 50 ppm (Figura 3 e Tabela 3) e na sobrevivência em 500 ppm (Figura 4, Tabela 4). Em contraste, não houve efeitos negativos do níquel sobre a sobrevivência (até 500 ppm; Gráfico 3) ou efeitos negativos sobre o tempo de desenvolvimento a 100 ppm (Figura 4). Os brancos de repolho foram bastante tolerantes ao zinco, com efeitos de sobrevivência observados apenas a 1.000 ppm (Figura 3) e efeitos negativos sobre o tempo de desenvolvimento a partir de 100 ppm (Figura 4). Com base nas concentrações relativamente maiores de zinco no tecido de borboletas e mostardas (sua planta hospedeira; Figura 1), esperava-se que houvesse uma tolerância relativamente maior ao zinco. No entanto, a sensibilidade ao cobre e a tolerância ao níquel foram um tanto inesperadas, dados os níveis muito baixos de níquel no tecido das borboletas (Figura 1) e a necessidade do cobre como micronutriente. Esses achados inesperados são discutidos a seguir depois de considerar a tolerância desses metais em outras borboletas e mariposas.

Para comparar os presentes dados com a sensibilidade a metais medida em outros lepidópteros, foram compilados dados de estudos existentes sobre a concentração mínima, onde metais pesados impactaram negativamente a sobrevida 49,50,51,56,63,64,65,66,67,68; esses estudos se concentraram em mariposas, especialmente espécies de pragas (Galleria mellonella, Lymantria dispar, Plutella xylostella, Spodoptera sp.). Todos os valores de sensibilidade medidos neste estudo estão próximos da faixa medida para essas outras espécies (Figura 5). No entanto, a medida de tolerância ao níquel neste estudo parece ser maior do que o esperado - enquanto não houve um efeito significativo de sobrevivência a 500 ppm, o estudo anterior com Pieris rapae também encontrou uma tolerância muito alta ao níquel (efeitos significativos a partir de 1.000 ppm56), apesar de baixos níveis em seus tecidos naturalmente (Figura 1). A medida da sensibilidade ao cobre neste estudo também parece estar na extremidade baixa para estudos de lepidópteros. Embora o uso de uma dieta artificial permita uma comparação conveniente e controlada da sensibilidade relativa a metais, é importante notar que os componentes da dieta podem alterar a medida da sensibilidade absoluta a metais. Por exemplo, a vitamina C na dieta poderia compensar o estresse oxidativo induzido por metais74, ou antibióticos na dieta poderiam alterar quaisquer efeitos dos micróbios no processamento de metais75. Uma linha interessante de pesquisas futuras seria manipular sistematicamente tais componentes da dieta para testar efeitos sobre a toxicidade de metais, especialmente diante de questões sobre o papel funcional dos micróbios intestinais de lepidópteros 76,77 e componentes do néctar que podem ter propriedades antioxidantes78. Além disso, a variação nas necessidades alimentares entre as espécies pode tornar as comparações interespecíficas desafiadoras, e métodos baseados em dieta artificial devem ser complementados com manipulações de plantas hospedeiras.

Estas borboletas são particularmente tolerantes ao níquel e sensíveis ao cobre. Pesquisas anteriores observaram que muitas plantas da família da mostarda, que inclui plantas favorecidas por Pieridae, hiperacumulam níquel como mecanismo de defesa contra herbívoros 55,56,63,79,80,81. Esse hiperacúmulo é superior a 1.000 ppm no tecido vegetal, ordem de grandeza maior do que o observado na maioria das plantas (Figura 1). É possível que Pieris tenha uma tolerância particularmente alta ao níquel devido à seleção passada por tais acumuladores de níquel, como especulado anteriormente26. Embora o cobre tenha sido menos frequentemente estudado como micronutriente em dietas de insetos, há algumas evidências de que ele desempenha um pequeno papel na reprodução e imunidade, embora principalmente em insetos que se alimentam de sangue (por exemplo,82,83). É possível que o cobre desempenhe um papel fisiológico menos importante em borboletas do que em outros animais 84,85,86, consistente com trabalhos recentes que destacam como o cobre pode ser tão preocupante quanto um poluente para insetos como chumbo, cádmio e mercúrio (por exemplo,87,88,89). Embora tenha sido demonstrado que o Pieris evita a contaminação por cobre em baixos níveis90, a mobilidade do cobre em plantas (por exemplo, movendo-se para folhas e flores) também o sinalizou como um contaminante metálico de preocupação91.

Embora estes resultados forneçam dados interessantes sobre a toxicidade relativa destes metais para borboletas brancas de repolho, este artigo também pretende ser de uso geral como uma ilustração visual detalhada de métodos de criação deste poderoso sistema. Couve branca é fácil de criar e manipular em experimentos controlados de laboratório 4,5 facilitando estudos de busca de hospedeiros 6,7,8, forrageamento 9,10,11 e seleção sexual12,13,14. A capacidade de criar essas borboletas em uma dieta artificial é fundamental para criar condições comuns de jardim para comparações e manipular nutrientes, toxinas e até mesmo novas plantas hospedeiras. No entanto, é importante notar que esta dieta artificial não é necessariamente a dieta artificial ideal para esta espécie, e provavelmente poderia ser melhorada com manipulações futuras. Por exemplo, a mistura de sal nesta dieta (e outras dietas de lepidópteros) foi originalmente desenvolvida para vertebrados e tem níveis de cálcio mais altos do que a maioria dos insetos precisa92,93. Assim, alguns de nossos esforços de criação têm feito misturas de sal personalizadas com níveis mais baixos de cálcio (por exemplo,62), e outros fazem uso da "mistura de sal de Beck", que pode ser mais apropriada para muitas espécies de insetos94. Em nossas próprias manipulações, também descobrimos que as borboletas tiveram melhor desempenho com relativamente menos gérmen de trigo e relativamente mais celulose em comparação com as concentrações originais4. Uma área que precisa de maior atenção é a fonte lipídica e a concentração na dieta. Por exemplo, trabalhos anteriores mostraram que a mudança do óleo de linhaça (usado neste estudo) para fosfolipídios aumentou as taxas de acasalamento e as taxas de crescimento de Pieris em dietas artificiais95. A suplementação de ácidos graxos específicos em dietas artificiais pode ter efeitos positivos adicionais96,97. A otimização da dieta artificial de Pieris98,99 cria oportunidades para abordar questões interessantes sobre ecologia nutricional 100,101,102, ecologia evolutiva e ecotoxicologia. Essas abordagens de dieta artificial permitem aos pesquisadores abordar questões sobre o papel de lipídios específicos na evolução cognitiva 103, pré-adaptação a toxinas28, componentes da dieta que reduzem a toxicidade de poluentes 104 ou interações estequiométricas entre nutrientes105.

Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

Agradecemos o apoio das assistentes de graduação durante a criação deste trabalho, em especial Regina Kurandina e Rhea Smykalski. Carolyn Kalinowski ajudou a compilar a literatura sobre toxicidade de metais em outros lepidópteros. Este trabalho foi possível graças a uma bolsa de pesquisa de verão do Departamento de Ecologia, Evolução e Comportamento da Universidade de Minnesota.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Copo de pirex de 1 LFisher Scientific07-250-059
Cilindro graduado de 500 mLFisher Scientific03-007-43
Tampa de placa de Petri de plástico de 60 mmFisher Scientific08-757-100B
Ácido AscórbicoFrontier6015
LiquidificadorAmazon - Loja NinjaBL610 Profissional
Farinha de RepolhoFrontier1086
CaseínaFrontier1100
CeluoseFrontier3425
CholsterolSigmaC3045
Copos para criação (4 oz)Wasserstrom6094583compra com tampas correspondentes
Ágar de Malha FinaSigma
Óleode LinhaçaAmazonB004R63VI6
Tubos de água florais, 2,8 x 0,8 polegadasAmazon - Yimaa DirectB08BZ969DK
envelopes de vidro (1 3/4 x 2 7/8 POLEGADAS)Amazon - Wizard Coin SupplyB0045FG90G
Gaiolas de malha (15,7 x 15,7 x 23,6")AmazonB07SK6P94S
Metil ParabenoFrontier7685
Ohaus Balança PortátilFisher Scientific02-112-228
Mel OrgânicoAmazonB07DHQQFGM
Caixa de luz portátil para estúdio fotográficoAmazonB07T6TNYJ1
Caixa de plástico, tamanho da caixa de sapatosAmazonB09L3B3V1R
Pipetas de transferência descartáveis de plásticoFisher Scientific13-680-50
Ácido SórbicoSigmaS1626
EspátulasFisher Scientific14-357Q
EstreptomicinaSigmaS9137
SucroseAlvo
Torula LeveduraFrontier1720
Mistura de vitaminas VanderzantFrontierF8045
Barcos de pesagemFisher Scientific01-549-750
Wesson Salt MixFrontierF8680
Gérmen de TrigoFrontierG1659
Rede de borboleta com cabo de madeira, aro de 12"Amazon - Ciência EducacionalB00O5JDLVC
Esponjasamarelas Amazon-CeloxB0B8HTHY5B

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