A Preparação Ex Vivo do Corte da Medula Espinhal para o Registro de Patch-Clamp de Células Inteiras em Neurônios Motores Durante a Estimulação da Medula Espinhal

Resumo

Este protocolo descreve um método que utiliza um patch-clamp para estudar as respostas elétricas dos neurônios motores à estimulação da medula espinhal (SCS) com alta resolução espaço-temporal, o que pode ajudar os pesquisadores a melhorar suas habilidades em separar a medula espinhal e manter a viabilidade celular simultaneamente.

Resumo

A estimulação da medula espinhal (ECS) pode efetivamente restaurar a função locomotora após a lesão medular (LME). Como os neurônios motores são a unidade final para executar comportamentos sensório-motores, estudar diretamente as respostas elétricas dos neurônios motores com SCS pode nos ajudar a entender a lógica subjacente da modulação motora espinhal. Para registrar simultaneamente diversas características de estímulos e respostas celulares, um patch-clamp é um bom método para estudar as características eletrofisiológicas em escala unicelular. No entanto, ainda existem algumas dificuldades complexas para atingir esse objetivo, incluindo a manutenção da viabilidade celular, a separação rápida da medula espinhal da estrutura óssea e o uso do SCS para induzir com sucesso potenciais de ação. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado usando patch-clamp para estudar as respostas elétricas dos neurônios motores à SCS com alta resolução espaço-temporal, o que pode ajudar o pesquisador a melhorar suas habilidades em separar a medula espinhal e manter a viabilidade celular, ao mesmo tempo em que estuda suavemente o mecanismo elétrico da SCS no neurônio motor e evitar tentativas e erros desnecessários.

Introdução

A estimulação da medula espinhal (ECS) pode efetivamente restaurar a função locomotora após a lesão medular (LME). Andreas Rowald e col. relataram que a ECS possibilita a função locomotora e do tronco dos membros inferiores em um único dia¹. Explorar o mecanismo biológico da SCS para recuperação locomotora é um campo de pesquisa crítico e de tendência para o desenvolvimento de uma estratégia SCS mais precisa. Por exemplo, a equipe de Grégoire Courtine demonstrou que o interneurônio excitatório Vsx2 e os neurônios Hoxa10 na medula espinhal são os neurônios-chave para responder à SCS, e a neuromodulação célula-específica é viável para restaurar a....

Protocolo

O Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais aprovou todos os experimentos com animais e os estudos foram conduzidos de acordo com as normas pertinentes de bem-estar animal.

1. Preparação dos animais

1. Animais
   1. Informações sobre alojamento: Ratos Sprague-Dawley machos domésticos (10-14 dias pós-natal, P10-P14) em um ambiente específico livre de patógenos.
      NOTA: As condições da sala foram mantidas em 20 °C ± 2 °C, umidade: 50%-60%, com um ciclo claro/escuro de 12 horas. Os animais tinham livre acesso a comida e água.
   2. Rotular os neurônios motores retrogradamente: Injetar Fluoro-Gold (FG) no ....

Resultados

Graças à rigorosa manutenção a baixa temperatura durante a operação fina (Figura 1 Suplementar, Figura 2 Suplementar e Figura 1), a viabilidade celular foi boa o suficiente para realizar registros eletrofisiológicos subsequentes. Para simular ao máximo o cenário clínico, utilizamos a micromanipulação para posicionar o cátodo e o ânodo do SCS próximos à linha média dorsal e ao EDRED, respectivamente (Figura 2), o que poderia iniciar o sinal neura.......

Discussão

A informação do movimento modulada pela SCS é finalmente convergente para os neurônios motores. Portanto, tomar os neurônios motores como alvo da pesquisa pode simplificar o desenho do estudo e revelar o mecanismo de neuromodulação da SCS mais diretamente. Para registrar simultaneamente diversas características de estímulos e respostas celulares, um patch-clamp é um bom método para estudar as características eletrofisiológicas em escala unicelular. No entanto, ainda existem algumas dificuldades, incluindo como manter a v.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sal de magnésio de adenosina 5'-trifosfato	Sigma	A9187
Ácido ascórbico	Sigma	A4034
CaCl2· 2H2O	Sigma	C5080
Cloreto de colina	Sigma	C7527
Pinça de corrediça de tampa	VETUS	36A-SA	Clipe uma fatia
D-Glucose	Sigma	G8270
EGTA	Sigma	E4378
Tesoura fina	RWD Life Science	S12006-10	Corte o diafragma
Fonte de Luz de Fluorescência	Olympus	U-HGLGPS
Fluoro-Gold	Fluorocromo	Fluorocromo	Rotule o neurônio motor
Guanosina 5′-trifosfato sal de sódio hidrato	Sigma	G8877
HEPES	Sigma	H3375
câmera CCD infravermelha	Dage-MTI	IR-1000E
KCl	Sigma	P5405
K-gluconato	Sigma	P1847
Baixo ponto de fusão agarose	Sigma	A9414
MgSO4· Micromanipulador 7H2O	Sigma	M2773
	Instrumento Sutter	Extrator de micropipetas MP-200
	Instrumento Sutter	P1000
Micro-tesouras	Laminectomia	Jinzhong	wa1020
para anatomia	Olympus	Microscópio SZX10
para ecletrofisiologia	Olympus	BX51WI
Pinças com microdentes	RWD Life Science	F11008-09	Levante o corpo vertebral cortado
NaCl	Sigma	S5886
NaH2PO4	Sigma	S8282
NaHCO3	Sigma	V900182
Na-Fosfocreatina	Sigma	P7936
Lente objetiva para ecletrofisiologia	Olympus	LUMPLFLN60XW	distância de trabalho 2 mm
Osmômetro	Avançado	Amplificador FISKE 210
Patch-clamp	Axônio	Multiclamp 700B
Patch-clamp digitizer	Axon	Medidor de pH Digidata 1550B
	Mettler Toledo	FE28
Slice Anchor	Sistema multicanal	SHD-27H
Estimulador da medula espinhal	PINS	T901
Pinça dentada	RWD Life Science	F13030-10	Levante o xifóide
Vibratome	Leica	VT1200S
Filtro de excitação ultravioleta de banda larga	Olympus	U-MF2

Microscópio de