Atividade Adjuvante de Mycobacterium paratuberculosis no Aumento da Imunogenicidade de Autoantígenos Durante Encefalomielite Autoimune Experimental

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo alternativo para induzir ativamente encefalomielite autoimune experimental em camundongos C57BL/6, usando o epítopo imunogênico mielina oligodendrocyte glycoprotein (MOG)_35-55 suspenso em adjuvante de Freund incompleto contendo a subespécie paratuberculosis de Mycobacterium avium morta pelo calor.

Abstract

A encefalomielite autoimune experimental (EAE) induzida pela glicoproteína de oligodendrócitos de mielina (MOG) requer imunização por um peptídeo MOG emulsionado em adjuvante de Freund completo (CFA) contendo Mycobacterium tuberculosis inativado. Os componentes antigênicos da micobactéria ativam células dendríticas para estimular as células T a produzir citocinas que promovem a resposta Th1 via receptores toll-like. Portanto, a quantidade e a espécie de micobactérias presentes durante o desafio antigênico estão diretamente relacionadas ao desenvolvimento das EAE. Este trabalho de método apresenta um protocolo alternativo para induzir EAE em camundongos C57BL/6 usando um adjuvante de Freund incompleto modificado contendo a cepa K-10 da subespécie Paratuberculosis de Mycobacterium avium morta pelo calor.

M. paratuberculosis, membro do complexo Mycobacterium avium, é o agente causador da doença de Johne em ruminantes e tem sido identificado como um fator de risco para várias doenças mediadas por células T humanas, incluindo esclerose múltipla. Em geral, camundongos imunizados com Mycobacterium paratuberculosis apresentaram início mais precoce e maior gravidade da doença do que camundongos imunizados com CFA contendo a cepa H37Ra de M. tuberculosis nas mesmas doses de 4 mg/mL. Os determinantes antigênicos da cepa K-10 de Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) foram capazes de induzir uma forte resposta celular Th1 durante a fase efetora, caracterizada por números significativamente maiores de linfócitos T (CD4+ CD27+), células dendríticas (CD11c+ I-A/I-E+) e monócitos (CD11b+ CD115⁺) no baço em comparação com camundongos imunizados com CFA. Além disso, a resposta proliferativa de células T ao peptídeo MOG pareceu ser maior em camundongos imunizados com M. paratuberculosis. O uso de um encefalitogênio (por exemplo, MOG_35-55) emulsionado em um adjuvante contendo M. paratuberculosis na formulação pode ser um método alternativo e validado para ativar células dendríticas para priming de células T CD4⁺ específicas para epítopos de mielina durante a fase de indução do EAE.

Introduction

A encefalomielite autoimune experimental (EAE) é um modelo comum para o estudo de doenças desmielinizantes humanas¹. Existem vários modelos de EAE: imunização ativa usando diferentes peptídeos de mielina em combinação com adjuvantes potentes, imunização passiva por transferência in vitro de linfócitos CD4⁺ específicos da mielina e modelos transgênicos de EAE² espontâneo. Cada um desses modelos possui características específicas que permitem o estudo de diferentes aspectos do EAE, como o início, a fase efetora ou a fase crônica. O modelo de glicoproteína de miodendrócitos (MOG) de EAE é um bom modelo p....

Protocol

Todos os experimentos com camundongos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Faculdade de Medicina da Universidade de Juntendo (Aprovação Número 290238) e foram conduzidos de acordo com as Diretrizes do National Institutes of Health para Experimentação Animal.

1. Observações gerais sobre a experiência

1. Alojar os camundongos em gaiolas individuais no biotério sob condições controladas e livres de patógenos a 23 °C ± 2 °C com 50% ± 10% de umidade e um ciclo claro/escuro de 12 h com acesso ad libitum a alimentos e água.
2. Injetar os camundongos com solução salina tam....

Results

Grupos de camundongos C57BL/6 (n total = 15/grupo) foram imunizados com MOG_35-55 em emulsão contendo M. paratuberculosis ou pelo método comum com CFA. Todos os grupos de camundongos manifestaram uma doença monofásica aguda caracterizada por um único pico de incapacidade observado aos 14-17 dias, seguido por uma recuperação parcial dos sintomas nos 10 dias seguintes (Figura 1A). Camundongos imunizados com o adjuvante contendo M. paratub.......

Discussion

Nós demonstramos um protocolo alternativo robusto para induzir ativamente EAE grave em camundongos C57BL/6J usando o peptídeo MOG_35-55 emulsionado em um adjuvante contendo M. paratuberculosis¹⁰. A indução de EAE por esse método resultou em uma doença mais grave do que a induzida pelo protocolo comum com CFA. Essa diferença pode ser devida aos diferentes componentes lipídicos na parede celular das^{micobactérias11}. De fato, ao contrário de outras micobactér.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
anticorpo anti-camundongo CD115	Biolegend, EUA	135505	para citofluorimetria 1:1.000
anticorpo anti-camundongo CD11b	Biolegend, EUA	101215	para citofluorimetria 1:1.000
anticorpo anti-camundongo CD11c	Biolegend, EUA	117313	para citofluorimetria 1:1.000
anticorpo anti-camundongo CD16/32	Biolegend, EUA	101302	para citofluorimetria 1:1.000
anticorpo anti-camundongo CD4	Biolegend, EUA	116004	para citofluorimetria 1:1.000
anticorpo anti-camundongo CD8a	Biolegend, EUA	100753	para citofluorimetria 1:1.000
anticorpo anti-camundongo I-A/I-E	Biolegend, EUA	107635	para citofluorimetria 1:1.000
anticorpo anti-camundongo Ly-6C	Biolegend, EUA	128023	para citofluorimetria 1:1.000
BBL Middlebrook OADC Enrichment	Thermo Fisher Scientific, EUA	BD	211886 para isolamento e cultivo de micobactérias
C57BL/6J camundongos	Charles River Laboratory, Japão		3 semanas de idade, macho e fêmea
FBS 10279-106	Gibco Life Techologies, EUA	42F9155K	para cultura de células, quente a 37 &graus; C antes de usar
Máquina liofilizadora	Eyela, Tóquio, Japão	FDU-1200	para liofilização
de bactérias incompleta e Freund' s adjuvante	Difco Laboratories, MD, EUA	263810	para uso em adjuvante
Middlebrook 7H9 Broth	Difco Laboratories, MD, EUA	90003-876	ajuda no crescimento de micobactérias
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10	ATCC, EUA	BAA-968	bactérias de origem bovina
Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, BD desidratado	Biosciences, EUA	743-26880-EA	para uso em adjuvante
Micobactina J	Allied Laboratory, MO, EUA		promotor de crescimento
Mielina Oligodendrócito Glicolipídeo (MOG) 35-55	AnaSpec, EUA	AS-60130-10	peptídeo encefalotigênico
Ovalbumina (257-264)	Sigma-Aldrich, EUA	S7951-1MG	antígeno de controle negativo  para ensaio proliferativo
solução de toxina convulsa	Fujifilm Wako, Osaka Japão	168-22471	De bactérias gram-negativas Bordetella pertussi, aumenta a permeabilidade da barreira hematoencefálica
Homogeneizador Polytron PT 3100	Kinematica		para misturar o antígeno com o adjuvante
RPMI 1640 com L-glutamina	Gibco Life Techologies, EUA	11875093	Para cultura de células
Timidina, [Metil-3H], em etanol a 2%, 1 mCi	PerkinElmer, Waltham, MA, EUA	NET027W001MC	para ensaio de proliferação, uso (1 μ Ci/well)
Zombie NIR Kit de Viabilidade Fixável	Biolegend, EUA	423105	de citofluorimetria, de viabilidade celular