Rastreamento de Canais Iônicos em Células Cancerosas

As proteínas transportadoras de membrana são fundamentais para a comunicação entre as células, bem como para a manutenção da homeostase celular. Entre as proteínas de transporte de membrana, os canais iônicos servem para impulsionar o crescimento e desenvolvimento das células e para manter o estado das células em ambientes desafiadores e em mudança. Também tem sido relatado que canais iônicos conduzem e apoiam o desenvolvimento de tumores sólidos, tanto sistemicamente quanto no sistema nervoso central (SNC)^1,2. Por exemplo, os canais de KCa3.1 são responsáveis por regular o potencial de membrana e controlar o volume celular, o que é importante na regulação do ciclo celular. Canais defeituosos de KCa3.1 têm sido relatados como contribuintes para a proliferação anormal de células^tumorais3. Além disso, os canais iônicos podem contribuir para a disseminação metastática de cânceres. Canais de potencial receptor transitório (TRP), por exemplo, estão envolvidos no influxo de Ca 2+ e Mg²⁺; Esse influxo ativa várias quinases e proteínas de choque térmico que têm a função de regular a matriz extracelular ao redor de um tumor, o que é, por sua vez, importante para iniciar a metástase do^câncer4.

Uma vez que os canais iónicos podem contribuir para o desenvolvimento de cancros, podem também ser alvos para o tratamento do cancro relacionado com medicamentos. Por exemplo, a resistência às modalidades de tratamento, incluindo quimioterapia e nova imunoterapia, está relacionada à desregulação da função dos canais iônicos ^5,6,7. Além disso, canais iônicos estão emergindo como importantes alvos de fármacos para impedir o crescimento e desenvolvimento de cânceres, sendo examinados fármacos reaproveitados de pequenas moléculas (aprovados pela FDA), bem como biopolímeros, incluindo anticorpos^monoclonais 1,2,8,9. Embora tenha havido muito progresso nessa frente, a descoberta de medicamentos para o câncer de canal iônico permanece subdesenvolvida. Isto é em parte devido aos desafios únicos de estudar os canais iônicos em células cancerosas. Por exemplo, existem limitações técnicas na montagem de ensaios eletrofisiológicos para compostos de ação lenta e diferenças temporais na ativação de canais e ação de drogas. Além disso, a solubilidade dos compostos também pode impedir o progresso, já que a maioria dos sistemas de eletrofisiologia automatizados comumente usados atualmente utilizam substratos hidrofóbicos, que podem contribuir para artefatos como resultado da adsorção de compostos. Além disso, grandes terapêuticas moleculares bioorgânicas, como produtos naturais, peptídeos e anticorpos monoclonais, são tecnicamente desafiadoras de rastrear usando ensaios eletrofisiológicos convencionais¹⁰. Finalmente, as propriedades bioelétricas das células cancerosas permanecem pouco compreendidas¹¹.

Enquanto isso, a coloração por imunofluorescência dos canais iônicos é muitas vezes desafiadora. Isso se deve, em parte, à complexidade de suas estruturas e seu contexto na membrana, que impactam a capacidade de gerar e empregar anticorpos para estudos de microscopia. É especialmente importante que os anticorpos usados para corar os canais iônicos sejam validados quanto à especificidade, afinidade e reprodutibilidade. Anticorpos comerciais para canais iônicos devem ser considerados com base em sua estratégia de validação e registro de publicação. Os experimentos devem incluir controles negativos para demonstrar a falta de ligação inespecífica por knockdown ou knockout da proteína-alvo. Alternativamente, linhagens celulares nas quais a proteína-alvo está ausente ou em baixa abundância com base em determinações de RNAm ou proteínas podem servir como controles negativos. Por exemplo, este estudo mostra a localização da subunidade do receptor (GABA) Gabra5 em uma linhagem celular de meduloblastoma (D283). Células D283 com knockdown de siRNA e células Daoy, outra linhagem celular de meduloblastoma cerebelar, foram coradas para Gabra5 e não apresentaram coloração apreciável (dados não mostrados).

Aqui, são apresentados métodos para analisar e testar a função dos canais iônicos, bem como o efeito dos moduladores dos canais iônicos sobre as células cancerosas. São fornecidos protocolos para (1) coloração de células para um canal iônico, (2) teste do estado polarizado das mitocôndrias, (3) estabelecimento da função do canal iônico usando eletrofisiologia e (4) validação in vitro de fármacos. Esses protocolos enfatizam estudos do receptor tipo A do ácido gama-aminobutírico (GABA_A) 2,12,13,14,15,16^, um canal de ânion cloreto e do principal receptor inibitório de neurotransmissores. No entanto, os métodos apresentados aqui se aplicam ao estudo de muitas outras células cancerosas e canais iônicos.

1. Canais iônicos de imunomarcação em células cultivadas

1. Preparação das células e montagem experimental
   1. Manter as células como cultura em crescimento ativo em frascos de cultura de 75^cm2 . Passe as células uma vez até que elas se tornem 50%-90% confluentes, dependendo do tempo de duplicação da linhagem celular que está sendo usada.
      OBS: Para o presente estudo, foram utilizadas células D283, uma linhagem celular de meduloblastoma do Grupo 3.
   2. Coletar as células do frasco de cultura em um tubo de centrífuga (15 mL ou 50 mL) e adicionar 2 mL de tripsina-EDTA a 0,25% para destacar as células aderentes. Incubar durante 5 min à temperatura ambiente (TR). Após 5 min, bata no frasco de três a cinco vezes para ajudar a desprender as células. Coletar as células em 10 mL de meio com FBS a 10% para interromper a ação da tripsina.
   3. Centrifugar a 480 x g por 5 min em RT. Aspirar suavemente o meio. Não perturbe a pastilha celular.
   4. Ressuspender as células em 5 mL a 10 mL de meio, dependendo da densidade da cultura.
      NOTA: A densidade deve ser consistente com células em crescimento activo e depende da confluência de células no frasco. A avaliação visual deve ser usada para aproximar a densidade celular ideal; Especificamente, as células devem estar entre 40%-90% confluentes e distribuídas uniformemente.
   5. Remover 100 μL de células e adicionar a um tubo de 1,5 mL contendo 100 μL de azul de tripano a 0,4% para marcar células não viáveis. Incubar 5-15 min em TR, dependendo da linhagem celular.
   6. Contar as células manualmente usando um hemocitômetro (ver Tabela de Materiais) em 10 μL de solução. Conte as células vivas e não coradas em cada um dos quatro cantos dos 16 quadrados do hemocitômetro. Multiplique o número médio de células com o fator de diluição e por 10.000 para dar as células por mililitro (células/mL). Alternativamente, um contador de células automatizado pode ser usado.
   7. Diluir as células para 1 x 10⁵ células/mL no meio de cultura especificado para cada linhagem celular. Semente 1. 8 mL de células em cada poço de uma placa de 6 poços contendo uma lamínula de 22 mm x 22 mm pré-revestida com 0,1 mg/mL de poli-D-lisina, de acordo com as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
      NOTA: Pode-se testar o uso tanto da poli-D-lisina quanto da poli-L-lisina, pois há relatos de preferências específicas de linhagens celulares^17,18. Algumas linhagens celulares têm proteases que podem quebrar a poli-L-lisina, enquanto há relatos de que a poli-D-lisina é tóxica para algumas linhagens celulares. Em contraste, células neuronais, como PC12, têm sido relatadas como mais saudáveis em superfícies de poli-D-lisina.
   8. Cultivar as células numa incubadora com um ambiente humidificado de 5% de CO₂ a 37 °C durante a noite para permitir que as células se fixem à lamínula. Examinar a fixação das células sob um microscópio invertido com uma objetiva de 20x.
      NOTA: As células devem estar totalmente aderidas à lamínula antes do tratamento ou imunomarcação direta. Neste momento, as células podem ser tratadas com drogas (ou controle de veículo) pela adição de um estoque concentrado (por exemplo, 600 μL de uma solução estoque 4x) ou a substituição do meio por meio fresco contendo o fármaco na concentração desejada de 1x; As células podem então ser devolvidas à incubadora por até 48 h adicionais. Células tratadas com solvente são incluídas para avaliar os efeitos do fármaco no nível e localização da molécula-alvo. No presente estudo, as células D283 foram tratadas com 600 μL de uma solução de 3,2 μM de um modulador alostérico positivo_{para receptor} GABA, QH-II-066¹⁴ (ver Tabela de Materiais), por 48 h. As células controle foram tratadas com volume equivalente de DMSO.
2. Preparação para imunomarcação: Fixação, permeabilização e bloqueio
   1. Enxaguar as células com 2,5 mL de 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na 2 HPO 4, 2 mMKH₂PO₄, ver Tabela de Materiais) e aspirar imediatamente a solução.
   2. Fixar as células usando 1 mL de PFA a 4% em 1x PBS por 1 h no TR.
      NOTA: Enquanto o PFA a 4% é o fixador padrão para imunomarcação, o glutaraldeído ou glioxal também pode ser usado para fixar proteínas de membrana para imunofluorescência. Métodos de fixação à base de álcool, como tratamentos com metanol gelado, podem levar a morfologia menos preservada e perda de proteínas de membrana^19,20.
   3. Lavar seis vezes com 2,0 mL de 1x PBS (5 min por lavagem) por agitação em um agitador. Incubar por 1 h no TR em um tampão de bloqueio composto por 1x PBS com 0,8% de Triton X-100 e 10% de soro normal compatível com a espécie hospedeira do anticorpo primário (alternativamente, BSA a 3% ou albumina V de soro bovino podem ser usados no lugar do soro normal).
      Observação : esta etapa é empregada para bloquear a associação não específica.
3. Imunomarcação
   NOTA: Após a adição dos anticorpos conjugados aos fluoróforos, as medidas devem ser feitas em breve para evitar o fotoclareamento. Incubações com anticorpos conjugados precisam ser protegidas da luz. O uso de um meio de montagem que contenha agentes que eliminam os radicais livres reduzirá o fotoclareamento. Conservar as lâminas num recipiente opaco e estanque (a 4 °C) após a vedação das lamínulas. Durante a obtenção de imagens, o fotoclareamento pode ser minimizado limitando a intensidade da iluminação de excitação e os tempos de exposição.
   1. Prepare uma câmara umidificada forrando o fundo de uma placa de cultura de 150 mm com papel filtro. Umedeça o papel filtro com água destilada estéril. Desenhe uma grade 3 x 2 em um pedaço de filme de laboratório cortado para caber em cima do papel de filtro e rotule-o para preservar a orientação das lamínulas na placa de 6 poços. Coloque o filme de laboratório sobre o papel de filtro, expondo as bordas superior e inferior para umidificar a câmara.
   2. Preparar 100 μL por lamínula da diluição desejada do anticorpo primário em 1x PBS com BSA a 3%. Para detectar o produto proteico do gene GABRA , use anticorpo primário monoclonal recombinante de coelho em uma diluição de 1:200 (anticorpo Gabra5, região média; ver Tabela de Materiais).
      NOTA: Para determinar empiricamente a concentração de anticorpos primários que produz o sinal ideal sobre o plano de fundo, use uma série de diluição do anticorpo primário mantendo a concentração secundária constante. Diluições de 1:100, 1:250, 1:500, 1:750 e 1:1.000 são recomendadas para estabelecer concentrações ideais de anticorpos primários.
   3. Transfira a lamínula da solução de bloco na placa de 6 poços para o local apropriado na grade desenhada no filme de laboratório. Descarte a solução de bloco da placa de 6 poços e retenha a placa para as etapas de lavagem.
   4. Adicione cuidadosamente 100 μL de anticorpo primário diluído ao centro de cada lamínula. Evite colocar a solução sobre a borda da lamínula. Incubar por 1 h no TR.
   5. Adicionar 2,5 mL de 1x PBS a cada poço da placa de 6 poços. Transfira a tampa de volta para o local apropriado na placa de 6 poços.
   6. Realizar seis lavagens por 5 min cada com 2,5 mL de PBS 1x.
      NOTA: Não permita que as lamínulas sequem durante as etapas de enxágue, pois isso pode contribuir para um sinal de fluorescência de fundo.
   7. Retorne as lamínulas para o local apropriado na película de laboratório. Para cada lamínula, adicionar 100 μL de anticorpo secundário diluído em 1x PBS + 1%-5% BSA.
      NOTA: Inicialmente, os anticorpos secundários conjugados ao Alexa Fluor 488 (consulte a Tabela de Materiais) são usados em uma diluição de 1:1.000 em 1x PBS + 3% BSA. A concentração de anticorpos secundários pode ser otimizada aumentando a concentração para detectar proteínas-alvo de baixa abundância ou diminuindo a concentração para reduzir o fundo, se necessário.
   8. Para as demais etapas, minimizar a exposição à luz para evitar o fotoclareamento do anticorpo secundário conjugado. Cubra o prato de cultura com papel alumínio e incube por 1 h no TR.
   9. Transfira as lamínulas de volta para a placa de 6 poços. Usando um agitador, realizar seis lavagens por 5 min cada com 2,5 mL de PBS 1x. Remova o PBS invertendo a placa sobre a pia ou um recipiente de resíduos. Após a última lavagem, deixe o PBS no poço para facilitar a remoção da lamínula.
   10. Rotule uma lâmina de microscópio para cada lamínula. Adicione uma gota de meio de montagem contendo glicerol com DAPI (para manchar os núcleos) (consulte a Tabela de Materiais) ao centro da lâmina.
   11. Usando pinças, retire a tampa do poço e coloque-a delicadamente sobre a gota do meio de montagem no centro da corrediça.
       OBS: Evite a formação de bolhas de ar no meio de montagem.
   12. Use pequenos pedaços de papel filtro para remover o excesso de meio de montagem. Sele as bordas da tampa com esmalte e deixe o esmalte secar completamente antes de fazer a imagem. Conservar as lâminas de vidro a 4 °C numa caixa de plástico opaco.
4. Imagens e análises
   1. Adquira imagens com microscópio de fluorescência sob objetiva de 40x com óleo de imersão (veja Tabela de Materiais).
   2. Visualize as imagens de fluorescência com os filtros apropriados.
   3. NOTA: Para Alexa Fluor 488, use uma excitação/emissão de 496 nm/519 nm; para DAPI, usar uma excitação/emissão de 358 nm/461 nm.
   4. Capture e salve os arquivos de imagem digital. Um valor de binning de 4 x 4 é usado para facilitar as taxas de coleta de imagens e reduzir o plano de fundo.
   5. Prepare as imagens finais. As imagens podem ser processadas com ImageJ ou software disponível comercialmente. Os resultados estão ilustrados na Figura 1.

2. Testando o estado polarizado das mitocôndrias

OBS: Este protocolo utiliza o ensaio TMRE (tetrametilrodamina, éster etílico) para marcar o potencial de membrana em mitocôndrias ativas, mantendo uma carga negativa^21,22. TMRE é um corante permeável a células, vermelho-alaranjado, positivamente carregado que se acumula em mitocôndrias ativas por causa de sua carga negativa relativa. Mitocôndrias inativas ou despolarizadas têm potencial de membrana reduzido e não sequestram proporcionalmente a TMRE. FCCP (carbonil cianeto 4-[trifluorometoxi] fenilhidrazona), um desacoplador ionóforo da fosforilação oxidativa (OXPHOS), despolariza as membranas mitocondriais, impedindo o acúmulo e sequestro de TMRE²³. Isso é ilustrado na Figura 2.

1. Preparação das células e montagem experimental
   1. Manter as células em frascos de cultura de 75^cm2 . Aspirar o meio de cultura e enxaguar as células com 1x PBS sem cálcio e magnésio.
   2. Adicionar 2 mL de tripsina-EDTA a 0,25% para destacar as células aderentes. Incubar por 5 min em TR e ressuspender as células em 10 mL de meio.
   3. Recolher as células do frasco de cultura num tubo de centrífuga de 15 ml. Centrifugar a 480 x g por 5 min em RT. Aspirar o meio.
   4. Ressuspender as células em 5 mL a 10 mL de meio, dependendo da confluência original da cultura, de modo que a concentração celular seja de 50-100 células por quadrado no hemocitômetro. Ajuste o volume, se necessário, para fornecer a densidade celular necessária para uma contagem precisa.
   5. Remover 100 μL de células e adicionar a um tubo de 1,5 mL contendo 100 μL de azul de tripano a 0,4%. Conte as células usando um hemocitômetro ou contador de células automatizado. Diluir as células para 3 x 10⁴ células/mL em meio de cultura sem vermelho fenol.
      NOTA: O meio DMEM sem vermelho de fenol é usado porque a exposição ao vermelho de fenol inibe a permeabilidade da membrana e pode contribuir para a autofluorescência de fundo.
   6. Seme 2,5 mL da suspensão celular (75.000 células) por poço em uma placa de 6 poços contendo uma lamínula de 22 x 22 mm pré-revestida com poli-D-lisina, de acordo com as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
   7. Cultivar as células numa incubadora com 5% de CO₂ humidificado a 37 °C durante a noite para permitir que as células se fixem à lamínula.
   8. Examinar a fixação das células sob um microscópio invertido com uma objetiva de 20x. As células devem estar totalmente presas à lamínula antes de prosseguir.
2. Preparação de soluções de estoque
   1. Para preparar uma solução-mãe de 1 mM (1.000x) de TMRE (MW = 514,96 g/mol) (ver Tabela de Materiais), dissolver 1 mg de TMRE em 1,94 mL de DMSO. Alíquota e conservar a -20 °C protegido da luz. Evite ciclos repetidos de congelamento/descongelamento.
   2. Para preparar uma solução-estoque de 50 mM (2.500x) de FCCP (MW = 254,17 g/mol) (desacoplador de fosforilação oxidativa mitocondrial), dissolver 10 mg de FCCP em 786,9 μL de DMSO. Alíquota e conservar a -20 °C protegido da luz. Evite ciclos repetidos de congelamento/descongelamento.
   3. NOTA: As soluções-estoque preparadas fazem parte do Kit de Ensaio de Potencial de Membrana Mitocondrial TMRE (consulte a Tabela de Materiais).
3. Determinação da concentração de TMRE para as linhagens celulares
   1. Preparar uma solução TMRE de trabalho de 500 nM em meio de cultura celular. Proteja a solução de trabalho da luz.
   2. Adicionar TMRE às células cultivadas nas lamínulas de cobertura em média até uma faixa de concentração final entre 50-200 nM. Faça isso aspirando primeiro o meio de cultura e substituindo-o por meio de cultura contendo TMRE.
   3. Incubar durante 20 min a 37 °C. Certifique-se de escalonar os tempos de tratamento para permitir a obtenção de imagens, uma vez que as células são vistas ao vivo.
   4. Lave as células duas vezes com 1x PBS e inverta a lamínula em uma lâmina de microscópio marcada com a concentração final de TMRE.
   5. Imagem imediata das células vivas (pico E_x/E_m = 549 nm/575 nm).
      NOTA: Imediatamente obter imagens das amostras uma vez retiradas das condições de cultura, uma vez que a saúde mitocondrial é comprometida uma vez que as células são removidas do meio e colocadas em uma lâmina de microscópio. Como alternativa às lamínulas, as células podem ser fotografadas em pratos com fundo de vidro.
   6. Capture as imagens usando o microscópio e software disponíveis.
      NOTA: Estabeleça parâmetros de imagem de microscopia experimental durante o processo de otimização da concentração de TMRE e mantenha as mesmas condições em experimentos subsequentes para garantir a comparação precisa de dados. O protocolo detalhado empregou microscópio confocal e software compatível (ver Tabela de Materiais).
   7. Selecione a concentração ideal de TMRE, que é dependente da linhagem celular.
      NOTA: A concentração de TMRE que fornece o melhor sinal para resolver alterações nos níveis de TMRE mitocondrial é geralmente a menor concentração de TMRE, dando um sinal de fluorescência uniforme e prontamente detectável.
4. Testando o estado polarizado de uma célula
   1. Preparação do ensaio
      1. Preparar as soluções-estoque de tratamento nas concentrações desejadas e preparar o meio com a concentração final do composto a ser ensaiado. Para FCCP, a solução-mãe deve ser de 20 mM (preparada com DMSO a partir de uma solução-mãe de 50 mM).
      2. Trabalhando em uma única lamínula de cada vez, adicione 1,8 mL de meio mais o composto de teste às células.
      3. Incubar as células com o composto de ensaio a 37 °C e 5% de CO₂ num ambiente humidificado durante o período de tempo desejado.
         NOTA: Os tempos de tratamento variam dependendo do mecanismo pelo qual o composto de teste pode alterar o potencial de membrana mitocondrial. Protonóforos potentes como o FCCP que despolarizam rápida e diretamente os potenciais de membrana mitocondrial requerem análise logo após o tratamento (dentro de minutos). Em contraste, os efeitos do tratamento com compostos que afetam indiretamente a função da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial, como aqueles que alteram a ativação ou o turnover proteico ou requerem síntese proteica, podem levar mais tempo para mostrar um efeito.
      4. Durante a incubação, ligue o microscópio e configure-o para os parâmetros de imagem ideais predeterminados, inclusive em termos de ganho, intensidade do laser, taxa de captura de imagem, média e tempo de exposição.
      5. Após o período de tratamento medicamentoso, adicionar 200 μL de 10x TMRE (concentração ótima determinada acima) às células controle e tratadas com o medicamento.
      6. Incubar por 15-30 min a 37 °C em 5% de CO₂ em ambiente umedecido. Aspirar suavemente o meio e enxaguar as células uma vez com 1x PBS.
      7. Repita a etapa de enxágue de 1x PBS para evitar o fundo causado pelo meio de cultura celular ou compostos de tratamento e inverta a lamínula em uma lâmina de microscópio rotulada com as condições de tratamento.
      8. Imagem das células vivas em E_x/E_m = 549 nm/575 nm. Usando um microscópio confocal, colete vários campos z-stack com captura de imagem de alta velocidade (512 pixels x 512 pixels, média = 4) antes da perda da integridade celular.
      9. Salve e armazene o arquivo de imagem para análise. O procedimento é repetido para a próxima condição experimental.
   2. Controles experimentais
      1. Utilizar um controlo sem tratamento (negativo), realizado como acima descrito (passos 3.1.1-3.1.8), sem o composto de ensaio no meio.
      2. Use um controle de ruptura de potencial de membrana mitocondrial (positivo) que consiste no composto protonóforo FCCP. Adicionar 1,8 ml de FCCP 20 μM (ver Tabela de Materiais) em meio às células. Conforme descrito acima (passos 3.1.1-3.1.2; e imagem celular, conforme descrito nas etapas 3.1.3-3.1.8), incubar por 10 min a 37 °C em 5 % de CO₂ em um ambiente umidificado antes da coloração com TMRE.
         Observação : controles positivos e negativos são necessários para esses experimentos.
   3. Quantificação
      1. Meça as intensidades de pixel capturadas de células individuais a partir de uma única imagem representativa da região central de cada pilha z. Neste trabalho, um único plano de foco foi selecionado para facilitar a análise.
      2. Analise as intensidades de pixel de pelo menos 30 células (em sua totalidade) por tratamento. Use Excel ou Prism para fazer a média das intensidades de pixel para cada tratamento, e apresente em formato de gráfico de barras com o erro padrão da média.
         NOTA: O ImageJ também pode ser usado para quantificação de fluorescência. Alternativamente, a fluorescência da coloração TMRE pode ser quantificada com plataformas de software comerciais.

3. Estabelecimento da função dos canais iônicos utilizando eletrofisiologia

NOTA: O procedimento nesta seção descreve o uso de um ensaio automatizado de eletrofisiologia para rastrear compostos de teste em uma linhagem de células cancerígenas (Figura 3).

1. Preparando as células
   1. Colher células de uma cultura saudável que não possui células mortas e/ou crescimento excessivo de células. Use a solução química de descolamento de células TrypLE ou um raspador manual de células para colher células aderentes e agrupadas. Dissociar células que crescem em aglomerados ou esferas, que são particularmente comuns entre as células cancerosas do SNC.
      NOTA: A dissociação suave das células ajuda a manter a integridade das proteínas de membrana essenciais para a condutância iônica.
   2. Centrifugar as células a 561 x g por 10 min no TR. Eliminar o sobrenadante e suspender o pellet em DMEM (sem vermelho fenol), HEPES e penicilina/estreptomicina com 20% de FBS e 4 mM de L-glutamina (ver Tabela de Materiais) mantidos a 37 °C.
      NOTA: O meio DMEM sem vermelho de fenol é usado porque a exposição ao vermelho de fenol inibe a permeabilidade da membrana.
   3. Plaqueie as células em uma lamínula revestida de poli-L-lisina em baixa densidade, para que haja separação entre as células individuais.
      NOTA: Poli-L-lisina é usada aqui, e não poli-D-lisina, como poli-L-lisina tem melhores propriedades de revestimento.
   4. Incubar as células a 37 °C e 5% de CO₂ numa câmara humidificada durante 12 h a 24 h (será necessário estabelecer um tempo óptimo) antes de efectuar um registo.
2. Registro eletrofisiológico
   1. Retire o meio das lamínulas. Lave suavemente as células duas vezes com 1x PBS. Adicione ~300 μL de solução de TrypLE. Usando a pipeta, pipetar suavemente para cima/para baixo quatro a cinco vezes até que as células estejam separadas.
   2. Adicionar meio livre de soro (DMEM) (livre de vermelho fenol) e manter uma contagem final de células por volume de pelo menos 1 milhão de células/mL. Usando uma pipeta de 1 mL, descubram as células para obter uma suspensão celular sem aglomerados celulares.
   3. Transfira a suspensão celular para um tubo de 1 mL. Incubar as células a 4 °C durante 10 minutos para estabilizar a membrana celular. Mantenha as células girando em um agitador (ciclo suave) para evitar a formação de aglomerados celulares.
   4. Prepare a configuração Port-a-Patch (consulte a Tabela de Materiais). Ligue o computador, o amplificador e o sistema de perfusão. Abra o software Patch-Master e crie um novo arquivo.
   5. Levar os tampões (extracelulares e internos) para a RT e, em seguida, carregá-los nos respectivos tubos de perfusão.
      NOTA: Os registos do recetor GABA_A requerem uma "solução extracelular (banho)" contendo 161 mM NaCl, 3 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 1,5 mM CaCl 2, 10 mM HEPES, e 6 mM D-glicose (pH ajustado para 7,4 usando NaOH) e uma "solução interna" contendo 120 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 10 mM EGTA, e HEPES 10 mM (pH ajustado para 7,2 usando NaOH).
   6. Encha a parte inferior de um chip de eletrodo (fornecido pelo fabricante) com 5 μL de solução interna e coloque o chip de eletrodo na parte superior de Faraday do Port-a-Patch. Adicione 10 μL de solução externa ao chip e observe o pulso retangular no osciloscópio usando o software Patch-Master (consulte a Tabela de Materiais).
      NOTA: A resistência pode estar na faixa de 2-3 MΩ, mas isso é dependente da linhagem celular.
   7. Inicie a gravação assim que o pulso retangular estiver visível, após os ajustes eletrônicos iniciais e depois que o software solicitar que o usuário adicione células.
   8. Adicione suavemente 20 μL de suspensão de célula única na parte central do eletrodo e aguarde o patch da célula seguido de um selo Giga-Ohm observando os valores de resistência no software.
   9. O progresso ao vivo do patch celular pode ser observado na coluna esquerda do software. Uma vez que a célula é "mantida no modo de célula inteira", comece as gravações abrindo um protocolo dentro do software.
   10. Defina o potencial de retenção em -80 mV. Execute um protocolo de gravação contínua sem lacunas usando o software Patch-Master para gravar a corrente da célula.
   11. Obtenha uma linha de base estável e mude para um ligante e respectiva aplicação de composto por uma duração especificada usando a guia de perfusão automatizada no painel esquerdo do software.
   12. Adquira dados usando o software Patch-Master.
       NOTA: Os dados são filtrados passa-baixa a 1 kHz e digitalizados a 100 kHz.
   13. Execute a análise de dados calculando a amplitude máxima da resposta atual usando o software Nest-o-Patch (consulte a Tabela de Materiais).

4. Potência in vitro

NOTA: Este procedimento detalha um ensaio MTS para determinar a potência da droga. O One Solution Cell Proliferation Assay combina todos os reagentes de ensaio necessários em uma solução preparada que pode ser adicionada em uma etapa a poços de cultura celular para avaliar a viabilidade e proliferação celular após o tratamento com compostos experimentais. O reagente é reconstituído de acordo com as recomendações do fabricante (ver Tabela de Materiais), aliquotado e armazenado a -20 °C. A seção descreve o uso do ensaio para determinar o CI₅₀ dos compostos de teste em uma determinada linhagem celular (Figura 4). Este reagente MTS também pode ser usado para a triagem de alto rendimento de um grande número de compostos em concentrações conhecidas.

1. Preparando as células
   NOTA: O número de células depende do crescimento e metabolismo de cada linha celular individual. Determinar o número ideal de células experimentalmente antes de usar o ensaio para avaliar quaisquer tratamentos experimentais.
   1. Colher células aderentes da cultura por tripsinização e usar Accutase (ver Tabela de Materiais) para dissociar as células que crescem em aglomerados ou esferas.
      NOTA: Glioblastoma e linhagens celulares primárias de meduloblastoma muitas vezes requerem Accutase, pois tendem a crescer em aglomerados ou esferas.
   2. Conte as células e faça uma solução celular com 10.000 células por poço em um volume de 75 μL. Faça diluições do estoque para os números de células a serem testados. Preparar pelo menos 1 ml por diluição.
   3. Placa de 75 μL de cada diluição em conjuntos de cinco poços consecutivos em uma placa de 96 poços. Incubar a 37 °C e 5% CO₂ durante a noite em um ambiente umidificado (ou seja, uma incubadora).
      NOTA: Linhagens celulares com crescimento lento ou metabolismo (que acidificam seu meio de crescimento em mais de 3 dias) podem exigir mais de 10.000 células como a faixa superior de número de células, enquanto as linhas celulares que crescem rapidamente (geralmente mais rápido do que 20 h de tempo de duplicação) requerem menos células. Linhagens celulares com alto metabolismo podem requerer menos de 1.000 células por poço. A faixa de células pode ser ajustada para determinar a densidade de plaqueamento ideal para o ensaio MTS para essas linhagens celulares.
2. Controle de tratamento simulado
   1. Adicionar 25 μL de meio por poço para simular a adição do composto de ensaio no ensaio MTS.
      NOTA: No ensaio MTS real, 25 μL de um estoque de 4x da concentração de tratamento escolhida para o composto de teste (aqui um modulador do receptor_{GA A} , QH-II-066) serão adicionados às células para dar a concentração de tratamento final de 1x em um volume total de 100 μL por poço.
   2. Incubar a 37 °C e 5 % CO₂ num ambiente humidificado durante 48 h. Isso simula a incubação padrão na presença de um medicamento.
3. Ensaio MTS
   1. Descongelar as alíquotas necessárias do reagente MTS. Adicionar 20 μL de reagente MTS por poço. Incubar a 37 °C e 5 % CO₂ num ambiente humidificado durante 1 h.
   2. Centrifugar a placa (1.350 x g por 5 min) à temperatura ambiente para remover bolhas, que podem interferir na leitura da absorbância.
      NOTA: Remova quaisquer bolhas com uma agulha de calibre fino.
   3. Leia a absorbância a 490 nm. Salve os dados como um arquivo do Excel.
   4. Devolver as placas a 37 °C em 5% de CO₂ e ler repetidamente dentro do intervalo linear de 4 h do ensaio.
      NOTA: Não há necessidade de recentrifugar antes de ler a absorbância. Dados de leituras posteriores, especialmente a leitura de 2 h, podem ser importantes para examinar a rapidez com que uma linhagem celular metaboliza o reagente MTS e são úteis na seleção do número de células para a placa para o ensaio.
   5. Plote a densidade óptica de absorbância (OD) a 490 nm (OD₄₉₀) versus o número de células plaqueadas usando Excel ou Prism.
   6. Selecione o número da célula para o ensaio. O número ótimo de células estará na faixa linear e abaixo da saturação (OD₄₉₀ = 1).
      NOTA: Para células com crescimento lento, o maior número de células plaqueadas pode ser ajustado para 20.000 células por poço, e 500 células por poço podem ser deixadas de fora do ensaio.
4. Determinação do CI₅₀
   1. Dia 1: Plaquear as células para o ensaio MTS
      1. Registre o nome da linha celular e o número de passagem de cada linha no estudo. Para combater a evaporação durante o ensaio, no mínimo, preencha as fileiras superior e inferior do perímetro externo e as colunas finais do perímetro esquerdo e direito da placa de 96 poços com 1x PBS, 100 μL por poço, para combater a evaporação durante o ensaio.
      2. Placar o número ideal de células para cada linhagem celular, conforme determinado antes do início do ensaio. Plaquear as células em 75 μL por poço de meio livre de fenol, livre de antibióticos, que não contenha tampão HEPES. O FBS pode ser aumentado para 20% para suportar o crescimento das linhas celulares.
         NOTA: Meio sem vermelho de fenol é usado porque a exposição ao vermelho de fenol inibe a permeabilidade da membrana.
      3. Juntar a amostra em, pelo menos, quintuplicata para a concentração de tratamento. Conte as células usando um hemocitômetro manual ou automatizado.
         OBS: Para utilizar um hemocitômetro manual, (1) preparar uma diluição 1:1 das células ressuspensas em meio em azul de tripano; (2) incubar 5-15 min, dependendo da linhagem celular; (3) carregar 10 μL das células em azul de tripano na câmara de contagem do hemocitômetro; (4) contar as células viáveis nos quatro cantos e quadrados médios e determinar o número médio de células por quadrado; (5) calcular as células viáveis por mililitro da seguinte forma:
         Células viáveis por mL = Média de células viáveis × 2 (fator de diluição) × 10⁴
      4. Use um volume suficiente para preparar a concentração desejada de células em meio livre de fenol vermelho, livre de antibiótico que não contenha tampão HEPES (ou seja, 75 μL por poço x 60 poços por placa = 4,5 mL de células por placa).
         NOTA: Cada placa precisa ter um controle somente médio para a subtração em segundo plano. O controle médio pode substituir os poços PBS se necessário.
   2. Dia 2: Adição do composto de tratamento
      1. Preparar os tratamentos experimentais a 4x a concentração final desejada para dar a concentração final desejada quando 25 μL de soluções de tratamento são adicionados às células plaqueadas em 75 μL de meio (= 100 μL de volume total por poço).
      2. Preparar as soluções de ensaio (neste caso, o modulador do receptor GABA_A QH-II-066) por diluição em série das reservas de maior concentração. Por exemplo, se as concentrações finais do fármaco forem 5,0 μM, 2,5 μM, 1,25 μM, 0,625 μM e 0,3125 μM, então prepare diluições seriadas 1:1 começando com 20 μM para obter concentrações de 10 μM, 5 μM, 2,5 μM e 1,25 μM, respectivamente.
         NOTA: Cada placa requer dois controles baseados em células, além do controle somente de meio: células não tratadas (meio sozinho) e células tratadas com solvente (geralmente DMSO) em uma concentração conhecida. É uma boa prática garantir que o veículo não afete a proliferação celular na faixa ativa do composto.
      3. Uma vez adicionado o composto de ensaio, incubar as células a 37 °C e 5% de CO₂ num ambiente humidificado durante 48 horas.
   3. Dia 3: Realização do ensaio de proliferação celular (EMT)
      1. Calcular o volume de reagente MTS necessário (20 μL por 100 μL de cultura de teste) e descongelar o volume necessário de reagente MTS aliquotado (ver Tabela de Materiais).
      2. Vórtice e certifique-se de que o reagente está completamente em solução antes de usar. Pipetar o reagente descongelado em um reservatório estéril de 25 mL de reagente.
      3. Pipetar 20 μL do reagente MTS (usando uma pipeta multicanal) em cada poço da placa de 96 poços contendo amostras em 100 μL de meio de cultura.
      4. Incubar a placa a 37 °C e 5% CO₂ em ambiente umidificado por 1 h a 4 h. As placas podem ser lidas em vários pontos de tempo. Geralmente, as placas são lidas em 1 h e em 2 h ou 3 h.
      5. Bolhas no meio podem levar a resultados errôneos. Antes de ler no leitor de placas, gire a placa a 1.350 x g por 5 min à temperatura ambiente. Uma agulha ou uma ponta de pipeta pode ser usada para remover quaisquer bolhas que permanecem após a centrifugação.
      6. Medir a absorbância a 490 nm utilizando um leitor de microplacas ou espectrofotómetro adequado (ver Tabela de Materiais).
      7. Salve os dados como um arquivo do Excel.
         NOTA: O tempo de incubação na presença do composto de ensaio irá variar em função da taxa de metabolismo e do crescimento da linhagem celular em estudo, para além do composto a ser testado. Um período de incubação de 48 h é um bom ponto de partida para a maioria das linhagens celulares e compostos de teste.
5. Análise de dados
   1. Transfira os dados em um arquivo do Excel e organize os dados para cada réplica aumentando a concentração do composto de teste. Faça a média do valor de controle somente médio e subtraia esse valor dos dados experimentais.
   2. Determine a porcentagem de proliferação celular nos poços de tratamento em comparação com os poços de veículo (ou poços de controle tratados com solvente) definindo o controle para 100% de proliferação para cada replicação.
   3. Transfira os dados gerados no Excel para um programa de escolha. Os autores geralmente usam o software Prism (ver Tabela de Materiais) para determinar a concentração do fármaco que inibe a proliferação celular em 50% (IC₅₀).
   4. No software Prism, crie uma tabela de dados com coluna X como números de célula e coluna Y como OD médio para cinco valores de replicação em subcolunas lado a lado.
   5. Insira os valores de concentração de tratamento na coluna X ao analisar um tratamento medicamentoso. Rotule o eixo x com o nome do composto de tratamento e as unidades de concentração.
   6. Insira os valores calculados de viabilidade da célula de replicação da análise do Excel nas subcolunas Y. Rotular o eixo y como proliferação celular (%).
   7. Usando a ferramenta de análise, selecione Regressão não linear (ajuste de curva) em Análises XY.
   8. Selecione dose-resposta [inibição] vs. resposta normalizada - inclinação variável.
   9. Executar a função de análise. Veja a tabela de resultados para ver os valores de melhor ajuste calculados para IC₅₀ e o gráfico de ajuste de curva. O eixo x do gráfico pode ser alterado para uma escala logarítmica, se desejado.

Acima estão selecionados procedimentos que podem ser empregados para caracterizar canais iônicos em células cancerosas. O primeiro protocolo destaca a coloração de um canal iônico. Como detalhado, existem muitos desafios ao colorir um canal iônico ou, para esse assunto, qualquer proteína que esteja presente na membrana extracelular. A Figura 1 mostra a coloração para uma subunidade do receptor GABAA pentamérica. O segundo protocolo destaca os resultados dos testes do estado polarizado das mitocôndrias em células cancerosas. As mitocôndrias desempenham papéis essenciais para a viabilidade e proliferação celular, bem como para a morte celular. Em células de mamíferos, as mitocôndrias ativam a apoptose em resposta ao estresse celular através da liberação das proteínas da família Bcl-2 encontradas entre as membranas interna e externa das mitocôndrias. No citosol, as proteínas da família Bcl-2 ativam caspase proteases, que medeiam a morte celular programada. Alterações na função dos canais iônicos da membrana plasmática podem resultar em ruptura da homeostase iônica intracelular, inclusive em termos dos níveis iônicos dentro da mitocôndria, o que pode levar à perda do potencial de membrana, desencadeando apoptose14. Os níveis de Ca2+, K+, Na+ e H+ são determinantes importantes na sinalização de eventos que podem desencadear a morte celular iniciada pela mitocôndria. A Figura 2 mostra a coloração com o corante TMRE permeável à célula, carregado positivamente para marcar e obter imagens do potencial de membrana em mitocôndrias ativas, que mantêm uma carga negativa21,22. TMRE é um corante vermelho-alaranjado que se liga com mitocôndrias ativas por causa de sua carga negativa relativa. Mitocôndrias despolarizadas ou inativas têm potencial de membrana reduzido e, portanto, não sequestram TMRE. Neste experimento, o desacoplador de ionóforo FCCP é um importante controle, pois despolariza as membranas mitocondriais, prevenindo o acúmulo de TMRE23. O terceiro protocolo destaca a eletrofisiologia do patch-clamp unicelular. Na Figura 3 são mostrados registros representativos de um traço registrado da linhagem celular D283 do meduloblastoma derivado do paciente. Finalmente, o quarto protocolo destaca um ensaio para determinar o estado de proliferação de células cancerosas. Na Figura 4 são mostrados detalhes sobre como funciona o ensaio MTS e uma ilustração da placa e leitura quando incubada com um agente que prejudica a viabilidade das células cancerosas em estudo (neste caso, DAOY).

Figura 1: Coloração de células para canais iônicos. (A) Coloração da proteína Gabra5, uma subunidade do receptor GABAA, em células cancerosas de meduloblastoma D283. (B) Células fixas tratadas com a coloração fluorescente 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), que se liga ao DNA. (C) Fusão de células cancerosas de meduloblastoma coradas para Gabra5 e DAPI. Barras de escala = 10 μm. A figura é adaptada de Kallay et al.14. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Testando o estado polarizado das mitocôndrias . (A) Células vivas de câncer de meduloblastoma D283 são tratadas com concentrações crescentes da droga QH-II-066. As células são então tratadas com TMRE (tetrametilrodamina, éster etílico) permeável positivamente carregado, que se acumula em mitocôndrias ativas (carregadas negativamente). As mitocôndrias despolarizadas ou inativas têm potencial de membrana reduzido e, portanto, não conseguem reter o corante TMRE; Como resultado, eles mostram um sinal de baixa fluorescência. Imagem por microscopia de fluorescência; FCCP (carbonil cianeto 4-[trifluorometoxi] fenilhidrazona). Pico: λex, 549 nm; λem, 575 nm. Barras de escala = 10 μm. (B) Quantificação da coloração TMRE (imagens mostradas no painel A) utilizando a plataforma de software. Os dados são apresentados como média e erro padrão da média. A figura é adaptada de Kallay et al.14. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Estabelecimento da função dos canais iônicos por eletrofisiologia. (A) Mostra-se uma configuração ou equipamento Port-a-Patch, consistindo de uma gaiola de Faraday (a), câmara de gravação (b) e unidade de sucção (c, direita). (B) Vista superior da plataforma Port-a-Patch destacando a câmara de gravação equipada com entrada de perfusão (a), saída (b) e eletrodo de referência (c). (C) O Port-a-Patch é conectado a um sistema de perfusão por troca rápida de solução com modos automatizados e manuais de operação e reservatórios de solução. (D) Traço de corrente representativo de um registro eletrofisiológico de pinça de retalho de célula inteira usando um equipamento Port-a-Patch (Nanion) e células cancerosas de meduloblastoma D283. GABA (10 μM) foi aplicado por 5 s com potencial de retenção de −80 mV. (E) Traço representativo de corrente de um registro eletrofisiológico de pinça de retalho de célula inteira usando um equipamento Port-a-Patch (Nanion) e células cancerosas de meduloblastoma D283 com a co-aplicação de GABA (1 μM) e do agonistado receptor A GABA (anestésico geral) propofol (50 μM), que potencializa a corrente induzida apenas pelo GABA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Ensaio MTS para avaliar a potência da droga. (A) Reações químicas subjacentes ao "ensaio MTS" usado para avaliar a potência de um agente, refletido por uma redução na proliferação celular. Redução do MTS tetrazólio por células que são viáveis, gerando o corante formazana. (B) Uma placa de 96 poços mostrando os resultados colorimétricos de um ensaio de MTS com concentrações crescentes do fármaco. Neste experimento, as células cancerosas de meduloblastoma DAOY são tratadas com concentrações crescentes de uma droga pré-clínica, KRM-II-08, um modulador alostérico positivo do receptor GABAA . (C) Uma curva dose-resposta gerada com o ensaio MTS (a partir da quantificação da placa de 96 poços). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Comparação dos ajustes eletrofisiológicos manual versus semi e/ou totalmente automatizado.

D.A.P.K. é cofundador, presidente e CEO da Amlal Pharmaceuticals Inc.