Cultura não fracionada em massa de músculo esquelético de camundongo para recapitular nicho e quiescência de células-tronco

O movimento, a respiração, o metabolismo, a postura corporal e a manutenção da temperatura corporal dependem do músculo esquelético, e o mau funcionamento do músculo esquelético pode, portanto, causar patologias debilitantes (por exemplo, miopatias, distrofias musculares, etc.) ¹. Dadas suas funções essenciais e abundância, o músculo esquelético tem chamado a atenção de laboratórios de pesquisa em todo o mundo que se esforçam para entender os principais aspectos que suportam a função muscular normal e podem servir como alvos terapêuticos. Além disso, o músculo esquelético é um modelo amplamente utilizado para estudar a regeneração e a função das células-tronco, uma vez que o músculo saudável pode se auto-reparar completamente após lesão e degeneração completas, principalmente devido às suas células-tronco^residentes2; São também chamadas de células satélites e estão localizadas sob a lâmina basal, na periferia das fibras^musculares3.

As células centrais do músculo esquelético adulto são as miofibras (células multinucleares sinciciais longas) e as células satélites (células-tronco com potencial miogênico que ficam quiescentes até que uma lesão as ative). Estas últimas células são as células centrais da regeneração muscular, e esse processo não pode ocorrer na sua ausência 4,5,6,7. Em seu microambiente imediato, existem múltiplos tipos celulares e fatores moleculares que sinalizam para eles. Esse nicho vai se estabelecendo ao longo do desenvolvimento e até a idade^adulta8. O músculo adulto contém vários tipos celulares (células endoteliais, pericitos, macrófagos, progenitores fibroadipogênicos-FAPs, células T reguladoras, etc.) ^9,10 e componentes da matriz extracelular (lamininas, colágenos, fibronectina, fibrilinas, periostina, etc.) ¹¹ que interagem entre si e com as células satélites no contexto da saúde, doença e regeneração.

Preservar esse nicho complexo em ambientes experimentais é fundamental, mas desafiador. Igualmente difícil é manter ou retornar à quiescência, um estado celular crítico para as células satélites⁹. Vários métodos foram introduzidos para enfrentar parcialmente esses desafios, cada um com suas vantagens e desvantagens (detalhado na seção de discussão). Aqui, é apresentado um método que pode superar parcialmente essas duas barreiras. Os músculos são inicialmente colhidos e, em seguida, quebrados mecânica e enzimaticamente antes que a mistura de células heterogêneas seja colocada em cultura. Ao longo da cultura, muitos tipos celulares do nicho são detectados, e células satélites que retornaram à quiescência são observadas. Como última etapa do protocolo, são apresentadas as etapas de imunofluorescência que permitem a detecção de cada tipo celular por meio do uso de marcadores universalmente aceitos.

Todas as experiências cumpriram os regulamentos animais franceses e da UE no Institut Mondor de Recherche Biomédicale (INSERM U955), nomeadamente a diretiva 2010/63/UE. Os animais foram mantidos em ambiente controlado e enriquecido nos biotérios com os números de certificação A94 028 379 e D94-028-028; Eles foram manuseados apenas por pesquisadores autorizados e cuidadores de animais, e foram inspecionados visualmente pelo pessoal do alojamento de animais em busca de sinais de desconforto durante sua vida. Foram eutanasiados por luxação cervical antes da dissecção. Nenhum procedimento intervencionista foi realizado durante a vida dos animais; assim, não era necessária a aprovação do procedimento por um Comitê de Ética e pelo Ministério do Ensino Superior, Pesquisa e Inovação da França. De fato, nenhuma autorização ética é necessária para a eutanásia e dissecção post-mortem, de acordo com a diretiva 2010/63/UE. Os resultados apresentados neste manuscrito são da linhagem selvagem C57BL/6NRj (ver Tabela de Materiais) e da linhagem transgênica Tg:Pax7-nGFP ¹² (criada por nossa equipe). O protocolo foi aplicado em camundongos machos e fêmeas com idades entre 8 e 12 semanas de idade.

1. Pré-digestão da preparação de reagentes e equipamentos

1. Borrife as ferramentas de dissecção (tesouras retas e curvas, pinças, ver Tabela de Materiais) com etanol 70% e seque-as com papel. Revestir uma placa de cortiça com papel alumínio e manter placas de Petri de 10 cm (uma por animal) por perto. Ter papel e 70% de etanol ao alcance.
   OBS: Ao final da dissecção, enxágue as ferramentas de dissecção com água, pulverize-as com etanol 70% e seque-as com papel.
2. Definir um banho-maria rotativo a 37 °C e preparar a mistura de digestão (20 mL/animal) combinando DMEM com penicilina-estreptomicina a 1%, colagenase a 0,5 U/mL, dispase de 3 U/mL (ver Tabela de Materiais) e BSA a 0,2% em tubo(s) de 50 mL.
3. Passar a mistura de digestão através de um filtro de 0,22 μm em uma capela de cultura celular.
   NOTA: Recomenda-se preparar a mistura de digestão fresca sempre.

2. Preparação de reagentes e equipamentos pós-digestão

1. Após a digestão, a mistura pode ser congelada ou cultivada. Para congelamento, preparar DMSO a 10%: soro fetal bovino (SFB) a 90%, bem como um conjunto de criotubos (1 mL de suspensão celular por 2 mL de criotubo). Para a cultura, preparar meio de cultura (DMEM suplementado com penicilina-estreptomicina a 1%, 4 ng/mL de bFGF e SFB a 20%) e um conjunto de placas de 8 poços. As placas devem ser revestidas antes de chapear as células (os pormenores são fornecidos na etapa 7.1).
2. Para a coloração, preparar paraformaldeído (PFA) a 4% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) (0,15 mL/poço da placa de 8 poços) e solução de bloqueio (albumina de soro bovino livre de IgG a 5% [BSA] em PBS; 0,15 mL/poço da placa de 8 poços).
   CUIDADO: Não respire o pó de PFA; Prepare-o e manuseie-o sob um capô químico.

3. Dissecção

1. Borrifar o animal eutanasiado com etanol 70%. Faça uma incisão horizontal (lado esquerdo do corpo para o lado direito) com tesouras grandes ao nível do abdômen, e corte ao redor da cintura. Retirar a pele dos membros pélvicos para revelar a musculatura (Figura 1A).
2. Coloque o animal sobre a placa de cortiça coberta de papel alumínio e fixe o membro anterior e o membro posterior opostos. Remova rapidamente todos os músculos dos membros posteriores (frente e costas) em uma placa de Petri de 10 cm colocada sobre gelo (Figura 1B,C). Tome especial cuidado para remover o tecido adiposo das áreas ao redor do quadríceps e dos músculos posteriores. Fáscia, nervos e tendões também podem ser removidos neste momento se isso não comprometer o tempo total gasto na dissecção.
   NOTA: Um tempo ideal de dissecção para ambos os membros posteriores deve ser em torno de 15-20 min. Aconselha-se que o tempo de dissecção não exceda 30 min.
3. Adicione gotas de DMEM aos músculos ocasionalmente para mantê-los úmidos, mas não muito, pois isso tornará o corte difícil. Repita para o outro membro posterior. Uma vez que todos os músculos de um animal estejam na placa de Petri (Figura 1D), pique-os finamente com tesoura por 7-10 min para obter um homogeneizado liso (Figura 1E).
   NOTA: Neste protocolo, DMEM suplementado com L-glutamina, piruvato, e 4,5 g/L D-glicose é usado.

Figura 1: Preparo muscular pré-cultura. (A) A pele é removida para revelar os músculos dos membros posteriores, conforme descrito no passo 3.1. (B,C) Todos os músculos dos membros posteriores são colhidos (B) ao redor e (C) entre os ossos, conforme descrito no passo 3.2. (D) Os músculos colhidos são colocados em uma placa de Petri de 10 cm sobre gelo com gotas de DMEM para mantê-los úmidos, conforme descrito no passo 3.3. (E) Os músculos são finamente picados com tesoura até obter uma pasta lisa com a consistência retratada nesta imagem. (F) Imagem do pellet após a centrifugação final; A seta azul destaca a pelota, que está contra o tubo, sob a linha azul tracejada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Digestão

NOTA: No final da digestão, é necessária uma centrífuga a 4 °C, um balde de gelo, três filtros de células (100 um, 70 um, 40 um) e três tubos de 50 ml (por animal) para a secção 5.

1. Preparar e filtrar a mistura de digestão conforme descrito na etapa 1.2. Mantenha a mistura no gelo.
2. Depois de cortados todos os músculos, coloque o homogeneizado num tubo de 50 ml com 20 ml de mistura de digestão. Embrulhe as bordas da tampa com filme flexível para evitar vazamentos e coloque o tubo em banho-maria de agitação a 37 °C em velocidade baixa a média (50 rpm).
3. Após 1 h a 37 °C, abra a tampa e misture pipetando suavemente sete vezes para cima e para baixo com uma pipeta de 10 mL para obter uma mistura homogênea. Aplique uma nova película ao redor da tampa e coloque-a novamente no banho de água agitada. Após 1 h, retire o tubo e desligue o banho.
   NOTA: Para cultura, utilize este tempo de incubação para revestir as placas conforme descrito no passo 7.1 antes de passar para o ponto 5.

5. Filtração

1. Encher o tubo de digestão com DMEM frio (suplementado com penicilina-estreptomicina a 1%) até 50 mL. Misture invertendo o tubo três vezes. Mantenha o DMEM em um balde de gelo para as próximas etapas.
2. Coloque um filtro celular de 100 μm em um novo tubo de 50 mL. Passe a mistura digerida através do filtro de células para o novo tubo. Centrifugar a 600 x g durante 5 min a 4 °C. Despeje o sobrenadante em um recipiente de resíduos líquidos.
3. Ressuspender o pellet em 1 mL de DMEM gelado (suplementado com penicilina-estreptomicina a 1%). Encher o tubo até 50 mL com o mesmo DMEM. NOTA: Se a centrifugação for ignorada, a próxima pastilha será mais difícil de identificar e manter.
4. Coloque um filtro celular de 70 μm em um novo tubo de 50 mL. Passe a mistura centrifugada/ressuspensa através do filtro de células para o novo tubo. Centrifugar a 80 x g durante 5 min a 4 °C.
   NOTA: Esta etapa não é obrigatória, mas é recomendada para eliminar detritos celulares.
5. Coloque um filtro celular de 40 μm em um novo tubo de 50 mL. Passe o sobrenadante através do filtro celular para o novo tubo. Centrifugar a 600 x g por 5 min a 4 °C, despejar o sobrenadante em um recipiente de resíduos líquidos e ressuspender o pellet em FBS sob o capô de cultura. O pellet é muito pequeno nesta etapa (Figura 1F).
   NOTA: A filtragem através do filtro de 40 μm remove detritos, o que daria um sinal inespecífico na coloração posterior das culturas.

6. Congelamento (opcional)

NOTA: A secção 6 é opcional. O protocolo pode ser pausado após a filtragem, mas isso pode reduzir a sobrevivência celular e o sucesso da cultura.

1. Adicionar DMSO para obter uma relação DMSO:90% FBS de 10% e transferir para criotubos (1 mL de pellet ressuspendido por 2 mL de criotubo).
2. Coloque o criotubo a -80 °C numa caixa de poliestireno durante a noite. Passe para -150 °C no dia seguinte para armazenamento de longo prazo.
   NOTA: O armazenamento de curto prazo a -80 °C também é possível.
3. Ao iniciar a cultura, descongelar rapidamente o criotubo em banho-maria a 37 °C até que a suspensão celular tenha descongelado. Misturar com 4 mL de DMEM sob a coifa de cultura. Gire a 600 x g por 5 min a 4 °C. Pipetar o sobrenadante e continuar como descrito no passo 7.2.

7. Cultivo

NOTA: Espera-se que as suspensões de células congeladas ou frescas encham de 24 a 32 poços de três a quatro placas de 8 poços.

1. Revestir placas de 8 poços com a solução de revestimento, que deve ser descongelada a 4 °C ou no gelo (a solução de revestimento de estoque é normalmente mantida a -20 °C). Adicione 0,4 mL de solução de revestimento a um poço e pipete-o de poço para poço. Depois de transferir a solução de revestimento através de todos os poços, ela pode ser recolhida e recongelada para culturas futuras. Manter as placas revestidas a 37 °C durante 30 minutos antes de plaquear as células.
2. Adicionar DMEM (suplementado com 1% de penicilina-estreptomicina) suplementado com 4 ng/mL de bFGF (ver Tabela de Materiais) à suspensão de células FBS para obter uma relação FBS:80% DMEM de 20%.
   NOTA: Embora a adição de bFGF possa ser benéfica em culturas primárias de mioblastos e na produção de células satélites em culturas a granel, sua adição é opcional, pois sua omissão em culturas em massa de ~7 dias não compromete severamente o rendimento celular.
3. Placa de 0,4 mL da suspensão por poço (a partir do passo 7.2) nas placas revestidas de 8 poços.
   NOTA: Calcular 30^cm2 de cultura por animal para preparações congeladas e frescas.
4. Incubar as culturas a 37 °C com 5% de CO₂ por até 10 dias, trocando o meio todos os dias após a cultura começar a mudar para uma cor amarelada (geralmente 5-7 dias).
   NOTA: Para quantificar as células na fase S do ciclo celular^{13, adicionar 10} μM EdU 2 h antes da fixação. Para capturar a primeira fase S, adicione 10 μM de EdU do revestimento e fixe em 40 h de cultura.

8. Fixação

NOTA: As secções 8-10 devem ser conduzidas à temperatura ambiente, salvo indicação em contrário.

1. Pipetar o meio de cultura e fixar as células com PFA a 4% (0,15 mL/poço).
   CUIDADO: Adicione PFA sob uma capa química.
   NOTA: Se todos os poços estiverem fixados ao mesmo tempo, incubar com PFA à temperatura ambiente por 10 min. Se os poços forem fixados em momentos diferentes, adicione PFA aos poços a serem fixados e mantenha a placa na incubadora a 37 °C por 5 min.
2. Pipetar o PFA e adicionar PBS por 10 s (0,15 mL/poço). Pipetar o PBS e adicionar PBS fresco por 5 min (0,15 mL/poço).
   NOTA: Se todos os poços estiverem fixados ao mesmo tempo, incubar com PBS à temperatura ambiente. Se os poços forem fixados em pontos de tempo diferentes, adicione PBS aos poços fixos e mantenha a placa na incubadora a 37 °C por 5 min. Em seguida, adicione 0,4 mL de PBS e mantenha a placa na incubadora por até 1 semana.

9. Permeabilização e bloqueio

1. Quando estiver pronto para manchar, pipetar o PBS e permeabilizar com TritonX 100 a 0,5% em PBS (0,15 mL/poço) por 8 min. Pipetar o TritonX 100, enxaguar com PBS por 10 s (0,15 mL/poço), pipetar o PBS e lavar com PBS por 5 min (0,15 mL/poço).
2. Bloqueio com BSA livre de IgG a 5% em PBS por 30-60 min (0,15 mL/poço).

10. Coloração

1. Pipetar a BSA e adicionar a mistura de anticorpos primários diluída em PBS (0,15 mL/poço) (ver Tabela de Materiais; diluições: anti-CD31 1:100, anti-FOSB 1:200, anti-GFP 1:1.000, anti-KI67 1:1.000, anti-MyHC 1:400, anti-MYOD 1:200, anti-MYOG 1:150, anti-PAX7 1:100, anti-PDGFRa 1:50) para incubação noturna a 4 °C.
   NOTA: Após a incubação do anticorpo, recolher a mistura de anticorpos, adicionar azida sódica e manter a 4 °C ou -20 °C (de acordo com as instruções do fabricante do anticorpo) para futura reutilização.
2. Pipetar a mistura de anticorpos, enxaguar com PBS por 10 s (0,15 mL/poço), pipetar o PBS e lavar com PBS por 5 min (0,15 mL/poço).
3. Pipetar o PBS de lavagem, adicionar a mistura de anticorpos secundários (cabra anti-rato Alexa Fluor 488, cabra anti-coelho Alexa Fluor 555, cabra anti-rato Alexa Fluor 647, cabra anti-rato Alexa Fluor 555, cabra anti-frango Alexa Fluor 488, todos usados em diluições de 1:500-1.000) e marcador de núcleo (por exemplo, DAPI) diluído em PBS (0,15 mL/poço) (ver Tabela de Materiais), e incubar por 1 h em temperatura ambiente, protegido da luz.
4. Pipetar a mistura de anticorpos secundários, enxaguar com PBS por 10 s (0,15 mL/poço), pipetar o PBS, lavar com PBS por 5 min (0,15 mL/poço), pipetar o PBS e montar.
   NOTA: Se forem usadas placas de 8 poços com separadores removíveis, descasque os separadores antes de montar.

Este protocolo permite o cultivo de células musculares, preservando as células satélites e a maioria das células de seu nicho endógeno. A Figura 2 resume as principais etapas do protocolo, enquanto partes essenciais da dissecção e digestão são apresentadas na Figura 1. A dissecção da musculatura dos membros pélvicos é recomendada (Figura 1A-C), pois esse grupo muscular é bem estudado e compartilha origem desenvolvimental e hierarquiasmoleculares14. Recomenda-se preparar todas as misturas em condições estéreis. Além disso, menor contaminação da cultura foi observada quando a mistura de digestão foi passada através de um filtro de 0,22 μm sob uma capa de cultura celular.

Ao plaquear 1/30 de uma preparação a granel em placas de poço revestidas de 1 cm2, as células alongadas são visíveis 3-4 dias após o início da cultura. No entanto, isso pode variar dependendo da concentração celular, e as células alongadas podem começar a aparecer mais tarde, particularmente ao expandir preparações a granel congeladas. Aproximadamente 7 dias depois, o meio deve ter ficado amarelo e, neste ponto, são necessárias trocas diárias de meio. Além disso, neste ponto, os poços precisam ser cobertos com miotubos. As células endoteliais constituem uma pequena fração da cultura. A principal indicação de sucesso da cultura são as células PAX7+ abundantes, que podem necessitar de fixação e coloração. Um modelo de mouse conveniente que pode ser usado quando possível é a linha 12 Tg:Pax7-nGFP, que permite a visualização da positividade de PAX7 na forma de expressão de GFP; assim, as células satélites podem ser prontamente detectadas pelo repórter GFP. A GFP pode ser observada em aumento de 20x em microscópio de epifluorescência invertido, permitindo a análise do sucesso da cultura enquanto a cultura está em andamento. Isso também torna possível a imagem ao vivo de células PAX7-GFP em culturas em massa. As culturas não devem ser deixadas por mais de 10 dias. Depois disso, as células de reserva começam a diminuir em número, e os miotubos podem se desprender da placa. Culturas fracassadas, inclusive com base na experiência recente com culturas de células congeladas, ainda podem gerar uma grande proporção de fibras, mas muito poucas células PAX7-GFP. Ao utilizar camundongos sem marcador fluorescente para PAX7, é necessário realizar coloração para avaliar a eficácia da geração de células de reserva.

Os seguintes anticorpos foram testados e funcionam bem com o protocolo de coloração apresentado na seção 10 do protocolo: anti-PAX7 (um marcador de células satélites e mioblastos ativados 15; também um marcador de células de reserva que emergem nesta cultura), anti-miosina (um marcador de miotubos15), anti-CD31 (um marcador de células endoteliais16), anti-GFP (se forem usados camundongos repórteres), anti-MYOD (um marcador de mioblastos 15), anti-MYOG (um marcador de diferenciação de miócitos 15), anti-KI67 (um marcador de proliferação de células17) e anti-PDGFRα (um marcador de FAPs15). A Figura 3 mostra células miogênicas e de nicho após 7 dias em cultura. Em relação à Figura 3A-C, os volumes musculares foram cultivados a partir de camundongos selvagens, enquanto para a Figura 3D-F, os volumes musculares foram cultivados a partir da linhagem Tg:Pax7-nGFP mencionada. A dupla coloração com PAX7 e KI67 (Figura 3A) permitiu marcar as células de reserva que apareceram após 5 dias em cultura e apresentavam características de células-tronco musculares, como a saída do ciclo celular (status KI67-) e uma localização como "satélites" para os miotubos formados. A dupla coloração com MyHC e MYOG (Figura 3B,D,E) permitiu marcar as células que avançaram através da diferenciação muscular e, assim, expressaram progressivamente a MYOG e então se fundiram para formar miotubos MyHC+ multinucleados. A coloração com CD31 ou PDGFRα permitiu a marcação de células de nicho (Figura 3C), como células endoteliais e FAPs. A Figura 3D,E mostra células de reserva emergentes marcadas por GFP. A cocoloração com GFP e MyHC permitiu avaliar a posição das células satélites das células de reserva (Figura 3E), enquanto a co-coloração com GFP e outros marcadores de ativação/diferenciação permitiu avaliar a natureza quiescente das células de reserva (Figura 3F).

Figura 2: Uma visão geral das etapas do protocolo. (A-D) Etapas sequenciais de (A) dissecção, (B) digestão, (C) filtração e (D) cultura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Imunomarcação das populações celulares. (A) Imunofluorescência de células miogênicas (marcadas por PAX7; verde) e cicladoras (marcadas por KI67; vermelhas). Os núcleos são contracorados com DAPI (azul). A presença de células miogênicas não cicladoras (KI67-PAX7+) mostra que o protocolo pode produzir células quiescentes de camundongos selvagens que são abundantes aos 7 dias de cultura. (B) Imunofluorescência de miotubos (marcados por miosina de cadeia pesada [MyHC]; verde) e miócitos (marcados por MYOG; vermelho) após 7 dias de cultivo de células de camundongos selvagens. Os núcleos são contracorados com DAPI (azul). (C) Imunofluorescência de células miogênicas (marcadas por PAX7; verde), progenitores fibroadipogênicos mesenquimais (marcados por PDGFRa; vermelho) e células endoteliais (marcadas por CD31; magenta) após 7 dias de cultivo de células de camundongos selvagens. Os núcleos são contracorados com DAPI (azul). (D) Imunofluorescência de células GFP+ (verde) e miócitos (marcados por MYOG; magenta) após 8 dias de cultivo de células de camundongos Tg:Pax7-nGFP , nos quais as células que expressam PAX7 são marcadas por GFP nuclear. (E) Imunofluorescência de células GFP+ (verde) e miotubos (marcados por MyHC; vermelho) após 7 dias de cultivo de células de camundongos Tg:Pax7-nGFP . Note que as células satélites aparecem na cultura após 7 dias. (F) Quantificação da proporção de células GFP+ que co-expressa marcadores de células satélites (PAX7), ativação (FOSB), proliferação (KI67) ou diferenciação miogênica (MYOD, MYOG). As barras de erro indicam o desvio padrão. Barra de escala: 100 um. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.