Um método aprimorado para isolar locais de contato mitocondrial

As mitocôndrias desempenham uma variedade de funções diferentes em eucariotos, sendo a mais conhecida a produção de ATP através da fosforilação oxidativa. Outras funções incluem a produção de clusters ferro-enxofre, síntese lipídica e, em eucariotos superiores, sinalização de Ca²⁺ e indução de apoptose 1,2,3,4. Essas funções estão inseparavelmente ligadas à sua complexa ultraestrutura.

A ultraestrutura mitocondrial foi primeiramente descrita por microscopia eletrônica⁵. Foi demonstrado que as mitocôndrias são organelas bastante complexas que consistem em duas membranas: a membrana externa mitocondrial e a membrana interna mitocondrial. Assim, dois compartimentos aquosos são formados por essas membranas: o espaço intermembrana e a matriz. A membrana interna mitocondrial pode ser ainda mais dividida em diferentes seções. A membrana limite interna permanece próxima à membrana externa, e as cristas formam invaginações. As chamadas junções cristas conectam a membrana limite interna e as cristas (Figura 1). Além disso, micrografias eletrônicas de mitocôndrias osmoticamente encolhidas revelam que existem locais nos quais as membranas mitocondriais estão firmemente conectadas ^6,7. Esses chamados sítios de contato são formados por complexos proteicos que abrangem as duas membranas (Figura 1). Acredita-se que esses sítios de interação sejam essenciais para a viabilidade celular devido à sua importância para a regulação da dinâmica e herança mitocondrial, bem como para a transferência de metabólitos e sinais entre o citosol e a^matriz8.

O complexo MICOS na membrana interna mitocondrial é provavelmente o mais bem caracterizado e o mais versátil complexo formador de sítios de contato. O MICOS foi descrito em levedura em 2011 e consiste de seis subunidades 9,10,1 1: Mic60, Mic27, Mic26, Mic19^, Mic12 e ^Mic10. Estes formam um complexo de aproximadamente 1,5 MDa que se localiza nas junções cristais 9,10,11. A deleção de qualquer uma das subunidades principais, Mic10 ou Mic60, leva à ausência desse complexo ^9,11, o que significa que essas duas subunidades são essenciais para a estabilidade da MICOS. Curiosamente, o MICOS forma não apenas um, mas múltiplos sítios de contato com várias proteínas e complexos da membrana externa mitocondrial: o complexo TOM 11,12, o complexo TOB/SAM 9,12,13,14,15,16, o complexo Fzo1-Ugo1⁹, Por1 10^, OM45 10 e Miro ¹⁷. Isso indica fortemente que o complexo MICOS está envolvido em vários processos mitocondriais, como a importação de proteínas, o metabolismo de fosfolipídios e a geração da ultraestrutura mitocondrial¹⁸. Esta última função é provavelmente a principal função da MICOS, pois a ausência do complexo MICOS induzida pela deleção da CIM10 ou CIM60 leva a uma ultraestrutura mitocondrial anormal que praticamente carece completamente de cristas regulares. Em vez disso, as vesículas da membrana interna sem conexão com a membrana de contorno interno se acumulam^19,20. É importante ressaltar que o MICOS é conservado em forma e função desde a levedura até o ser humano²¹. A associação de mutações nas subunidades do MICOS com doenças humanas graves também enfatiza sua importância para eucariotos^{superiores22,23}. Embora o MICOS seja altamente versátil, sites de contato adicionais devem existir (com base em nossas observações não publicadas). De fato, vários outros sítios de contato foram identificados, por exemplo, as máquinas de fusão mitocondrial Mgm1-Ugo1/Fzo1^24,25,26 ou Mdm31-Por1^, que está envolvida na biossíntese da cardiolipina fosfolipídea mitocondrial específica²⁷. Recentemente, aprimoramos o método que nos levou à identificação do MICOS para identificar Cqd1 como parte de um novo sítio de contato formado com o complexo de membrana externa Por1-Om14²⁸. Curiosamente, esse sítio de contato também parece estar envolvido em múltiplos processos, como a homeostase da membrana mitocondrial, o metabolismo de fosfolipídios e a distribuição da coenzima Q^28,29.

Aqui, utilizamos uma variação do fracionamento mitocondrial descrito anteriormente9,30,31,32,33. O tratamento osmótico das mitocôndrias leva à ruptura da membrana externa mitocondrial e a um encolhimento do espaço matricial, deixando as duas membranas apenas próximas nos locais de contato. Isso permite a geração de vesículas que consistem exclusivamente de membrana externa mitocondrial ou membrana interna mitocondrial ou em locais de contato de ambas as membranas através de sonicação leve. Devido à membrana interna mitocondrial possuir uma relação proteína-lipídio muito maior, as vesículas da membrana interna mitocondrial exibem uma densidade maior em comparação com as vesículas da membrana externa mitocondrial. A diferença de densidade pode ser usada para separar as vesículas da membrana através da centrifugação por gradiente de densidade flutuante de sacarose. Assim, as vesículas da membrana externa mitocondrial acumulam-se em baixas concentrações de sacarose, enquanto as vesículas da membrana interna mitocondrial são enriquecidas em altas concentrações de sacarose. As vesículas contendo sítios de contato concentram-se em concentrações intermediárias de sacarose (Figura 2). O protocolo a seguir descreve detalhadamente esse método aprimorado, que requer menos equipamentos, tempo e energia especializados em comparação com o nosso método previamente estabelecido³², e fornece uma ferramenta útil para a identificação de possíveis proteínas do sítio de contato.

1. Amortecedores e soluções de reserva

1. Fazer uma solução de ácido 3-morfolinopano-1-sulfónico (MOPS) 1 M em água deionizada, pH 7,4. Conservar a 4 °C.
2. Preparar 500 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) em água deionizada, pH 8,0. Conservar à temperatura ambiente.
3. Preparar sorbitol 2,4 M em água deionizada. Armazenar à temperatura ambiente após autoclavagem.
4. Preparar sacarose 2,5 M em água deionizada. Armazenar à temperatura ambiente após autoclavagem.
5. Preparar fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF) 200 mM em isopropanol. Conservar a -20 °C.
   CUIDADO: PMSF É TÓXICO se ingerido e causa queimaduras graves na pele e danos oculares. Não respire a poeira e use luvas e óculos de proteção.
6. Preparar ácido tricloroacético (TCA) a 72% em água deionizada. Conservar a 4 °C.
   CUIDADO: O TCA pode causar irritação respiratória, queimaduras graves na pele e danos nos olhos. Não respire a poeira e use luvas e óculos de proteção.
7. Prepare o tampão SM: MOPS 20 mM e sorbitol 0,6 M, pH 7,4.
8. Prepare o tampão de intumescimento: MOPS 20 mM, EDTA 0,5 mM, PMSF 1 mM e coquetel inibidor de protease, pH 7,4.
9. Preparar os tampões de gradiente de sacarose: 0,8 M, 0,96 M, 1,02 M, 1,13 M e 1,3 M em 20 mM MOPS, e 0,5 mM EDTA, pH 7,4.
   NOTA: Todos os buffers podem ser armazenados a 4 °C; no entanto, recomenda-se armazenar os tampões contendo sacarose a -20 °C para evitar o crescimento de fungos. Os inibidores de protease devem ser adicionados frescos antes da utilização.

2. Geração de vesículas subsubcomdriais

1. Isole mitocôndrias de levedura bruta na hora de acordo com protocolos estabelecidos^34,35.
   NOTA: Para este experimento, mitocôndrias foram isoladas de Saccharomyces cerevisiae. A geração de mitocôndrias puras em gradiente desprovidas de outras organelas não é necessária.
2. Ressuspender 10 mg de mitocôndrias recém-isoladas em 1,6 mL de tampão SM (4 °C) por pipetagem (Figura 2, passo 1).
3. Transferir a suspensão mitocondrial para um balão de Erlenmeyer pré-resfriado de 100 mL.
4. Adicione lentamente 16 ml de tampão de inchamento utilizando uma pipeta de vidro de 20 ml. Aplique agitação suave constante sobre o gelo durante a adição. Este tratamento osmótico resulta na absorção de água para o espaço matricial. O inchaço da membrana interna mitocondrial irá romper a membrana externa. No entanto, ambas as membranas permanecerão em contato nos locais de contato⁹ (Figura 2, passo 2).
5. Incubar as amostras sob agitação suave constante durante 30 min sobre gelo.
6. Adicionar lentamente 5 mL de solução de sacarose 2,5 M usando uma pipeta de vidro de 5 mL para aumentar a concentração de sacarose nas amostras para aproximadamente 0,55 M. Esse tratamento osmótico resulta em um efluxo de água da matriz³⁶. O encolhimento da membrana interna destina-se a maximizar sua distância aos fragmentos residuais da membrana externa. Isso diminui a probabilidade de gerar vesículas híbridas artificiais das membranas interna e externa através da sonicação (Figura 2, passo 3).
7. Incubar as amostras sob agitação suave durante 15 minutos sobre gelo.
8. Submeter as mitocôndrias à sonicação para gerar vesículas de membrana subocondrial (Figura 2, passo 4).
   1. Transfira a suspensão mitocondrial para uma célula de roseta pré-resfriada.
   2. Sonicar a suspensão mitocondrial a uma amplitude de 10% por 30 s enquanto resfria a célula de roseta em um banho de gelo.
   3. Descanse a suspensão por 30 s em um banho de gelo.
   4. Repita as etapas 2.8.2 e 2.8.3 mais três vezes.
      NOTA: As condições de sonicação variam de acordo com o sonicator usado. A otimização será necessária para máquinas individuais. A sonicação que é muito dura levará à formação artificial de vesículas consistindo de membranas internas e externas mitocondriais.

3. Separação das vesículas sub-ocondrais

1. Separe as vesículas geradas das mitocôndrias intactas remanescentes por centrifugação a 20.000 x g por 20 min a 4 °C. As mitocôndrias intactas serão peletizadas enquanto as vesículas permanecerão no sobrenadante.
2. Concentrar a mistura de vesículas.
   1. Transfira o sobrenadante para tubos de ultracentrifugação frescos.
   2. Coloque uma almofada de 0,3 mL de solução de sacarose 2,5 M no fundo do tubo usando uma seringa de 1 mL equipada com uma cânula de 0,8 mm x 120 mm.
   3. Centrifugar a 118.000 x g por 100 min a 4 °C.
      OBS: Neste caso, foi utilizado rotor de caçamba oscilante com raio máximo de 153,1 mm. As condições de centrifugação dependem fortemente do rotor e terão que ser adaptadas quando outro rotor for usado.
3. As vesículas aparecerão como um disco na parte superior da almofada de sacarose após a centrifugação. Descarte aproximadamente 90% do sobrenadante. Agora, colha as vesículas concentradas ressuspendendo-as no tampão restante, incluindo a sacarose de 2,5 M, pipetando para cima e para baixo. Transfira a suspensão para um homogeneizador Dounce gelado.
4. Homogeneizar a suspensão com pelo menos 10 tempos utilizando um oleiro de politetrafluoretileno.
5. Prepare o gradiente de sacarose.
   1. Para um gradiente de passo de 11 mL com cinco passos (1,3 M, 1,13 M, 1,02 M, 0,96 M e 0,8 M de sacarose em MOPS 20 mM e EDTA 0,5 mM, pH 7,4), cada camada possui 2,2 mL de solução de sacarose.
      NOTA: Um refratômetro é recomendado para medir e ajustar as concentrações de sacarose; no entanto, não é essencial. Aplicar 10 μL do tampão no refratômetro e detectar os respectivos índices de refração. O cálculo da concentração de sacarose é o seguinte:
      
      1,3333 representa o índice de refração da água. 0,048403 é um índice de conversão específico da sacarose obtido a partir da escalonamento linear da refratividade molar à concentração de sacarose em soluções aquosas ³⁷.
   2. Adicione a maior concentração de sacarose ao tubo de centrifugação e coloque o tubo a -20 °C. Aguarde até que a camada esteja completamente congelada antes de aplicar a próxima. Prossiga em conformidade até que a última camada seja adicionada e armazene os gradientes a -20 °C.
      NOTA: Lembre-se de transferir os gradientes congelados para 4 °C ao iniciar o experimento para permitir que os gradientes descongelem. Isso levará aproximadamente 3 h. Para a centrifugação, utilizou-se um rotor basculante com capacidade de 13,2 mL. Quando um rotor diferente é usado, os volumes do passo de gradiente devem ser adaptados de acordo.
6. Medir a concentração de sacarose das amostras utilizando um refratómetro. Se não houver acesso a um refratômetro, pode-se alternativamente supor que a concentração de sacarose é de 2 M. Essa suposta concentração de sacarose será então a base para o próximo passo.
7. Ajustar a concentração de sacarose para 0,6 M pela adição de uma quantidade adequada de MOPS 20 mM, EDTA 0,5 mM, PMSF 1 mM e cocktail inibidor de protease, pH 7,4. Se a concentração de sacarose for estimada em 2 M em vez de ser medida, recomenda-se testar se a concentração é suficientemente baixa após o ajuste. Aplicar uma pequena alíquota da amostra (cerca de 50 μL) sobre 200 μL de sacarose 0,8 M num tubo de ensaio. A amostra deve ficar em cima da sacarose de 0,8 M.
8. Carregar as amostras (aproximadamente 1 mL) sobre o gradiente de sacarose (manter 10% para referência posterior). A pipetagem cuidadosa é importante para evitar a perturbação do gradiente (Figura 2, passo 5).
9. Separe as vesículas por centrifugação a 200.000 x g e 4 °C durante 12 horas. Se possível, ajuste a centrífuga para diminuir a aceleração e desaceleração para evitar a perturbação do gradiente (Figura 2, passo 6).
   OBS: Neste caso, foi utilizado rotor de caçamba oscilante com raio máximo de 153,1 mm. As condições de centrifugação dependem fortemente do rotor e terão que ser adaptadas quando outro rotor for usado.
10. Colher o gradiente de cima para baixo em frações de 700 μL usando uma pipeta de 1 mL. Isso resultará em 17 frações, o que permite uma resolução suficiente.

4. Análise das vesículas subocondriais

1. Concentrar as proteínas submetendo cada fração a duas precipitações de TCA realizadas sequencialmente³⁸ para preparar as amostras de SDS-PAGE.
   1. Adicionar 200 μL de TCA a 72% às fracções individuais e misturar até que a solução fique homogénea. Incubar as frações por 30 min sobre gelo e pelar as proteínas precipitadas por centrifugação a 20.000 x g e 4 °C por 20 min. Eliminar o sobrenadante, adicionar 500 μL de solução de TCA a 28 %, misturar bem e repetir o passo de centrifugação.
   2. Lavar os pellets com 1 ml de acetona (-20°C) e centrifugar durante 10 minutos a 20.000 x g e 4 °C. Descarte o sobrenadante e deixe os pellets secarem ao ar. Ressuspender os pellets em 60 μL de tampão de amostra SDS e incubar as amostras por 5 min a 95 °C.
      NOTA: Uma grande quantidade de sacarose permanecerá, particularmente nas frações de alta densidade, após a primeira precipitação de TCA. Isso será removido através da precipitação adicional de TCA.
2. Analisar 20 μL de cada fração por SDS-PAGE³⁹ e immunoblotting^40,41,42,43.

É relativamente fácil separar as membranas internas e externas mitocondriais. No entanto, a geração e separação de vesículas contendo o local de contato são muito mais difíceis. Em nossa opinião, duas etapas são críticas e essenciais: as condições de sonicação e o gradiente utilizado.

Normalmente, acredita-se que os gradientes lineares tenham uma resolução melhor em comparação com os gradientes de passos. No entanto, sua produção reprodutível é tediosa e requer equipamentos especiais. Portanto, estabelecemos um método para gerar um gradiente de passos com diferenças relativamente pequenas entre os passos individuais (ver passo 3.5). Especulamos que o gradiente de passo seria equilibrado após a centrifugação, resultando em um gradiente quase linear. Surpreendentemente, a determinação das concentrações de sacarose das frações individuais após centrifugação usando um refratômetro revelou que o gradiente de passo de fato tornou-se virtualmente linear após 12 h de centrifugação a 200.000 x g (Figura 3).

A importância da sonicação leve é evidente nesses resultados representativos. Em condições leves de sonicação (Figura 4A), o marcador de membrana externa mitocondrial Tom40 foi enriquecido nas frações iniciais de baixa densidade (Fração nº 4) e esteve virtualmente ausente nas frações posteriores. O marcador mitocondrial de membrana interna Tim17 foi concentrado em frações de alta densidade (fração nº 17). Em contraste, a proteína do sítio de contato Mic60 acumulou-se em frações de concentração intermediária de sacarose (Fração nº 12-14), indicando o sucesso na geração e subsequente separação das várias vesículas de membrana. Em contraste, com condições de sonicação mais severas, o marcador de membrana externa mitocondrial Tom40 pôde ser detectado em frações mais baixas do gradiente (Fração nº 14 e Fração nº 17, Figura 4B). Adicionalmente, houve uma quantidade significativa de Tim17 nas frações de densidade intermediária (Fração nº 13 e Fração nº 14, Figura 4B). O acúmulo inespecífico de marcadores de membrana externa e interna em frações de densidade intermediária indica a formação artificial de membranas mistas, o que inibe a identificação de proteínas candidatas.

Figura 1: Representação esquemática da ultraestrutura mitocondrial. Uma representação esquemática de uma mitocôndria para mostrar os diferentes compartimentos, membranas e localizações de proteínas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Fluxo de trabalho do fracionamento mitocondrial para isolar proteínas do sítio de contato. Uma visão geral esquemática do processo descrito no protocolo. As (1) mitocôndrias recém-isoladas estavam (2) osmoticamente inchadas (3) e depois encolhidas. (4) As mitocôndrias encolhidas foram submetidas à sonicação leve para gerar vesículas subsubcondriais. (5) A mistura de vesículas foi concentrada e carregada em um gradiente de passo de sacarose. (6) Por centrifugação, as vesículas da membrana externa mitocondrial foram enriquecidas em baixa concentração de sacarose, as vesículas da membrana interna mitocondrial em alta concentração de sacarose e as vesículas contendo sítio de contato em concentração intermediária de sacarose. Abreviações: MIM, membrana interna mitocondrial; MOM, membrana externa mitocondrial. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Geração de um gradiente linear por centrifugação. Dois gradientes de passo (1,3 M, 1,13 M, depois 1,02 M, 0,96 M e 0,8 M em MOPS 20 mM e EDTA 0,5 mM, pH 7,4) foram preparados em paralelo, e 1 mL de sacarose 0,6 M em MOPS 20 mM e EDTA 0,5 mM, pH 7,4, foi carregado em ambos os gradientes. Os gradientes foram submetidos à centrifugação a 200.000 x g e 4°C por 12 h e colhidos em 17 frações cada. A reprodutibilidade do método foi testada pela determinação da concentração de sacarose das frações simples dos gradientes individuais utilizando um refratômetro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Isolamento das proteínas do sítio de contato com pulso ultrassônico bem definido. (A,B) Mitocôndrias de leveduras recém-isoladas foram submetidas a tratamento osmótico e expostas à sonicação. As vesículas geradas foram separadas usando centrifugação por gradiente de densidade flutuante de sacarose. O gradiente foi fracionado, e as proteínas das diversas frações foram submetidas à precipitação por TCA. A distribuição das proteínas marcadores para a membrana externa mitocondrial (Tom40), membrana interna mitocondrial (Tim17) e sítios de contato (Mic60) foi analisada por immunoblotting usando os anticorpos indicados. (A) A sonicação leve (4 x 30 s, 10% de amplitude) resultou em uma separação clara das proteínas da membrana externa (frações de baixa densidade) e da membrana interna (frações de alta densidade). Adicionalmente, a proteína do sítio de contato Mic60 foi enriquecida com sucesso em frações de densidade intermediária. (B) A sonicação mais dura (4 x 30 s, 20% de amplitude) resultou na geração de vesículas híbridas e, portanto, não permitiu uma separação clara dos locais de contato. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.