Uma abordagem de visão mecânica para fluxos de trabalho de microscopia eletrônica de transmissão, análise de resultados e gerenciamento de dados

Os microscópios eletrônicos de transmissão (TEMs) e suas capacidades se beneficiaram enormemente dos avanços em câmeras, detectores, porta-amostras e tecnologias de computação. No entanto, esses avanços são dificultados por fluxos de dados desconectados, limitações da operação humana e análise de dados pesada ^1,2. Além disso, experimentos in situ e operacionais adaptam METs em laboratórios de nanoescala em tempo real, permitindo que amostras sejam estudadas em ambientes gasosos ou líquidos, aplicando simultaneamente uma gama de estímulos externos ^3,4,5. A adoção de fluxos de trabalho tão complexos apenas ampliou essas limitações, e o aumento resultante do tamanho e da complexidade desses fluxos de dados é uma área de crescente preocupação. Assim, há uma ênfase crescente na utilização da capacidade de ação da máquina para encontrar, acessar, interoperar e reutilizar dados, uma prática conhecida como princípios FAIR⁶. A publicação de dados de pesquisa de acordo com o conceito de princípios FAIR tem recebido atenção favorável de agências governamentais em todo o mundo^7,8, e a aplicação dos princípios FAIR usando software de visão mecânica é um passo fundamental para sua adoção.

Uma plataforma de software de sincronização de visão mecânica (MVS) foi desenvolvida em resposta aos pontos problemáticos específicos inerentes à realização e análise de experimentos complexos e pesados em metadados (particularmente experimentos in situ e operacionais)⁹. Uma vez instalado no TEM, o software MVS conecta, integra e se comunica com a coluna do microscópio, detectores e sistemas integrados in situ . Isso permite coletar continuamente imagens e alinhá-las com seus metadados experimentais, formando um banco de dados abrangente pesquisável, uma linha do tempo do experimento do início ao fim (Figura 1). Essa conectividade permite que o software MVS aplique algoritmos que rastreiam e estabilizam de forma inteligente uma região de interesse (ROI), mesmo quando as amostras estão passando por mudanças morfológicas. O software aplica ajustes em correções de estágio, feixe e digital conforme necessário para estabilizar o ROI por meio de suas funções Drift Control e Focus Assist . Além de enriquecer as imagens com os metadados brutos produzidos a partir dos diferentes sistemas experimentais, o software pode produzir novos metadados computacionais usando algoritmos de análise de imagens para calcular variáveis entre imagens, o que permite corrigir automaticamente desvios de amostras ou mudanças de foco.

As imagens de ETM e seus metadados associados, coletados por meio do software MVS, são organizados como uma linha do tempo experimental que pode ser aberta e visualizada por qualquer pessoa por meio da versão off-line e gratuita do software de análise, Studio (doravante denominado software de análise)¹⁰. Durante um experimento, o software MVS sincroniza e grava três tipos de imagens da câmera ou detector do microscópio, que são exibidas no topo da linha do tempo abaixo do visualizador de imagens: aquisição única (imagens individuais de aquisição única adquiridas diretamente do software TEM), raw (imagens do detector/transmissão ao vivo da câmera que não tiveram nenhuma correção de deriva digital aplicada; essas imagens podem ter sido fisicamente corrigidas via movimento de palco ou mudança de feixe) e desvio corrigido (imagens do detector/câmera transmissão ao vivo que foram digitalmente derivadas). Os dados coletados durante um experimento ou sessão podem ser refinados em seções menores ou trechos de dados, conhecidos como coleções, sem perda de metadados incorporados. A partir do software de análise, imagens, pilhas de imagens e metadados podem ser exportados diretamente para uma variedade de imagens de formato aberto e tipos de planilhas para análise usando outras ferramentas e programas.

A estrutura de controle de microscópio, estabilização e integração de metadados habilitada pelo software MVS também permite a implementação de programas ou módulos adicionais de visão mecânica, projetados para aliviar as limitações nos fluxos de trabalho atuais de TEM. Um dos primeiros módulos desenvolvidos para aproveitar essa plataforma de sincronização é a calibração da dose de elétrons e o rastreamento espacial das áreas expostas do feixe dentro da amostra. Todas as imagens de MET são formadas a partir da interação entre a amostra e o feixe de elétrons. No entanto, essas interações também podem resultar em impactos negativos e inescapáveis na amostra, como radiólise e dano por knock-on11,12, e requerem um equilíbrio cuidadoso entre a aplicação de uma dose eletrônica alta o suficiente para gerar a imagem e a minimização do dano resultante do feixe^13,14.

Embora muitos usuários confiem em medições de corrente de tela para estimar a dose de elétrons, este método tem sido mostrado para subestimar amplamente a corrente real do feixe¹⁵. Valores qualitativos de dose podem ser obtidos através da corrente de tela no mesmo microscópio com as mesmas configurações, mas reproduzir essas condições de dose usando microscópios ou configurações diferentes é altamente subjetivo. Além disso, quaisquer ajustes de parâmetros de imagem feitos pelo usuário durante o experimento, como tamanho do ponto, abertura, ampliação ou intensidade, requerem uma medição separada da corrente da tela para calcular a dose resultante. Os usuários devem limitar rigorosamente as condições de imagem usadas durante um determinado experimento ou medir e registrar meticulosamente cada condição de lente utilizada, complicando e estendendo significativamente o experimento além do que é viável para a operação normal do microscópio^16,17.

Dose, referido como software de dose para este protocolo, é um módulo de software de calibração de dose que utiliza um suporte de calibração dedicado projetado para permitir medições automatizadas de corrente. Um copo Faraday, o padrão ouro para calibração precisa da corrente do feixe¹⁵, é integrado na ponta do suporte de calibração. O software MVS executa uma série de calibrações de corrente de feixe e área de feixe para cada condição de lente e incorpora esses valores nas imagens no nível de pixel.

Neste artigo em vídeo, os protocolos de software MVS projetados para melhorar todas as áreas do fluxo de trabalho do MET são apresentados usando amostras representativas de nanomateriais. Uma amostra de nanopartículas de zeólita sensível ao feixe¹⁴ é usada para demonstrar os fluxos de trabalho de calibração e gerenciamento de dose. Realizamos um experimento representativo de aquecimento in situ usando uma amostra de Au/FeO_x nanocatalisador^18,19 que sofre alterações morfológicas significativas quando aquecida. Este experimento in situ destaca os algoritmos de estabilização do software e sua capacidade de agrupar múltiplos fluxos de metadados, o que é um desafio inerente para estudos in situ e operacionais. Embora não descrito no protocolo, devido à sua sensibilidade única à dose eletrônica, discutimos exemplos representativos da utilidade do software para estudos de EM-líquido (protocolos para os quais já foram relatados na literatura^20,21,22), e como essas técnicas podem ser aplicadas para melhorar a compreensão do efeito da dose em experimentos líquido-EM. Finalmente, mostramos como a análise de dados é simplificada usando o software de análise offline para visualizar, filtrar e exportar uma variedade de arquivos de imagem, vídeo e dados para outros formatos acessíveis.

Figura 1: Exemplos de interface do usuário para MVS e software de análise. (A) O painel de visualização de imagens e o painel de controle do software de sincronização. Uma conexão entre o MET e o software de sincronização é estabelecida ativando o botão Conectar, que transmite as imagens e metadados do microscópio para o software de sincronização. A partir do visualizador de imagens, o operador pode realizar uma variedade de operações assistidas por visão mecânica, como Drift Correct e Focus Assist. Ele também fornece a capacidade de aplicar imagens de marca e sessão de revisão sem interromper a coleta de dados. (B) Captura de tela do software de análise de imagem destacando a localização da Porta de Visualização de Imagem, Linha do Tempo e o painel Metadados e Análise. O software de análise pode ser acessado a qualquer momento durante um experimento para revisar as imagens adquiridas até aquele momento usando o botão Sessão de Revisão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Método 1: Calibração da dose do microscópio eletrônico de transmissão para os modos de imagem MET e MET de varredura (STEM)

1. Ligue o picoammetro e deixe-o aquecer durante um mínimo de 30 minutos antes de iniciar uma calibração da dose. Coloque o suporte de calibração de dose no MET e conecte o suporte de calibração ao picoammetro usando o cabo de conexão rápida.
2. Com o microscópio no modo MET , abra as válvulas da coluna e localize o orifício fiducial de 35 μm no porta-dose (Figura 2). Inicie o aplicativo de software MVS e selecione Dose (Automação de Calibração) nas opções de experimento.
   NOTA: A localização do furo fiducial é salva pelo software após a calibração inicial, permitindo que o software localize automaticamente sua posição para futuras calibrações.
3. Clique no ícone Conectar (Figura 1A) e selecione o microscópio para ativar a conexão entre o ETM e o software MVS. Uma vez conectado, as imagens da câmera/detector serão visíveis no visualizador de imagens do software.
   OBS: Não é necessário otimizar a altura eucêntrica, podendo a borda do orifício fiducial parecer embaçada devido à espessura da ponta. Isso não afetará as medições atuais.
4. Navegue até a guia Dose e, em seguida, para Calibração da dose. Selecione o processo de Calibração da Área de Dose , siga as instruções do software e insira os valores configuráveis pelo usuário solicitados (como as configurações de abertura e monocromador). Após a conclusão da Calibração da Área de Dose, selecione o processo de Calibração da Corrente de Dose e siga as instruções do software.
5. Repetir o processo de calibração (passo 1.4) para cada tamanho de ponto, abertura ou configuração monocromática que possa ser utilizada durante o experimento.
6. Quando o processo de calibração para o modo MET estiver concluído, calibre a dose de elétrons para o modo STEM repetindo a etapa 1.4.
   NOTA: O modo STEM não requer que a calibração da área de dose seja executada.
7. Quando todas as calibrações desejadas estiverem concluídas, clique em Fechar Sessão, remova o suporte de calibração de dose e retorne à tela inicial do software MVS.

2. Método 2: Determinação do limiar de dose usando o MVS e o software de dose

1. Carregue uma grade de MET padrão com uma amostra (nanopartículas de zeólita ZSM-5 disponíveis comercialmente foram usadas neste exemplo) em um suporte de MET padrão. Insira o suporte no ETM e localize uma região de interesse (nanopartículas de zeólita cristalina).
2. Abra o aplicativo de software MVS e selecione Outro.
   NOTA: Informações adicionais sobre a amostra (por exemplo, identificador e descrição da amostra, o nome do operador e notas do experimento) podem ser adicionadas ao campo de parâmetros experimentais.
3. Repita a etapa 1.3 para se conectar ao software MVS e navegue até a guia de metadados de imagem na interface do software MVS para selecionar os seguintes metadados a serem sobrepostos no fluxo de imagem mostrado na exibição ao vivo: Ampliação, Dose Máxima e Taxa de Dose. Outros metadados podem ser incluídos se o usuário desejar. Uma captura de tela da interface do software MVS mostrando os controles de gerenciamento de dose é fornecida no Arquivo Suplementar 1.
4. Abra a guia Dose e selecione Gerenciamento de dose e Ativar monitoramento de dose para ativar o rastreamento automatizado de dose de elétrons. Selecione Mostrar camada de dose para exibir a sobreposição de cor de dose.
5. Defina os valores para o nível de dose alta e a alta taxa de dose e pressione em Salvar (neste exemplo, foram usados valores de 60.000 e-/Å 2 e 500 e^-/Ų·s, respectivamente).
6. Navegue até a guia Configurações, selecione Dose e defina os valores de Opacidade do Mapa de Navegação de Dose e Opacidade de Sobreposição de Imagem de Dose (neste exemplo, foram usados valores de 0,50 e 0,30, respectivamente).
7. Na janela Live Image Viewer, ative a correção de desvio clicando em Drift Correct.
8. Navegue até a guia Exibição de Dados e plote os valores de metadados Desfocar e Quociente de Foco no eixo Y.
   Observação : qualquer um dos valores de metadados disponíveis pode ser plotado em tempo real durante o experimento a partir da tabela de exibição de dados.
9. Ative o Focus Assist e selecione Calibrar o foco para executar a calibração automatizada do assistente de foco. Quando a rotina Calibrar Foco estiver concluída, feche a guia Exibição de Dados .
10. Abra a guia Análise de Imagem no software MVS e ative as opções Live FFT e Quadrantes 1 & 2 .
11. Usando os controles de software do microscópio, ajuste as condições do feixe para que o fluxo de elétrons seja de ~500 e^-/Ų·s. e mova para uma nova região na amostra e centralize o ROI da amostra na visualização ao vivo do software MVS.
    NOTA: Ao fazer grandes movimentos de palco, o controle de deriva e o assistente de foco serão desativados automaticamente e devem ser reativados assim que o novo ROI for selecionado.
12. Anote as condições de dose no software usando a função Tag . Realce o ícone Tag e insira o texto desejado para indicar uma série específica de imagens dentro da linha do tempo. As imagens serão marcadas com este texto até que o ícone Tag seja desmarcado.
13. Mantenha uma taxa de dose constante enquanto obtém imagens contínuas da mesma ROI até que os picos correspondentes à estrutura atômica no gráfico FFT tenham desaparecido.
14. Reduza a ampliação, abra a guia Gerenciamento de dose e ative Mostrar camada de dose para sobrepor um mapa de dose codificado por cores.
    NOTA: Esta característica fornece uma referência visual das áreas da amostra que foram expostas ao feixe de elétrons e sua exposição de dose relativa. Destacar essas áreas em imagens individuais com o cursor indicará seus respectivos valores de dose.
15. Desconecte e encerre a sessão desmarcando Conectar e selecione Fechar Sessão. Salve uma cópia dos dados da sessão em uma fonte externa para evitar que os dados salvos no software MVS sejam substituídos durante experimentos subsequentes (Arquivo Suplementar 2).

3. Método 3: Metadados e análise de tendências e exportação de dados usando o software de análise

1. Inicie o software de análise (o software offline para visualizar os conjuntos de dados totalmente sincronizados) e abra o arquivo de sessão de experimento selecionando-o na biblioteca de arquivos.
   NOTA: Os usuários também podem acessar o software de análise por meio do ícone Revisar sessão no software MVS durante um experimento.
2. Exiba as imagens corrigidas de desvio ativando a guia DC abaixo da Porta de Exibição de Imagem e selecione as sobreposições de dados desejadas marcando suas respectivas caixas de Dados de Sobreposição na guia Metadados de Imagem (neste exemplo, Microscópio, Data/Hora, Taxa de Dose, Dose Máxima e Ampliação foram usados). Outros metadados podem ser plotados conforme o desejo do usuário.
3. Marque a caixa Linha do tempo para Dose máxima e Taxa de dose para adicionar um gráfico desses valores à linha do tempo. Realce ou role por esses gráficos para atualizar a imagem exibida no visor. Acesse uma variedade de ferramentas por meio das guias Notas, Análise de Imagens, Caixa de Ferramentas e Exibição de Dados.
   1. Acesse o FFT de cada imagem através da aba Análise de Imagem e clique em FFT ao vivo para atualizar o FFT enquanto percorre as imagens.
   2. Use o desvanecimento dos picos de FFT para determinar o ponto de tempo em que a estrutura da zeólita perde cristalinidade. Registre o valor de dose máxima registrado com essa imagem.
4. Use a opção Filtro para filtrar conjuntos de dados grandes facilmente em conjuntos de dados menores e compartilháveis sem perder seus metadados associados. Abra o painel de filtro e ajuste os controles deslizantes para que apenas os dados com uma taxa de dose igual ou superior a ~500 e^-/Ų·s sejam selecionados e salve a nova coleção usando o nome Estudo de Limite de Dose.
   Observação : filtros podem ser aplicados para qualquer um dos tipos de metadados associados.
5. Exporte as imagens e metadados da sessão para outros tipos de arquivo enriquecidos com barras de escala e sobreposições de metadados.
   1. Realce a coleção no painel da biblioteca e selecione Publicar clicando com o botão direito do mouse na seleção. Na janela Publicar , selecione as opções desejadas para a exportação do tipo de arquivo.
   2. Selecione a guia de dados corrigidos de desvio e aplique sobreposições de quaisquer metadados desejados e do FFT (posicione a sobreposição FFT conforme desejado; exemplos de imagens exportadas com o FFT são mostrados na Figura 3).
6. Exporte a série de imagens como um arquivo de filme usando a mesma opção Publicar . Selecione as imagens destacando-as na linha do tempo, usando as opções de filtro ou exportando o arquivo de banco de dados completo. Selecione o formato de filme, a taxa de quadros e o local do arquivo desejados. Um filme do experimento de degradação de zeólita obtido usando um ETM de 200 kV é fornecido no Arquivo Suplementar 3.
7. Exporte os metadados separadamente das imagens adquiridas como um arquivo CSV selecionando a opção Metadados (CSV) durante a publicação.
   Observação : imagens brutas e corrigidas de desvio são exportadas como CSVs separados (arquivo suplementar 4 e arquivo suplementar 5).

4. Método 4: Estudo de aquecimento in situ de ouro em nanopartículas de óxido de ferro

1. Dropcast um nanocatalisador (Au/FeO_x) suspenso em etanol em um aquecedor in situ E-chip, um suporte de amostra mico-eletroquímico (MEM), e deixá-lo secar ao ar. Monte a amostra no suporte de aquecimento in situ , insira o suporte com a amostra no MET e conecte o suporte à fonte de alimentação usando o cabo fornecido. Localize um ROI de amostra usando os controles TEM.
   NOTA: Este experimento usou um suporte de aquecimento que é totalmente integrado com o software MVS, permitindo que os metadados de temperatura sejam incorporados com as imagens.
2. Selecione a opção de fluxo de trabalho apropriada no software MVS (neste exemplo, o fluxo de trabalho de fusão foi usado, mas outros suportes de aquecimento do fabricante podem ser usados selecionando Outro).
3. Siga as instruções do fluxo de trabalho para confirmar a conexão elétrica entre o suporte e o E-chip de aquecimento, carregando o arquivo de calibração e executando uma verificação do dispositivo.
4. Conecte o microscópio ao software MVS, como mostrado anteriormente nas etapas 2.3-2.10 (neste exemplo, os valores de metadados para taxa de dose, dose máxima, correlação de correspondência, taxa de deriva e temperatura do canal A foram selecionados) e centralize a ROI da amostra no campo de visão.
5. Abra a guia Fusion AX e configure e aplique uma temperatura.
6. Clique no botão Configuração do Canal A para acessar as configurações de controle de temperatura. Selecione a função Temperatura e o modo de controle manual .
7. Clique no botão Experimentar para acessar os controles experimentais. Defina a taxa de rampa para 10 °C/s e a meta para 600 °C. Clique em Aplicar para iniciar o experimento.
   NOTA: O experimento pode ser pausado ou interrompido a qualquer momento usando os botões de acesso rápido no canto inferior direito do software MVS, sem abrir a guia Fusion AX .
8. Depois que a temperatura definida de 600 °C for atingida, abra a guia Fusion AX e selecione Experimentar. Altere a taxa de rampa para 2 °C e a meta para 800 °C. Clique em Aplicar para iniciar o experimento.
   NOTA: O procedimento para aplicar uma rampa de aquecimento depende do sistema de aquecimento in situ utilizado. As etapas destacadas acima para aplicar a rampa de temperatura se aplicam ao sistema usado neste exemplo.
9. Realce quaisquer eventos ou pontos de interesse durante o experimento usando o recurso de marcação, conforme mostrado na etapa 2.10. Continue a criar imagens da amostra e ajuste o perfil de temperatura conforme desejado. Quando terminar, clique em Encerrar Sessão e salve o arquivo de dados usando o software de análise (uma parte do arquivo de banco de dados discutido nos resultados representativos é fornecida como Arquivo Suplementar 6).
10. Abra o software de análise para revisar a sessão. Plote a temperatura, o fator de transformação do modelo, a taxa de dose e a dose cumulativa na linha do tempo. Exporte imagens e filmes conforme desejado usando as etapas descritas nas etapas 3.6 e 3.7. Imagens e filmes podem ser exportados com ou sem as sobreposições do mapa de dose (Figura 4).

Este trabalho destaca a utilidade da aquisição de dados usando o software MVS para imagens de TEM e experimentos in situ. O alinhamento do microscópio e a configuração da condição foram realizados e selecionados através dos controles padrão do fabricante do ETM. Após a configuração inicial, os protocolos apresentados neste artigo em vídeo foram conduzidos por meio do software MVS. Um ETM de 300 kV foi utilizado para todos os experimentos apresentados no protocolo de vídeo e dados representativos, exceto para os dados de comparação de zeólitas que foram adquiridos usando uma FEG fria de 200 kV (Figura 3D-F e Tabela 1). Todos os metadados foram coletados e alinhados às suas respectivas imagens automaticamente pelo software MVS.

Depois de iniciar o software e selecionar o fluxo de trabalho apropriado no menu, uma conexão com o microscópio é estabelecida ativando o botão Conectar na barra de ferramentas na extremidade esquerda do visualizador de imagens, como mostrado na Figura 1A. Quando o botão Conectar é realçado, as imagens e os metadados associados do microscópio são automaticamente transmitidos para o software MVS e aparecem no painel de visualização de imagens. Essas imagens e seus metadados associados são salvos cronologicamente em uma linha do tempo que pode ser aberta, revisada e analisada sem interromper o registro de novos dados na linha do tempo (Figura 1B). O streaming pode ser interrompido pelo usuário a qualquer momento, desativando o ícone Conectar .

Depois que a conexão é ativada, outros fluxos de trabalho que dependem da estrutura de software MVS podem ser acessados. Nos exemplos mostrados neste protocolo de vídeo, uma calibração de dose deve ser realizada antes de utilizar as outras funções do software MVS. A calibração da dose é um processo automatizado controlado pelo software MVS; ele usa um suporte de calibração de dose de copo Faraday dedicado para medir a corrente e a área do feixe para a combinação de parâmetros. O suporte de calibração do copo de Faraday, mostrado na Figura 2, conecta-se a um picoâmmetro externo, que mede com precisão a corrente do feixe. Uma vez inserido no microscópio, o orifício de alinhamento fiducial é centralizado e as condições de feixe desejadas a serem calibradas (tamanhos de pontos, aberturas e ampliações) são inseridas no software. O software executa uma série de etapas de calibração para cada combinação das condições selecionadas. Durante a calibração da dose, o suporte move-se automaticamente entre o copo coletor de corrente Faraday integrado e o orifício de passagem. A medição de corrente para cada combinação de condições de lente é medida no copo de Faraday pelo picoamperímetro. Em seguida, o software traduz o estágio para centralizar o feixe no furo transversal e a área do feixe é determinada através de algoritmos de visão mecânica. Esta série de medições constrói um perfil da relação entre a intensidade/brilho e a área do feixe. Isso permite que o software extrapole a área do feixe à medida que a configuração de intensidade/brilho é ajustada durante um experimento, independentemente do campo de visão. Os valores de dose cumulativa e taxa de dose são calculados usando essas medições de corrente e área do feixe e um arquivo de calibração de dose é gerado. Este processo define essencialmente uma "impressão digital" de dose para o ETM e suas condições individuais de lente. Uma vez calibrada a dose para o ETM, o usuário é capaz de operar normalmente e ajustar livremente a magnificação e a intensidade, sem perda de informação de dose ou anotação manual17. Após a conclusão da calibração, o suporte de calibração da dose é removido, permitindo que a amostra seja inserida normalmente. O processo de calibração para os modos MET e STEM normalmente leva menos de 10 min.

Depois de calibrar as condições de dose, uma amostra de nanopartícula de zeólita comprada comercialmente (ZSM-5) foi fotografada sob condições de alta taxa de dose para determinar a dose limite (cumulativa) na qual a amostra está muito danificada para fornecer informações estruturais. As nanopartículas ZSM-5 foram suspensas em etanol e dropcast em uma malha convencional de MET de cobre. Eles foram fotografados continuamente a 300 kV no modo MET usando um tamanho de ponto de 3 e uma abertura do condensador de 100 μm. A taxa de dose lida pelo software MVS em condições de alta taxa de dose foi de 519 e-/Å2·s. As nanopartículas no campo de visão foram fotografadas continuamente até que os picos na FFT desaparecessem, indicando degradação da estrutura cristalina, como mostrado na Figura 3A-C e Arquivo Suplementar 3. Sobreposições (que podem ser adicionadas durante um experimento ao vivo ou posteriormente no software de análise) foram aplicadas às imagens de ETM para mostrar a data e hora, taxa de dose, dose máxima (cumulativa) e magnificação. A taxa de dose manteve-se constante durante os experimentos, com a dose cumulativa (dose máx) aumentando em função do tempo. Os picos de FFT começaram a desaparecer após 42 s de imagem contínua (Figura 3B). Em 1 min e 20 s e uma dose cumulativa de ~60.000 e-/Å2, os picos de FFT desapareceram completamente (Figura 3C).

Para mostrar que este método de calibração gera medidas quantitativas de dose que podem ser aplicadas a outros microscópios operando sob diferentes configurações, o mesmo processo de calibração e experimento de degradação de zeólita foi conduzido usando um canhão de emissão de campo frio (FEG) de 200 kV MET e um tamanho de ponto de 1. Este microscópio foi calibrado usando o mesmo procedimento descrito no Método 1, e o mesmo experimento descrito no Método 2 foi realizado usando os novos ajustes de tamanho de ponto e abertura. As regulagens do feixe foram ajustadas de modo que a diferença na taxa de dose aplicada entre os dois experimentos fosse desprezível (499 e-/Å 2·s vs. 519 e-/Å2·s). Como mostrado na Figura 3D-F e resumido na Tabela 1, as manchas FFT desaparecem completamente após 1 min e 50 s de imagem contínua e uma dose cumulativa de 58.230 e-/Å2, o que se alinha com os valores obtidos no primeiro experimento.

Um exemplo de como o software MVS pode se beneficiar de experimentos in situ foi mostrado através da realização de um experimento de aquecimento. Uma amostra representativa de nanocatalisador, Au/FeOx (sintetizada seguindo um procedimento publicado19), foi selecionada como sistema de exemplo por sofrer mudanças morfológicas e estruturais dinâmicas em altas temperaturas. Essa mobilidade induzida pela temperatura torna desafiador manter a ROI centrada no campo de visão devido ao próprio movimento da amostra e à expansão térmica do próprio suporte da amostra durante as mudanças de temperatura18. Com os recursos Drift Correct e Focus Assist ativados, a amostra foi fotografada durante um período de ~30 s a 800 °C. Em temperaturas elevadas, as nanopartículas de ouro dentro do Au/FeOx migraram ao longo da superfície do suporte de óxido de ferro e sinterizaram para formar partículas maiores, como mostrado na Figura 4 e como um filme no Arquivo Suplementar 7. A Figura 5 mostra uma série de instantâneos de MET (Figura 5A-F) de uma região porosa dentro de um nanocatalisador Au/FeOx, registrados em vários pontos de tempo (Figura 5G) durante um experimento de aquecimento in situ. O valor de deriva coordenada da ROI foi calculado automaticamente pelo software. Os valores coordenados de deriva e temperatura das imagens ao longo da série são mostrados graficamente na Figura 5G. Como esperado, a deriva coordenada da amostra aumenta à medida que o perfil de temperatura aumenta, de uma taxa de ~9 nm/min para ~62 nm/min, e começa a diminuir em direção ao nivelamento à medida que a temperatura é mantida constante. Apesar dessa alta taxa de deriva e das alterações na morfologia da amostra, imagens de alta resolução são facilmente obtidas durante a rampa de temperatura, revelando movimento dentro da região porosa, como mostra o Arquivo Suplementar 8. Consulte o Arquivo Suplementar 9 para obter instruções de download e especificações do computador.

Figura 2: Calibração e rastreamento da dose de elétrons . (A) A dose é calibrada usando um porta-amostra dedicado que contém um coletor de corrente posicionado no plano da amostra para medições da corrente do feixe. (B) Ilustração das características do desenho da ponta: Esquerda: copo Faraday; Meio: furo fiduciário; Direita: através do furo (C). A dose de elétrons aplicada pode ser visualizada no software usando mapas codificados por cores para denotar diferentes exposições de dose dentro de uma imagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Degradação induzida por dose de elétrons de nanopartículas de zeólita (ZSM-5). (A-C) Instantâneos tirados durante um período de 1 min e 20 s mostrando dados de degradação obtidos com uma FEG de 300 kV e uma taxa de dose medida de 519 e-/Å2·s; a zeólita degrada-se dentro de 1 min e 20 s. (D-E) Instantâneos tirados durante um período de tempo de 1 min e 50 s mostrando dados de degradação obtidos com um MET FEG frio de 200 kV e uma taxa de dose de elétrons de 499 e-/Å2·s; as inserções mostram o ponto FFT desaparecendo com o tempo. A barra de escala é de 60 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: A sincronicidade AXON aplica algoritmos de visão mecânica para rastrear e estabilizar amostras em evolução dinâmica. Os metadados gerados durante o experimento podem ser plotados ao longo da linha do tempo, permitindo que o usuário emparelhe rapidamente uma imagem com seus metadados associados enquanto percorre a série de imagens geradas durante o experimento. (A-H) Imagens de uma amostra de nanocatalisador (Au/FeOx) a 800 °C registradas durante um período de 28 s com (A-D) e sem (E-H) a sobreposição do mapa de dose. As áreas vermelhas na sobreposição indicam regiões de exposição cumulativa elevada à dose e as áreas amarelas indicam regiões de menor exposição. Realçar um pixel individual indica a dose cumulativa para esse pixel. As setas brancas nos painéis E-H indicam duas partículas que se fundem durante o experimento, e a seta laranja indica a trajetória de uma partícula de ouro em movimento. (I) A linha do tempo do experimento gerada pelo software de análise para as séries de imagens mostradas em A-H. Os pontos laranjas na parte superior da linha do tempo denotam imagens brutas (não corrigidas digitalmente) e os pontos azuis denotam imagens corrigidas por desvio. As barras verticais laranjas indicam os pontos na linha do tempo correspondentes às imagens mostradas nos painéis A-H. A barra de escala é de 40 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Instantâneos de TEM de uma região porosa dentro de um nanocatalisador Au/FeOx em vários pontos de tempo. O software MVS estabiliza e centraliza a amostra mesmo durante altas taxas de deriva, como as que ocorrem durante uma rampa de temperatura através da aplicação de estágio, deslocamento do feixe e correções digitais, como indicado por algoritmos de visão mecânica. (A-F) Instantâneos de MET de uma região porosa dentro de um nanocatalisador Au/FeOx, registrados em vários pontos de tempo (G) durante um experimento de aquecimento in situ. A taxa de deriva do ROI é automaticamente calculada e registrada durante um experimento pelo software MVS. Conforme plotado em (G), à medida que o perfil de temperatura é alterado (a linha azul), a taxa de deriva (linha laranja) aumenta à medida que a temperatura aumenta e diminui à medida que a temperatura é mantida constante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Comparação sumária dos resultados de degradação de zeólitas obtidos de diferentes microscópios.

Arquivo suplementar 1: Captura de tela da interface do software MVS com a guia de gerenciamento de dose aberta. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 2: arquivo de banco de dados do software MVS do experimento de degradação de zeólita induzida por feixe. Este software de visualização/análise está disponível para download gratuito. Consulte o Arquivo Suplementar 9 para obter instruções de download e especificações do computador. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 3: Filme da degradação da zeólita induzida pelo feixe. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 4: arquivo CSV 1 (degradação de zeólita: dados brutos [somente correção mecânica]) Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 5: Arquivo CSV (degradação de zeólita: correção de deriva [correção mecânica + digital]) Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 6: Arquivo de banco de dados do software MVS Experimento de aquecimento in situ nanocatalyst. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 7: Filme do nanocatalisador a 800 °C com sobreposições de dose. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 8: Filme do nanocatalisador durante uma rampa de temperatura com valores de deriva coordenados. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 9: Instruções para baixar o software de análise gratuito. Clique aqui para baixar este arquivo.

Todos os autores são funcionários da Protochips, Inc.