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Artigo de método

Delineando o fenótipo metabólico de células renais derivadas de biópsia

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DOI:

10.3791/65457

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17 de junho de 2025

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1Soham and Shaila Ajmera Family Transplant Centre, University Health Network, 2Division of Nephrology, The Hospital for Sick Children, 3Division of General Surgery, University Health Network, 4Institute of Medical Science, University of Toronto, 5Program in Cell Biology, The Hospital for Sick Children Research Institute, 6Toronto General Hospital Research Institute, University Health Network, 7Division of Nephrology, Tallaght University Hospital, 8Trinity Kidney Centre, Trinity College Dublin, 9Department of Immunology, University of Toronto, 10Division of Nephrology, McMaster University and St. Joseph's Healthcare, 11Division of Nephrology, Department of Medicine, University Health Network, 12Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve um método único para conduzir o perfil metabólico de células renais derivadas de biópsia. A abordagem apresentada foi otimizada em suínos machos adultos saudáveis e tem o potencial de melhorar a avaliação em tempo real da viabilidade do aloenxerto renal. Este método também pode ajudar a descobrir uma nova biologia em várias doenças renais baseadas no metabolismo.

Resumo

O transplante renal é o tratamento ideal para a doença renal terminal; no entanto, os rins transplantados são frequentemente perdidos prematuramente, com até 50% de perda do enxerto 10 anos após o transplante. Uma das principais causas de perda prematura do enxerto é a lesão sofrida pelo enxerto no momento do transplante, conhecida como lesão de isquemia-reperfusão (IRI). A função tardia do enxerto (FTE), definida como a necessidade de diálise na primeira semana pós-transplante, é uma manifestação de IRI grave que mostra características funcionais e histológicas de lesão renal aguda (LRA). Embora os mecanismos que impulsionam a LRA permaneçam obscuros, evidências acumuladas sugerem que a função metabólica alterada no aloenxerto medeia a LRA e pode ser a razão para a FTE. Assim, decifrar e monitorar os fundamentos metabólicos da IRI melhorará nossa capacidade de diagnosticar e prevenir a LRA. Este artigo descreve um método único para avaliar a respiração mitocondrial (por meio da taxa de consumo de oxigênio), glicólise (taxa de acidificação extracelular) e níveis intracelulares de ATP em suspensões de células renais derivadas de biópsia por agulha. A metodologia foi otimizada em suínos machos adultos saudáveis e validada em um modelo suíno de autotransplante. A abordagem apresentada tem o potencial de melhorar a avaliação em tempo real da viabilidade do enxerto renal na clínica. O perfil do metabolismo em biópsias derivadas de pacientes também pode descobrir uma nova biologia em outras doenças renais baseadas no metabolismo.

Introdução

O transplante renal é o tratamento ideal para a doença renal terminal 1,2,3,4; no entanto, os rins transplantados são frequentemente perdidos prematuramente, com até 50% de perda do enxerto em 10 anos após otransplante 5. Os pacientes afetados têm maior morbidade e mortalidade e representam um grande fardo econômico para os sistemas de saúde6. Uma das principais causas de perda prematura do enxerto é a lesão sofrida pelo enxerto no momento do transplante, conhecida como lesão de isquemia-reperfusão (IRI). A IRI é uma lesão inevitável causada pela diminuição do fluxo sanguíneo, seguida de reperfusão7. A isquemia é caracterizada pelo acúmulo de succinato tecidual, que impulsiona o fluxo reverso de elétrons na cadeia respiratória mitocondrial, levando à produção de superóxido e subsequente lesão logo após a reperfusão8. A IRI em órgãos transplantados aumenta o risco de não função primária, função retardada do enxerto (FTE), rejeição e resultados inferiores do enxerto 8,9. A FTE, definida como a necessidade de diálise na primeira semana pós-transplante9, é uma manifestação de IRI grave10. Histologicamente, a FTE associada à IRI se manifesta como necrose tubular aguda (NTA) e lesão da microvasculatura. Funcionalmente, há diminuição da taxa de filtração glomerular (TFG) e do débito urinário, características de lesão renal aguda (LRA) no aloenxerto11. Apesar de sua importância, atualmente não existem tratamentos para LRA pós-transplante associada à isquemia-reperfusão. A falta de tratamentos decorre de uma compreensão incompleta dos mecanismos da doença e da falta de marcadores para identificar pacientes com maior risco de disfunção do enxerto durante os momentos críticos em que a lesão pode ser reversível12.

Evidências acumuladas sugerem que o metabolismo energético alterado no aloenxerto medeia a LRA e pode sustentar a FTE 13,14,15. As células renais geram energia por meio de dois mecanismos principais: respiração mitocondrial e glicólise16. Na IRI, a reperfusão resulta em disfunção mitocondrial17. Consequentemente, a glicólise torna-se a principal fonte de energia 13,18,19,20. A mudança metabólica na IRI promove a morte de células endoteliais tubulares e microvasculares, levando à LRA 21,22,23,24. Em um trabalho anterior, a NTA foi associada ao aumento da expressão de enzimas glicolíticas e níveis alterados de proteínas mitocondriais25, em consonância com a IRI no enxerto13,18. Além disso, em um modelo de autotransplante renal suíno, a isquemia seguida de armazenamento refrigerado levou à redução dos níveis de proteínas mitocondriais renais e aumento da excreção de lactato26. Em conjunto, esses achados solidificam a importância clínica do monitoramento do fenótipo metabólico dos aloenxertos renais, mesmo antes do transplante, uma vez que as características metabólicas basais no aloenxerto podem ser preditivas de disfunção do aloenxerto27.

Modelos de predição clínica de risco de rejeição e perda de aloenxerto em curto prazo foram desenvolvidos 28,29. No entanto, esses modelos carecem de precisão e não consideram as características moleculares do enxerto 30,31,32. Estudos recentes tiveram como objetivo atender a essa necessidade não atendida por meio da identificação de padrões moleculares no nível tecidual que estão associados a resultados inferiores do enxerto, como disfunção e rejeição do enxerto 13,14,15,25,33,34. Esses estudos dependem de medições moleculares em estado estacionário no gene 33,34,35, proteína25,26 e nível de metabólito13,14, deixando uma imagem incompleta do fenótipo metabólico do aloenxerto. Essa lacuna no conhecimento se deve em parte à incapacidade de medir a função metabólica e o estado energético de amostras derivadas de rins em um determinado momento. O desenvolvimento de um protocolo padronizado para determinar o fenótipo metabólico de células renais derivadas de biópsia, que pode potencialmente ser traduzido no estudo de amostras de pacientes, é justificado. Este artigo descreve um fluxo de trabalho exclusivo para avaliar a respiração mitocondrial (por meio da taxa de consumo de oxigênio), glicólise (taxa de acidificação extracelular) e níveis intracelulares de ATP em suspensões de células renais derivadas de biópsia. A metodologia foi otimizada usando núcleos de biópsia renal de suínos machos adultos saudáveis. Para facilitar a implementação clínica futura, os núcleos de biópsia foram obtidos com agulha 18 G, como nos protocolos clínicos padrão de amostragem de enxerto renal36,37. Finalmente, a utilidade da implementação do protocolo em condições experimentais discriminatórias foi validada em um modelo suíno de autotransplante.

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Protocolo

Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cuidados com Animais do Instituto Geral de Pesquisa de Toronto (número do Protocolo de Uso de Animais: 3652). Os animais foram cuidados de acordo com a Sociedade Nacional de Pesquisa Médica e Guia para o cuidado de animais de laboratório, Instituto Nacional de Saúde (NIH), Ontário, Canadá. Cinco porcos Yorkshire machos de 3 meses de idade, pesando aproximadamente 30 kg cada, foram utilizados neste estudo. O protocolo para esta metodologia é subdividido nas seguintes etapas: (1) Dissociação de núcleos de biópsia renal única em suspensões celulares; (2) Perfil metabólico de células renais derivadas de biópsia; e (3) Medição do conteúdo de ATP em células renais derivadas de biópsia. Todas as amostras de biópsia coletadas para medidas de função metabólica ou conteúdo de ATP foram dissociadas dentro de 3 h após a recuperação em um gabinete de biossegurança. O fluxo de trabalho da metodologia é mostrado na Figura 1. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Dissociação de núcleos de biópsia renal única em suspensões celulares

  1. Colete três núcleos de biópsia de tecido do córtex renal, usando o sistema de pistola de agulha coaxial (ou seja, uma agulha guia externa e uma agulha de biópsia interna)38. Para a tradução clínica, recomenda-se o uso de uma pistola de agulha de biópsia 18G39.
    NOTA: Seja consistente com o ângulo da pistola de agulha de biópsia (~ 45 ° C) e a profundidade da punção (~ 20 mm) ao realizar biópsias do córtex renal.
  2. Coloque cuidadosamente cada núcleo de biópsia em um tubo de 15 mL contendo 2 mL de RPMI 1640 no gelo.
    1. Fragmente o tecido da biópsia em pequenos pedaços (≤2 mm de comprimento) usando um bisturi em uma placa de Petri de 6 cm colocada sobre gelo. Usando pinças curvas de ponta fina ultrafinas, coloque os fragmentos de tecido de cada biópsia em um tubo diferente de 1,5 mL contendo 1 mL de meio de dissociação.
      NOTA: O meio de dissociação consiste em meio RPMI 1640 contendo 0,1 mg / mL de DNase I, 10 mg / mL de colagenase e 2990 unidades / mL de protease neutra de Bacillus polymyxa. A dissociação de biópsias renais humanas usando essa composição de meio provou maximizar a viabilidade celular e preservar a representação de populações de células raras e frágeis40.
  3. Deixe a dissociação ocorrer por 30 min a 37 ° C (bloco de aquecimento) com agitação intermitente (recomenda-se o vórtice dos tubos a cada 5 min).
  4. Após a dissociação, filtrar as suspensões celulares através de tubos de 35 μm de filtro de células.
  5. Enxágue o filtro com volume 1:1 de soro bovino 100% fetal (FBS).
  6. Agrupe as três suspensões de células renais derivadas de biópsia em um tubo de 15 mL.
  7. Pulverize as células por centrifugação (400 x g, 5 min, 4 ° C) e ressuspenda-as em 1 mL de RPMI 1640 contendo 10% de FBS. Esta suspensão celular normalmente produz 0,8-1,2 × 106 células.

2. Perfil metabólico de células renais derivadas de biópsia

NOTA: A etapa de perfil metabólico integra a medição da glicólise (ECAR) e da taxa de consumo de oxigênio (OCR) em um analisador de função metabólica, bem como os níveis de ATP intracelular usando um kit comercial.

  1. Hidratação e calibração da placa utilitária do cartucho
    1. Um dia antes da coleta da amostra, adicione 200 μL de ddH2O a cada poço da placa de utilidade do cartucho do analisador de função metabólica.
    2. Incubar a placa utilitária do cartucho numa incubadora isenta de CO2 a 37 °C durante a noite.
    3. No dia da coleta da amostra, remova o ddH2O por aspiração usando uma pipeta Pasteur conectada a um sistema de vácuo e adicione 200 μL de solução calibrante (pH = 7,4) a cada poço da placa utilitária do cartucho.
    4. Incube a placa utilitária do cartucho em uma incubadora livre de CO2 a 37 °C durante a noite.
  2. Plaqueamento celular e preparação de meios de ensaio e compostos estressores para medições da função metabólica
    1. Adicione 100 μL de RPMI com 10% de FBS em cada poço de uma placa de ensaio de função metabólica de 96 poços.
    2. Separe uma pequena alíquota (por exemplo, 10 μL) da suspensão celular (obtida na etapa 1) em um tubo diferente e core as células usando um corante de viabilidade de exclusão de azul de tripano.
    3. Usando uma câmara de contagem, determine a concentração de células vivas (azul de tripano negativo)41 na suspensão original.
    4. Semeie as células em cada um dos poços de estudo da placa de ensaio de função metabólica, a uma densidade de 1,0 x 105 células vivas/poço. Esse número de células foi determinado após a otimização (consulte a seção Resultados representativos).
      NOTA: Não semeie células em nenhum dos quatro cantos da placa de ensaio de função metabólica, pois elas são usadas como espaços em branco.
    5. Deixe as células aderirem incubando a placa de ensaio de função metabólica em uma incubadora de CO2 a 37 ° C e 5% durante a noite (~ 16 h).
    6. No dia seguinte, confirme ao microscópio se as células estão em uma confluência mínima de 70% a 80% (uma monocamada celular saudável é importante para a determinação ideal dos parâmetros da função metabólica).
    7. Descongelar uma alíquota (40-50 ml) de meio basal isento de vermelho de fenol a 37 °C, durante pelo menos 15 min.
    8. Prepare 35 mL de meio de ensaio adicionando 2 mM de glutamina (350 μL), 1 mM de piruvato (350 μL) e 5,55 mM de glicose (385 μL) em 33,915 mL de meio basal pré-descongelado.
    9. Usando uma pipeta monocanal ou multicanal, remova suavemente o meio RPMI de cada poço de estudo da placa de ensaio de função metabólica. Em seguida, adicione 100 μL de meio basal para lavar as células.
    10. Remova o meio basal com cuidado e adicione 150 μL de meio de ensaio a cada poço, incluindo os poços sem células.
      NOTA: Deixar os poços sem meio de ensaio pode afetar as condições de umidade no ambiente da placa e levar a medições inconsistentes da função metabólica (Figura Suplementar 1).
    11. Coloque a placa de ensaio de função metabólica em uma incubadora livre de CO2 a 37 ° C por ~ 1 h (etapa de aclimatação). Leve a placa utilitária do cartucho (previamente incubada em solução calibrante) de volta ao gabinete de biossegurança.
    12. Durante a aclimatação, preparar as seguintes quatro soluções de compostos estressores, em meios de ensaio: 7 μM de oligomicina (7x, para uma concentração final de 1 μM de oligomicina); 2,4 μM de carbonilcianeto-4 (trifluorometoxi) fenilhidrazona (FCCP) (8x, para uma concentração final de 0,3 μM FCCP); 450 mM de 2-desoxi-glicose (2-DG) (9x, para uma concentração final de 50 mM de 2-DG); 10 μM de rotenona e 10 μM de antimicina A (Rot + AA) (10x, para uma concentração final de 1 μM de Rot + 1 μM de AA).
      NOTA: A oligomicina inibe a atividade da ATP sintase e, portanto, interrompe a cadeia de transporte de elétrons (ETC). Isso reduz o OCR e o influxo de prótons impulsionado pela ATP sintase nas mitocôndrias. Como resultado, a glicólise torna-se a principal fonte de produção de ATP42. O FCCP é um medicamento cianeto (carga negativa) que atua como um desacoplador da fosforilação oxidativa, atraindo prótons (carga positiva) e induzindo um influxo contínuo de prótons para as mitocôndrias, o que permite o consumo de oxigênio pelo ETC independentemente da atividade da ATP sintase43. 2-DG é um análogo estrutural sintético da glicose no qual o grupo 2-hidroxila é substituído por hidrogênio e atua como um inibidor competitivo da glicólise44. Rot e AA são drogas inibidoras dos complexos I e III da cadeia de transporte de elétrons, respectivamente45. Os efeitos da injeção de cada droga em diferentes etapas do ensaio de função metabólica são descritos na Figura Suplementar 2.
    13. Carregue 25μL de cada medicamento na porta correspondente em cima de cada poço da placa de utilidade do cartucho, incluindo os poços sem células. Carregue os medicamentos de acordo com a seguinte sequência: 7x oligomicina (porta A), 8x FCCP (porta B), 9x 2-DG (porta C), 10x Rot + AA (porta D).
    14. Incubar a placa de utilidade do cartucho na incubadora livre de CO2 até que seja necessário configurar o ensaio da função metabólica.
  3. Determinação do consumo de oxigênio e taxas glicolíticas em células renais derivadas de biópsia
    1. Verifique se o analisador de função metabólica está ligado e conectado ao software do controlador em um computador acessório.
    2. Inicie o software.
    3. Clique no botão Modelo > em branco.
    4. Na primeira guia, clique no botão Estratégia de injeção. Clique em cada botão com as letras A, B, C ou D que correspondem às quatro portas de injeção. Anote o nome do medicamento que será injetado através de cada porta: oligomicina (porta A), FCCP (porta B), 2-DG (porta C), Rot + AA (porta D).
    5. Na segunda guia, defina todas as condições experimentais. Clique no botão Adicionar condição para introduzir uma nova condição. O software atribuirá automaticamente uma cor a cada condição. Clique no botão Mapa de placas e atribua a condição experimental correspondente a cada poço, que será colorida de acordo.
      NOTA: Os quatro poços de canto precisam permanecer atribuídos como em branco (cor preta), pois são usados para subtrair o sinal de fundo.
    6. Na terceira guia, clique no botão Injeção quatro vezes, para que as quatro injeções (portas A, B, C e D) sejam adicionadas à sequência. O ensaio pode ser executado usando a sequência de injeção padrão (A, B, C, D), número de medições (3 medições basais + 3 medições após cada injeção) e tempo entre as medições (3 min).
    7. Na quarta aba, preencha as caixas com as informações essenciais do estudo e clique em Executar. A bandeja será aberta e o software solicitará que o usuário monte a placa de utilidade do cartucho. Certifique-se de remover a tampa verde antes de colocar o prato na bandeja.
    8. Após a calibração (~15 min), a bandeja se abrirá novamente e o software solicitará ao usuário que remova a placa utilitária do cartucho e coloque a placa de ensaio de função metabólica na bandeja. Novamente, remova a tampa da placa antes de montar a placa na bandeja. A placa de utilidade do cartucho pode ser descartada.
    9. O ensaio terminará em aproximadamente 2 h. Após esse período, salve o arquivo '.asyr' correspondente. Analise os arquivos .asyr computacionalmente para examinar as curvas ECAR e OCR. Exporte os dados para o formato preferido.
  4. Medição do conteúdo de DNA para normalização dos dados da função metabólica
    1. Determine a quantidade de DNA nas células em cada poço após o ensaio de função metabólica usando o kit de ensaio de proliferação celular especificado (consulte a Tabela de Materiais).
    2. Prepare o volume necessário de 1x tampão de lise celular diluindo 20x tampão de lise celular em água deionizada.
    3. Para preparar uma curva padrão, prepare amostras de 100 μL de bacteriófago λ DNA padrão (incluído no kit de ensaio de proliferação celular) diluído em série em tampão de lise celular para concentrações na faixa de 0 ng / mL, 12,5 ng / mL, 25 ng / mL, 50 ng / mL, 100 ng / mL, 200 ng / mL, 400 ng / mL, 800 ng / mL. Carregue cada diluição em um poço diferente de uma microplaca preta de 96 poços.
    4. Prepare 1x solução de ligação de corante diluindo 400x reagente de corante em 1x tampão de lise celular. Para cada poço de curva padrão e estudo de ensaio de função metabólica, serão necessários 100 μL.
    5. Distribua 100μL de solução de corante 1x na primeira coluna, que já contém os padrões. NOTA: O processo até este ponto pode ser iniciado 30 minutos antes do final da execução do ensaio de função metabólica.
    6. Remova o meio de ensaio da placa de ensaio de função metabólica usando uma pipeta de canal único ou multicanal.
    7. Com uma pipeta multicanal, adicione 100 μL de solução de ligação de corante 1x a cada poço de estudo da placa de ensaio de função metabólica. Pipete para cima e para baixo algumas vezes para lisar as células e transfira o conteúdo para a placa preta.
    8. Proteja a microplaca da luz e incube a 37 °C por 2-5 min.
    9. Medir a intensidade de fluorescência de cada amostra utilizando um leitor de microplacas de fluorescência com excitação a 480 nm e detecção de emissões a 520 nm.

3. Medição do conteúdo de ATP em células renais derivadas de biópsia

NOTA: Meça a quantidade de ATP em células renais derivadas de biópsia usando o reagente de detecção de ATP especificado e o padrão de ATP recombinante (rATP) (consulte a Tabela de Materiais).

  1. Se estiver congelado, descongelar o reagente de detecção de ATP a 4 °C durante a noite.
  2. Após a aquisição de suspensões de células derivadas de biópsia e contagem de células, coloque 1,0 x 104 células vivas/poço em cada poço de uma microplaca branca de 96 poços contendo 100 μL de meio RPMI 1640 com 10% de FBS. Deixe a primeira coluna da microplaca vazia, pois ela será usada para carregar uma curva padrão de rATP no dia seguinte.
  3. Incubar a microplaca a 37 °C numa incubadora de CO2 a 5% durante a noite.
  4. No dia seguinte, pré-aqueça o reagente de detecção de ATP à temperatura ambiente.
  5. Gere a curva padrão rATP. Preparar amostras de 100 μL de rATP diluídas em série em PBS para as seguintes concentrações: 0 nM, 0,001 nM, 0,01 nM, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1000 nM.
  6. Carregue 50 μL de cada amostra padrão de rATP na primeira coluna da microplaca.
  7. Remova o meio RPMI 1640 contendo 10% de FBS de cada poço de estudo de microplaca, usando uma pipeta monocanal ou multicanal.
  8. Lave bem cada estudo com 100 μL de PBS (pré-aquecido em banho-maria a 37 ° C).
  9. Remova o PBS e adicione 50μL de novo PBS em cada poço de estudo.
  10. Adicione 50 μL de reagente de detecção de ATP nos poços padrão e de estudo.
  11. Misturar, incubar a 37 °C durante 2 min e, em seguida, a RT durante 10 min.
  12. Leia e registre a luminescência em um leitor de microplacas.

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Resultados

O fluxo de trabalho foi testado em células renais derivadas de biópsia de porcos Yorkshire machos saudáveis de 3 meses de idade. O protocolo para dissociação de tecidos e plaqueamento celular foi seguido conforme descrito acima. Depois de deixar as células aderirem por 16 h, o OCR e o ECAR foram medidos em tempo real nas células renais suínas derivadas de biópsia usando um analisador de função metabólica, como marcadores de respiração mitocondrial e glicólise, respectivamente.

O primeiro exper...

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Discussão

Este artigo descreve um método único para avaliar a função metabólica de células renais obtidas de biópsias. Um protocolo para obtenção de suspensões unicelulares a partir de biópsias renais por agulha grossa frescas foi acoplado a uma análise da função metabólica e dos níveis de ATP intracelular. A glicólise é avaliada pela medição do ECAR e a respiração mitocondrial pela medição do OCR. Biópsias renais porinas foram usadas para otimizar a metodologia.

Para e...

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Divulgações

Nenhum dos coautores tem interesses financeiros conflitantes ou outros conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

AK foi apoiado pela University Health Network Foundation (prêmios 579067450776, 579072310776 e 579068260776). O SC-F foi apoiado pelo programa Kidney Research Scientist Core Education and National Training (KRESCENT) (2019KPPDF637713 e 24KNIA-1291062).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
2-Deoxy-D-glucoseSigmaD6134Inibidor competitivo da glicólise
5 mL Tubo de Ensaio de Poliestireno
de Fundo Redondo, com Filtro de Células Snap Cap		Falcon352235Tubos de Dissociação
Antimicina A de  Streptomyces  sp.SigmaA8674Inibidor do complexo III da cadeia respiratória
AOF BP ProteaseVitaCyte003-1000Enzima de dissociação
Carbonilcianeto 4-(trifluorometoxi)
fenilhidrazona (FCCP)		SigmaC2920Desacoplador de fosforilação oxidativa
CellTiter-Glo 2.0 Ensaio, 100mLPromegaG9242Medição de ATP
Collagenase MAVitaCyte001-2030Enzima de dissociação
CyQUANT Cell Proliferation Assay, para células em culturaInvitrogenC7026Medição de DNA D-GLICOSE intracelular
, anidro, grau reagenteBioshopGLU501Substrato metabólico
DNase ICélula-tronco07469Enzima
de dissociaçãoSoro Fetal Bovino, Premium,
Origem dos EUA, Inativado por Calor, 500 mL		Wisent080-450Suplemento de mídia de dissociação
L-Glutamina-200 mM (100x) líquido (100 mL)Gibco25030081Substrato metabólico
Oligomicina ASigma75351Inibidor da ATP sintase
PBS, -/-, 500 mLWisent311-010-CLCell wash
rATP,  10 mM,  0,5 mLPromegaP1132Medição de ATP intracelular
RotenonaSigmaR8875Inibidor do complexo I da cadeia respiratória
RPMI 1640Gibco11875119Meios de dissociação
Software controlador Seahorse Wave 2.6AgilentN/AConfiguração de medições da função metabólica
Seahorse Wave Desktop Software 2.6AgilentN/AAnálise de dados de função metabólica
Seahorse XF base média,  sem vermelho de fenol, 500 mLAgilent103335-100Medição da função metabólica
Seahorse XFe96 FluxPak  (20 placas, 18 cartuchos,
e 500mL de solução calibrante)		Agilent102416-100Medição da função metabólica
Seahorse XFe96 analisador de função metabólicaAgilent101991-100Medição da função metabólica
Solução de piruvato de sódio 100 mM (100X), líquido 100 mLGibco11360070substrato metabólico
intracelular

Referências

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