O objetivo deste artigo é examinar o uso do teste de imunofluorescência indireta da raiva para a detecção de anticorpos IgG e IgM específicos para raiva.
Artigo de método
Detecção de anticorpos IgG e IgM antirrábicos pelo teste de imunofluorescência indireta da raiva
Neste artigo
Resumo
Resumo
O teste de imunofluorescência indireta (RIFI) antirrábica foi desenvolvido para detectar vários isotipos de anticorpos específicos contra a raiva no soro ou no líquido cefalorraquidiano. Este teste fornece resultados rápidos e pode ser usado para detectar anticorpos antirrábicos em vários cenários diferentes. O teste de IFA antirrábica é especialmente útil para a detecção rápida e precoce de anticorpos para avaliar a resposta imune em um paciente que desenvolveu raiva. Embora outros métodos para o diagnóstico antemortem da raiva tenham precedência, este teste pode ser utilizado para demonstrar a exposição recente ao vírus rábico através da detecção de anticorpos. O teste de IFA não fornece um título de anticorpos neutralizantes do vírus (VNA), mas a resposta de profilaxia pré-exposição (PrEP) pode ser avaliada através da presença de anticorpos positivos ou negativos. Este teste pode ser utilizado em várias situações e pode fornecer resultados para vários alvos diferentes. Neste estudo, usamos várias amostras de soro pareadas de indivíduos que receberam PrEP e demonstramos sua presença de anticorpos antirrábicos ao longo do tempo usando o teste de RIFI.
Introdução
O teste de anticorpos fluorescentes indiretos (RIFI) antirrábicos é usado para detectar vários isotipos de anticorpos específicos da raiva no soro ou no líquido cefalorraquidiano. É um dos muitos testes disponíveis para o acompanhamento de um paciente antirrábico antemortem. É especialmente útil para a detecção precoce de anticorpos para avaliar a resposta imune de um paciente à infecção por raiva. Quando usado em conjunto com outros testes, história do caso e status de vacinação do paciente, o teste de IFA pode ajudar a determinar a exposição ao vírus da raiva ou a uma vacina1. Como o teste de RIFI mede IgM e/ou IgG, os valores do anticorpo específico podem indicar um período de tempo aproximado da exposição ao antígeno1. Esse teste pode ser útil nos aplicativos listados ou em outros ainda não explorados.
Existem vários ensaios sorológicos para raiva disponíveis. O teste rápido de inibição de foco fluorescente (RFFIT), o teste de neutralização do vírus de imunofluorescência (FAVN) ou modificações destes são os principais métodos para medir anticorpos neutralizantes contra o vírus da raiva (RNVR)1. No entanto, esses testes não diferenciam anticorpos IgM e IgG. Quando diferenciar o isotipo de anticorpos é importante no monitoramento da resposta imune da raiva, os testes de IFA antirrábica e ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) da raiva são usados, mas não medem RVNAs. Embora os testes de RIFI e ELISA possam ser usados para determinar a presença de anticorpos específicos contra a raiva em uma amostra, existem algumas diferenças na forma como são executados. O teste de IFA utiliza um vírus vivo cultivado em células como substrato antigênico, enquanto um ELISA típico para detecção de raiva utiliza uma ou mais proteínas virais. Em um ambiente de laboratório onde o vírus da raiva pode ser cultivado, o teste de IFA pode ser mais facilmente realizado em vez de comprar ou cultivar proteínas virais individuais para o ELISA. A finalidade do teste e as informações obtidas a partir dos resultados de qualquer ensaio sorológico antirrábico devem ser consideradas ao determinar qual escolher2.
A IgM é a primeira a responder, aumentando até que a mudança de classe seja observada por volta do 28º dia, quando a IgG se torna o anticorpo circulante predominante3. Assim, a IgM só seria esperada por um período limitado de tempo após a exposição ao vírus da raiva ou à vacinação. O teste do soro e do líquido cefalorraquidiano (LCR) pode indicar se a exposição foi por meio de vacinação, na qual os anticorpos seriam vistos apenas no soro, ou de uma infecção viral, que potencialmente mostraria anticorpos no LCR1.
Foi estabelecido que os anticorpos antirrábicos persistem por vários anos após a profilaxia pré-exposição (PrEP)4. O teste de IFA pode ser uma ferramenta útil para demonstrar isso em diferentes momentos após a vacinação ou exposição.
Protocolo
O seguinte protocolo foi aprovado para o uso ético de amostras humanas pelo New York State Department of Health Wadsworth Center para desenvolvimento de ensaios, número de aprovação do protocolo #03-019.
1. Segurança
- Use equipamentos de proteção individual (EPIs), no mínimo proteção ocular (óculos ou face shield), máscara cirúrgica e luvas sem látex.
- Certifique-se de que o pessoal está vacinado contra a raiva e que um título de ≥0,5 UI/mL foi demonstrado nos últimos 6 meses.
2. Preparação da lâmina de antígeno
NOTA: Execute todas as manipulações de vírus, LCR e soro em um gabinete de biossegurança (BSC) usando precauções universais.
- Preparar 20 mL de neuroblastoma de camundongo ou células BHK-21 para uma concentração de 3,0 x 105 células/mL em meio essencial mínimo de Eagle suplementado com 10% de soro fetal bovino (EGM) e manter frio até o uso.
- Preparar o vírus CVS-11 diluindo em EGM para uma diluição de trabalho de 1,0 x 106,5 50% dose infecciosa de cultura de tecido (TCID50) por mililitro e manter frio até estar pronto para uso.
NOTA: TCID50 é determinado pelo método de Reed e Muench publicado anteriormente5. - Limpe uma câmara de lâmina de umidade e lâminas de microscópio revestidas de politetrafluoretileno (PTFE) com etanol 70% e deixe secar ao ar no BSC.
- Adicione água destilada (dH2O) a tiras de papel absorvente na câmara deslizante para garantir que a umidade permaneça constante durante todo o procedimento.
- Usando um lápis, rotule cada slide a ser usado com o número do lote, data, tipo de célula e quaisquer outras informações de identificação necessárias para o armazenamento e coloque na câmara do slide.
NOTA: A maioria dos marcadores, canetas ou etiquetas não resistirá à futura etapa de fixação da acetona (passo 2.9). - Aplicar 50 μL de diluição viral em cada poço nas lâminas do microscópio com uma pipeta de repetição. Em seguida, aplique 50 μL de diluição celular em cada poço, tomando cuidado para não contaminar a ponta da pipeta com o vírus já no poço.
- Feche a câmara deslizante de umidade e coloque-a na incubadora úmida a 34-36 °C. Avaliar a infectividade celular após 24 h.
Observação : execute as etapas 2.8-2.12 em apenas um slide. - Retire a lâmina da câmara de umidade e aspirar cuidadosamente o sobrenadante. Lave a lâmina em um frasco de Coplin preenchido com solução salina tamponada com fosfato (PBS) por 2 minutos e, em seguida, deixe a lâmina secar ao ar.
- Coloque a lâmina no frasco Coplin e fixe a lâmina em acetona fria por um mínimo de 1 h em um freezer de -20 °C aprovado para materiais inflamáveis. Execute todos os procedimentos de derramamento de acetona e secagem ao ar em uma capela de fumaça.
- Deixe a acetona piscar e deslize para secar. Aplicar o conjugado de anticorpos fluorescentes diretos (IFD) contra a raiva preparado de acordo com as instruções do fabricante nos poços da lâmina e incubar por 30 min em uma incubadora úmida de 34-36 °C.
- Lave a lâmina em frascos Coplin de PBS duas vezes por 2 min cada. Seque o escorregador ao ar.
- Monte uma lamínula com Tris 0,05 M, NaCl 0,15 M (pH 9,0) e suporte de glicerol a 20% e leia a lâmina usando um microscópio fluorescente em aumento de 200x para avaliar a infectividade. Se as células não estiverem aproximadamente 50% infectadas, repita os passos 2.7-2.12 no dia seguinte até que a infectividade desejada seja atingida.
NOTA: A infectividade celular é aproximada com base na avaliação visual da proporção de células negativas para células positivas para raiva no poço da lâmina. As células negativas aparecem na cor vermelha, enquanto as células positivas mostram coloração fluorescente verde. - Remova as lâminas restantes da incubadora e da câmara de umidade. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante de cada poço e, em seguida, colocar as lâminas em um frasco Coplin com PBS por 1-2 min. Seque as lâminas ao ar por aproximadamente 30 min. Conservar as lâminas a -80 °C até estarem prontas a utilizar.
3. Preparo da amostra
- Preparar diluições de amostras de soro ou LCR do paciente para teste. Preparar o conjugado necessário para uma concentração de trabalho adequada diluída em PBS com 0,05% de azul de Evans.
NOTA: Mantenha o conjugado no escuro para manter a integridade do fluoróforo antes da aplicação
4. Procedimento IFA
- Remova o número necessário de lâminas de antígeno preparadas necessárias para cada ensaio e deixe as lâminas descongelarem e secarem completamente.
- Coloque as lâminas em um (s) frascos Coplin e fixe as lâminas em acetona fria por entre 2 h a pernoite em um freezer de -20 °C aprovado para materiais inflamáveis. Retire as lâminas da acetona e deixe secar ao ar.
- Coloque as lâminas em uma caixa de câmara de umidade dentro do BSC com tiras absorventes embebidas em dH2O para manter a umidade. Aplicar 50 μL de cada diluição da amostra, amostra de controle ou PBS no poço pré-determinado.
NOTA: Cada lâmina deve conter um número apropriado de poços de amostra do paciente, controle positivo, controle negativo e poço de controle celular PBS. - Coloque a câmara deslizante de umidade fechada em uma incubadora úmida de 37 °C, 5% CO2 . Incube as lâminas por 30 min, retire a câmara de deslizamento de umidade da incubadora e coloque-a em um BSC.
- Use uma ponta aspiradora para aspirar cuidadosamente o sobrenadante de cada poço, garantindo que não perturbe a monocamada celular. Use uma pipeta conta-gotas estéril para aplicar uma gota de PBS em cada poço.
- Repita a aspiração cuidadosa, em seguida, coloque cada lâmina em um frasco Coplin cheio de PBS e lave duas vezes por um total de 15 min.
- Coloque as lâminas de volta na caixa da câmara de umidade e aplique 50 μL de conjugado de anticorpos anti-humanos apropriados em cada poço. Repita as etapas 4.4 a 4.6.
- Deixe as lâminas secarem ao ar, monte uma tampa com mídia de montagem e leia as lâminas sob microscópio fluorescente.
5. Análise de slides
- Amostras de grau com base no padrão de coloração e intensidade de fluorescência em comparação com amostras de controle positivas com alto título de anticorpos antirrábicos confirmado.
- Classificar as amostras em uma escala negativa, 1+, 2+, 3+ e 4+, com um resultado negativo mostrando ausência de coloração fluorescente e 4+ representando uma fluorescência de cor verde brilhante da maçã com um padrão de coloração semelhante às amostras controle positivas1.
NOTA: A cor verde da maçã aplica-se apenas aos anticorpos marcados com FITC; A cor varia dependendo da seleção de fluoróforos. - Atribua às amostras um valor de ponto final representado pelo fator de diluição no qual a amostra exibe uma classe 1-2+. Ensaiar as amostras com um factor de diluição mais elevado se o ponto final não for atingido no ensaio inicial.
Resultados
Todas as amostras de soro foram coletadas dos pacientes aproximadamente nos mesmos períodos de tempo após a PrEP. As amostras foram testadas de cinco pacientes diferentes nos seguintes momentos: 2 semanas após a inoculação final da vacina antirrábica, 6 meses após a série de vacinas antirrábicas e 18 meses após a série de vacinas antirrábicas. Cada amostra de soro foi diluída em série e graduada para presença de IgM e IgG, conforme descrito nas etapas 5.2 e 5.3 do protocolo. O valor de anticorpos atribuído representa o fator de diluição em que a amostra atingiu um grau de ponto final de 1-2+.
Os resultados dos testes em cada momento após a PrEP demonstram a capacidade do ensaio de detectar níveis variados de presença de anticorpos. Logo após a vacinação inicial, níveis elevados de IgM e IgG estavam presentes nas amostras de pacientes, como pode ser observado na Figura 1. Áreas de coloração de células fluorescentes verde-brilhantes indicam presença positiva de anticorpos; As hemácias são células negativas para raiva onde nenhum anticorpo poderia se ligar. Aproximadamente 6 meses após a vacinação, níveis significativamente mais baixos de IgM e IgG estavam presentes nas amostras de pacientes, mas IgM havia abandonado quase completamente. No momento final, 18 meses após a vacinação, anticorpos IgM não foram detectados em nenhuma amostra de pacientes, como demonstrado na Figura 2 , onde não foi observada coloração de células fluorescentes verdes. No entanto, os níveis de IgG persistiram e permaneceram semelhantes aos níveis detectados no período de 6 meses após a diminuição inicial a partir do período de 2 semanas. Os resultados para detecção de IgG e IgM em amostras de 2 semanas após a vacinação, 6 meses após a vacinação e 18 meses após a vacinação estão listados na Tabela 1, Tabela 2 e Tabela 3, respectivamente. A Figura 3 mostra o fluxograma das etapas de execução.
Figura 1: Coloração positiva para IFA IgM antirrábica. O soro do paciente em uma diluição de 1:8 demonstrou um padrão de coloração positivo logo após a conclusão da série de vacinas de PrEP. A barra de escala na imagem representa 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Coloração IFA IgM negativa para raiva. O soro do paciente em diluição de 1:2 não demonstrou coloração positiva aproximadamente 18 meses após a conclusão da série de vacinas contra a PrEP. A barra de escala na imagem representa 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Fluxograma IFA antirrábica. Fluxograma mostrando as etapas de execução das principais etapas do procedimento de IFA para auxiliar na visualização do processo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Amostra de Pacientes | Grão-mestre | IgG |
| PS1-1 | 1:32 | 1:512 |
| PS2-1 | 1:8 | 1:128 |
| PS3-1 | 1:16 | 1:256 |
| PS4-1 | 1:64 | 1:512 |
| PS5-1 | 1:16 | 1:128 |
Tabela 1: Resultados 2 semanas pós-vacinação. Resultados de amostras de pacientes de amostras de soro coletadas aproximadamente 2 semanas após a conclusão da série de vacinas PrEP.
| Amostra de Pacientes | Grão-mestre | IgG |
| PS1-2 | 1:2 | 1:128 |
| PS2-2 | 1:1 | 1:128 |
| PS3-2 | 1:1 | 1:64 |
| PS4-2 | 1:1 | 1:256 |
| PS5-2 | 1:1 | 1:32 |
Tabela 2: Resultados 6 meses pós-vacinação. Resultados de amostras de pacientes de amostras de soro coletadas aproximadamente 6 meses após a conclusão da série de vacinas PrEP.
| Amostra de Pacientes | Grão-mestre | IgG |
| PS1-3 | Não detectado | 1:128 |
| PS2-3 | Não detectado | 1:128 |
| PS3-3 | Não detectado | 1:64 |
| PS4-3 | Não detectado | 1:64 |
| PS5-3 | Não detectado | 1:32 |
Tabela 3: Resultados 18 meses pós-vacinação. Resultados de amostras de pacientes de amostras de soro coletadas aproximadamente 18 meses após a conclusão da série de vacinas PrEP.
Discussão
O teste de IFA aproveita um complexo antígeno-anticorpo, permitindo um local de marcação para visualizar anticorpos específicos da raiva. Células de neuroblastoma ou BHK são semeadas em lâminas de microscópio revestidas com PTFE multipoço e inoculadas com a cepa CVS-11 de laboratório do vírus da raiva. Uma vez confluente a monocamada e atingida a infectividade desejada de aproximadamente 50%, as lâminas são armazenadas até ficarem prontas para uso6.
O soro ou o LCR do paciente são aplicados na monocamada celular infectada e incubados para permitir que quaisquer anticorpos específicos da raiva se liguem ao antígeno do vírus7. Após um procedimento de lavagem, um anticorpo anti-IgG ou IgM humano marcado fluorescentemente é aplicado e se liga a qualquer anticorpo ligado ao vírus da aplicação da amostra. Os anticorpos marcados podem então ser visualizados sob um microscópio fluorescente.
Ao se preparar para realizar este ensaio, é importante determinar o melhor preparo de amostras de pacientes, controles e conjugados. As amostras iniciais dos pacientes foram triadas com baixo fator de diluição ou não diluídas para testar a presença de anticorpos. Amostras pareadas ou amostras previamente triadas que demonstraram um alto nível de anticorpos foram então diluídas até o ponto final. As diluições iniciais das amostras dos pacientes para o teste de IgG foram preparadas em diluente de IFA comercialmente disponível. As amostras de IgM foram inicialmente preparadas em um reagente bloqueador de IgG disponível comercialmente. Diluições seriadas subsequentes para ambos os testes foram então preparadas em PBS.
Os controles utilizados para os testes foram obtidos de receptores conhecidos de PrEP antirrábica ou de indivíduos sem histórico de vacinação antirrábica. Todas as amostras controle foram testadas para a presença de anticorpos antes do uso. O controle de IgG foi obtido de um receptor da vacina antirrábica com um título estabelecido de anticorpos neutralizantes da raiva confirmado pela FAVN. A amostra controle IgM positiva foi obtida de um receptor de vacina antirrábica aproximadamente 2 semanas após o término da vacinação.
O uso de conjugado apropriado é outro aspecto vital da realização do teste de RIFI. O conjugado utilizado para cada teste depende do isotipo alvo do anticorpo para esse ensaio. Neste caso, foram utilizados anticorpos anti-IgG e anti-IgM humanos marcados com FITC comercialmente disponíveis. As diluições conjugadas de anticorpos de trabalho foram determinadas antes dos testes com base na recomendação do fabricante.
Existem várias etapas fundamentais no procedimento que garantirão a execução bem-sucedida do teste de IFA, talvez a mais importante seja a preparação da lâmina de antígeno. Atingir aproximadamente 50% de infectividade fornece locais de ligação abundantes para os anticorpos disponíveis, ao mesmo tempo em que cria clareza ao ler e classificar amostras. As células negativas para raiva criam um fundo contrastante para visualizar melhor os anticorpos marcados. A coloração inespecífica também pode apresentar um problema ao realizar a coloração fluorescente usando matrizes de amostra complexas, como o soro. O uso de reagentes de inativação de IgG (por exemplo, Gullsorb) ajuda a reduzir a coloração inespecífica devido à interferência de anticorpos IgG ao avaliar a presença de IgM8. A preparação adequada de materiais e a incorporação de reagentes especiais no procedimento ajudam a diminuir a coloração problemática, preservando resultados de alta qualidade.
Uma infinidade de métodos de teste foram desenvolvidos que se concentram na detecção, quantificação e identificação de anticorpos antirrábicos. Cada um desses testes oferece resultados que podem ser usados de várias maneiras, dependendo das informações buscadas. O teste de IFA antirrábica é uma ferramenta poderosa para identificar isotipos de anticorpos vírus-específicos, e os resultados podem estar prontos em um período de tempo relativamente curto em comparação com outros métodos de teste, como os testes RFFIT e FAVN.
Embora o teste de RIFI possa detectar anticorpos antirrábicos em uma amostra, ele não fornece uma quantificação padronizada dos anticorpos. O teste de IFA fornece um fator de diluição sérica no qual a detecção de anticorpos termina. Em comparação, os testes RFFIT e FAVN quantificam a capacidade neutralizante dos anticorpos em uma amostra, resultando em um título de unidades internacionais (UI), fornecendo um resultado mais detalhado e padronizado. Os resultados de um teste FAVN ou RFFIT demonstram a presença de anticorpos neutralizantes, que foram determinados como anticorpos IgG9. Entende-se que o papel da IgM na atividade neutralizante é limitado devido à sua estrutura10. Portanto, esses testes não detectam especificamente a presença de IgM.
O tipo de teste e seu resultado podem ser um pouco problemáticos ao aplicá-los a um problema específico. O conceito de nível protetor de proteção de anticorpos contra a infecção pelo vírus rábico não é mais utilizado para avaliar a resposta imune à vacinação antirrábica. Anteriormente, uma resposta protetora era definida como ≥0,5 UI. No entanto, as publicações atuais tipicamente se referem à resposta de anticorpos após a imunização como aceitável (≥0,5 UI) ou inaceitável (<0,5 UI). Como dito, o teste de IFA não fornece um título de anticorpos em UI e não deve ser usado para derivar um nível de proteção contra a raiva. O uso do teste de IFA durante a avaliação de um paciente que desenvolveu raiva nem sempre pode resultar em uma presença positiva de anticorpos devido a variações na resposta imune ao longo da doença. Devido à quase 100% de letalidade de uma infecção antirrábica, é importante considerar o teste e quanta informação pode ser derivada com segurança desses resultados11. Por essas razões, é sempre melhor avaliar todos os métodos de teste de anticorpos antirrábicos e determinar qual funciona melhor em um determinado cenário.
Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Somos gratos ao Wadsworth Center do Departamento de Saúde do Estado de Nova York por apoiar este projeto.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tampa de vidro de 25x55mm com deslizamentos | Qualquer | ||
| acetona | Qualquer | ||
| conjugado rotulado com IgG anti-humano | Sigma-Aldrich | F9512 | |
| Conjugado rotulado com IgM anti-humano | SeraCare | 5230-0286 | |
| Ponta de pipeta de aspiração | Qualquer | ||
| célula BHK-21 ATCC | CCL-10 | ||
| Diluente BION IFA | MBL BION | DIL-9993 | |
| Água para Cultura de Células | Sigma-Aldrich | W3500 | EGM |
| Captin Jars | Qualquer | ||
| Soro Fetal Bovino | Sigma-Aldrich | F2442 | EGM |
| com filtro FITC | Qualquer | ||
| glicerol | IgM Sigma-Aldrich | G7893 | Mountant |
| Gullsorb | Fisher Scientific | 23-043-158 | Reagente de inativação IgG |
| L-Glutamina | Sigma-Aldrich | G-7513 | EGM |
| Águia de mídia essencial mínima - com Earle ' sais, L-glutamina e aminoácidos não essenciais, sem bicarbonato de sódio | Sigma-Aldrich | M0643 | EGM |
| Células de Neuroblastoma de Camundongo | ATCC | CCL-131 | |
| Lâminas de vidro com revestimento de PTFE multi-poço | Qualquer | ||
| PBS | Qualquer | pH 7.6 | |
| Penicilina | Sigma | P-3032 | EGM |
| Raiva Direta Fluorescente Anticorpo Conjugado | Millipore Sigma | 5100, 5500, 6500, RU5100, ou RU5500 | |
| Bicarbonato de sódio | Sigma-Aldrich | S-5761 | EGM |
| Cristais de cloreto de sódio | Sigma-Aldrich | S5886 | Mountant |
| Conta-gotas estéreis | Qualquer | ||
| Sal de sulfato de estreptomicina | Sigma | S9137 | EGM |
| Trizma cristais pré-definidos pH 9.0 | Sigma-Aldrich | S9693 | Mountant |
| BD | 260300 | EGM | |
| Mistura de vitaminas | Sigma-Aldrich | M6895 | EGM |
Referências
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