Este protocolo apresenta um método de isolamento de cromatina locus-específico baseado em recombinação sítio-específica para purificar um locus gênico de cópia única de interesse em seu contexto de cromatina nativa a partir de levedura brotante, Saccharomyces cerevisiae.
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Artigo de método
Purificação de cromatina de locus gênico de cópia única em Saccharomyces cerevisiae
Neste artigo
Resumo
Resumo
A unidade organizacional básica da cromatina eucariótica é a partícula núcleo do nucleossomo (NCP), que compreende DNA envolto ~1,7 vezes em torno de um octâmero de histona. A cromatina é definida como a entidade de NCPs e numerosos outros complexos proteicos, incluindo fatores de transcrição, remodelamento da cromatina e enzimas modificadoras. Ainda não está claro como essas interações proteína-DNA são orquestradas no nível de loci genômicos específicos durante diferentes estágios do ciclo celular. Isso se deve principalmente às limitações técnicas atuais, que tornam difícil obter medidas precisas dessas interações dinâmicas. Aqui, descrevemos um método aprimorado combinando recombinação sítio-específica com um eficiente protocolo de purificação de afinidade em etapa única para isolar um locus gênico de cópia única de interesse em seu estado nativo de cromatina. O método permite o enriquecimento robusto do locus alvo sobre a cromatina genômica, tornando esta técnica uma estratégia eficaz para identificar e quantificar interações proteicas de forma imparcial e sistemática, por exemplo, por espectrometria de massas. Além dessas análises composicionais, a cromatina nativa purificada por este método provavelmente reflete a situação in vivo em relação ao posicionamento do nucleossomo e modificações de histonas e, portanto, é passível de análises estruturais e bioquímicas adicionais da cromatina derivada de praticamente qualquer locus genômico em levedura.
Introdução
A organização dinâmica de genomas eucarióticos em cromatina compacta o DNA para caber dentro dos limites do núcleo, garantindo dinâmica suficiente para a expressão gênica e acessibilidade para fatores regulatórios. Em parte, essa versatilidade é mediada pelo nucleossomo, a unidade básica da cromatina, que compreende uma partícula central com 147 pb de DNA envolto ~1,7 vezes em torno do oitâmero de histona1. O nucleossomo é uma estrutura altamente dinâmica em relação à sua composição, com numerosas variantes de histonas e modificações pós-traducionais (MPTs) nas caudas das histonas N- e C-terminais. Além disso, a cromatina eucariótica interage c....
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Protocolo
Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais e instrumentos utilizados neste protocolo. Consulte a Tabela 1 para obter uma lista das soluções, buffers e mídia usados.
1. Construção de cepas de leveduras recombinantes
- Para construir uma linhagem de levedura competente em recombinação, transforme o plasmídeo K238 digerido por SbfI em uma linhagem de levedura com sítios de ligação de LexA integrados e sítios de recombinação de RS no locus de interesse13,14.
NOTA: O fragmento de restr....
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Resultados
A purificação do domínio da cromatina ARS316 de ~1,4 kb foi mediada pela proteína adaptadora LexA-TAP constitutivamente expressa. Para servir como controle negativo, realizamos purificações usando uma cepa isogênica que expressa LexA-TAP, mas não contém sítios integrados de ligação de RS e LexA. A Figura 3 ilustra o resultado da análise de DNA de um experimento de purificação padrão realizado tanto no controle quanto em uma cepa competente em recombinação visando o locus ARS316. Após o isola.......
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Discussão
A identificação dos fatores e da paisagem da cromatina de uma região genômica alvo específica continua a representar um grande desafio na pesquisa da cromatina18. Este protocolo descreve um sistema eficiente para especificamente excisar e purificar domínios distintos da cromatina dos cromossomos de leveduras. Até onde sabemos, a pureza e o rendimento desta purificação em etapa única superam muitas das limitações dos métodos de purificação de cromatina locus-específicos, permitindo assim a obtenção.......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Agradecimentos
O trabalho no laboratório de S.H. foi apoiado pela DFG através do SFB1064 (projeto ID 213249687), do Conselho Europeu de Pesquisa (ERC Starting Grant 852798 ConflictResolution) e da Helmholtz Gesellschaft.
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Materiais
Plasmid
plasmídeo 14 Seção 1, consulte a referência 13 Armazenamento: Armazene a -20 ° de plasmídeo spike-in Solução de seco
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Cepas de levedura | |||
| Cepa de controle: MATa; ura3Δ 0; leu2Δ 0; his3Δ 1; met15Δ 0; bar1::kanMX4; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR | Seção 1, ver referências 13 e 14 | ||
| Recombination Strain: MATa; ura3Δ 0; leu2Δ 0; his3Δ 1; met15Δ 0; bar1::kanMX4; RS_LEXA_NS-3_ARS316_NS+3_RS; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR | Seção 1, consulte a referência 13 e o | ||
| K238 | C | ||
| K071 DNA | Seção 7.1, consulte a referência 13 Armazenamento: Armazenar a -20 ° C | ||
| Reagents | |||
| Acetona | Carl Roth | 5025.1 | Seção 2 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente |
| Acetato de amônio (NH4Ac) | Sigma Aldrich | A7262 | Seção 6 e 7.1 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente |
| amônio (NH4OH) 25% | Merck Millipore | 533003 | Seção 6 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente |
| Sulfato de amônio | Santa Cruz | Sc-29085 | Seção 2 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente |
| Ágar Bacto | BD (VWR) | 90000-760 | Seção 3 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente |
| Bacto peptona | BD (VWR) | 211820 | Seção 3 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente |
| β-Mercaptoetanol | Sigma Aldrich | 07604 | Seção 7.2 Armazenamento: Armazenar a 4 ° C |
| Kit de substrato quimioluminescente | ThermoFisher | 34580 | Seção 7.2 Armazenamento: Armazenar a 4 &graus; C |
| Hidrogenofosfato dissódico dodecahidratado | Merck | 1.06579.1000 | Seção 2 e 7.1 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente |
| Ditiotreitol (DTT) | ThermoFisher | 15508013 | Seção 4 Armazenamento: Armazenar a 4 ° C |
| Etanol | Merck | 100983 | Seção 7.1 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente |
| Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) | Sigma Aldrich | ED | Seção 7.1 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente |
| Galactose (20% (p/v) estoque) | Sigma Aldrich | G0625-1KG / 5KG | Seção 3 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente |
| Gel carregando corante (6x) | BioLabs | B7024A | Seção 7.1 Armazenamento: Armazenar a -20 &graus; C |
| Glusose | Sigma-Aldrich | G8270 | Seção Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente |
| Glicina | Carl | Roth.0079.4 | Seção 2 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente |
| Glicogênio (5 mg/mL) | Invitrogen | AM9510 | Seção 7.1 Armazenamento: Armazenar a -20 ° C |
| Ácido clorídrico (HCl) | PanReac AppliChem | 182109.1211 | Seção 2, 4 e 7.1 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente |
| Acetato de magnésio (MgAc) | Bernd Kraft | 15274.2600/C035 | Seção 4 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente |
| Cloreto de magnésio (MgCl2) | Sigma Aldrich | M8266 | Seção 6 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente |
| Nu PAGE Tampão de amostra LDS (4x) | Invitrogen | 2399549 | Seção 7.2 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente |
| Fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1 v/v) | Invitrogen | 15593-031 | Seção 7.1 Armazenamento: Armazenar a 4 &graus; C |
| Cloreto de potássio (KCl) | Sigma | P9541 | Seção 4 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente |
| Marcado radioativamente α-32P dATP (3.000 Ci/mmol, 10 mCi/mL) | Hartmann Analytic | SRP-203 | Seção 7.1 Armazenamento: Armazenar a 4 > C |
| Sistema de rotulagem RadPrime | ThermoFisher | 18428-011 | Seção 7.1 Armazenamento: Armazenar a -20 ° C |
| Rafinose (estoque de 20% (p/v)) | SERVA | 34140.03 | Seção 3 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente |
| Cloreto de sódio (NaCl) | Merck | K53710504142 | Seção 7.1 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente |
| Citrato de sódio (Na3C6H5O7) | Sigma-Aldrich | 71402 | Seção 7.1 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente |
| Hidróxido de sódio (NaOH) | Sigma Aldrich | S5881 | Seção 7.1 Armazenamento: Armazenar à temperatura ambiente |
| N-dodecil sulfato de sódio (SDS) (5% estoque (p/v)) | Alfa Aesar | A11183 | Seção 7.1 Armazenamento: Armazenar à temperatura ambiente |
| Fosfato de sódio monobásico | Sigma-Aldrich | 71496 | Seção 2 e 7.1 Armazenamento: Armazenar à temperatura ambiente |
| Sódio azida | Santa Cruz Biotecnologia | sc-208393 | Seção 2 Armazenamento: Armazenar a -20 & C |
| Trietilamina | Sigma Aldrich | 90340 | Seção 2 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente |
| Tris base | Chem Cruz | SC-3715B | Seção 2 e 4 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | Seção 2 e 4 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente |
| Tween-20 | Bernd Kraft | 18014332 | Seção 4 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente |
| Extrato de levedura | BD (VWR) | 212720 | Seção 3 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente |
| Fator de acasalamento de levedura alfa (1 µ g/mL de estoque ) | Biomol | Y2016.5 | Seção 3 Armazenamento: Armazenar a -20 &graus; C |
| Levedura Sintética Drop-out Medium Suplementos sem LEUCINA | Sigma Aldrich | Y1376 | Seção 1, consulte a referência 14 |
| Enzymes | |||
| HpaI restriction enzyme (5,000 U/mL) | NEB | R0105S | Seção 7.1 Armazenamento: Armazenar a -20 ° |
| Coquetel de Inibidores de Protease e Fosfatase C (100x) | ThermoFisher Scientific | 78446 | Seção 4 Armazenamento: Armazenar em 4 ° C |
| Proteinase K (10 mg/mL) | SERVA | 33756 | Seção 7.1 Armazenamento: Armazenar a -20 ° C |
| RNase A (10 mg/mL) | ThermoFisher | EN0531 | Seção 7.1 Armazenamento: Armazenar a -20 > C |
| TEV protease (10000 U/µ L) | NEB | P8112S | Seção 5 Armazenamento: Armazenar a -20 ° C |
| Materiais | |||
| BcMag Contas magnéticas ativadas por epóxi | Bioclone Inc. | FC-102 | Seção 2 Armazenamento: Armazenar a 4 & graus; C |
| Gelo | Seção 4 | ||
| Tubos de centrífuga de baixa ligação 2,0 mL | Eppendorf | 22431102 | Seção 4 |
| Microspin G-25 Colunas | Cytiva | 27-5325-01 | Seção 7.1 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente |
| Parafilm | Merck | P7793 | Seção 4 |
| Membrana de nylon positiva | Biozol | 11MEMP0001 | Seção 7.1 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente |
| Membrana de transferência de PVDF | Immobilon-Merck Millipore | IPVH00010 | Seção 7.2 Armazenamento: Armazenar em sala temperatura |
| SDS-PAGE gel 4-12% bis-tris (15 poços, 1,5 mm) | Invitrogen | NP0336BOX | Seção 7.2 Armazenamento: Armazenar a 4 > C |
| Seringa (25 mL) com encaixe luer Henke | Sass Wolf | 4200-000V0 | Seção 3 |
| Papel Whatman (Folha de papel Western Blotting de celulose CHR grau 3MM) | Cytiva | 3030-917 | Seção 7.1 Armazenamento: Armazenar em temperatura ambiente |
| Anticorpos | |||
| Anti-LexA, IgG policlonal de coelho, anticorpo da região de ligação ao DNA | Merck Millipore | 06-719 | Seção 7.2 Armazenamento: Armazenar a -20 ° C |
| IgG Anti-Coelho de Cabra (H+L), Conjugado de peroxidase de rábano | Invitrogen | G21234 | Seção 7.2 Armazenamento: Armazenar a -20 ° Anticorpo C |
| Peroxidase Anti-Peroxidase (PAP) produzido em coelho para a detecção de proteínas marcadas com TAP | Sigma Aldrich | P1291-500UL | Seção 7.2 Armazenamento: Armazenar a -20 ° Anticorpos IgG de coelho C |
| Sigma | I5006-100MG | Seção 2 Armazenamento: Armazenar a 4 ° C | |
| Primers (10 µ M) < / strong > | |||
| ARS316: < / strong > fwd 5 '- CGGCATTATCGTACACAACCT, rev 5 '- GTTCTTCGTTGCCTACATTTTCT | Seção 7.1 | ||
| < forte > K071 DNA de plasmídeo spike-in: < / strong> fwd: 5 '- TTTTCGCTGCTTGTCCTTTTTT, rev 5 '- CATTTTCGTCCTCCCAACAT | Seção 7.1 | ||
| < fragmento > PCR forte do DNA genômico de levedura como modelo para amplificação ARS316 (para southern blot): fwd 5'- AAATTCTGCCCTTGATTCGT rev 5'- TTTGTTTATCTCATCACTAAT | Seção 7.1 | ||
| PDC1: fwd 5'- CATGATCAGATGGGGCTTCA, rev 5'-ACCGGTGGTAGCGACTCTGT | Seção 7.1 | ||
| Equipment | |||
| Coffee grinder | Gastroback | 42601 | Seção 4 |
| Frasco Dewar | NAL GENE | 4150-2000 | Seção 3 |
| Rack magnético DynaMag TM-2 | Invitrogen | 12321D | Seção 4, 5 e 6 |
| Forno de hibridização | Hybaid Mini10 | Ri418 | Seção 2 |
| Microcentrífuga | Eppendorf | 5424R | Seção 4 e 7.1 |
| Reticulador UV | Analytikjena | 95-0174-02 | Seção 7.1 |
Referências
- Kornberg, R. D., Lorch, Y. Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryote chromosome. Cell. 98 (3), 285-294 (1999).
- Gauchier, M., van Mierlo, G., Vermeulen, M., Déjardin, J. Purification and enrichment of specific chromatin loci. Nature Methods
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Reimpressões e permissões
