Alinhamento de dados sincronizados de séries temporais usando o modelo de caracterização de perda de sincronia do ciclo celular para comparações entre experimentos

Summary

Um desafio de analisar experimentos sincronizados de séries temporais é que os experimentos geralmente diferem na duração da recuperação da sincronia e no período do ciclo celular. Assim, as medidas de diferentes experimentos não podem ser analisadas de forma agregada ou facilmente comparadas. Aqui, descrevemos um método para alinhar experimentos para permitir comparações específicas de fase.

Abstract

A investigação do ciclo celular muitas vezes depende da sincronização das populações celulares para medir vários parâmetros em uma série temporal à medida que as células atravessam o ciclo celular. No entanto, mesmo sob condições semelhantes, experimentos replicados exibem diferenças no tempo necessário para se recuperar da sincronia e atravessar o ciclo celular, impedindo comparações diretas em cada ponto de tempo. O problema de comparar medidas dinâmicas entre experimentos é exacerbado em populações mutantes ou em condições alternativas de crescimento que afetam o tempo de recuperação da sincronia e/ou o período do ciclo celular.

Publicamos anteriormente um modelo matemático paramétrico chamado Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony (CLOCCS) que monitora como populações síncronas de células se liberam da sincronia e progridem através do ciclo celular. Os parâmetros aprendidos do modelo podem então ser usados para converter pontos de tempo experimentais de experimentos sincronizados de séries temporais em uma escala de tempo normalizada (pontos de linha de vida). Em vez de representar o tempo decorrido em minutos desde o início do experimento, a escala da linha de vida representa a progressão da sincronia para a entrada do ciclo celular e, em seguida, através das fases do ciclo celular. Como os pontos da linha de vida correspondem à fase da célula média dentro da população sincronizada, essa escala de tempo normalizada permite comparações diretas entre experimentos, incluindo aqueles com períodos e tempos de recuperação variáveis. Além disso, o modelo tem sido usado para alinhar experimentos de ciclo celular entre diferentes espécies (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae e Schizosaccharomyces pombe), permitindo assim a comparação direta de medidas do ciclo celular, que podem revelar semelhanças e diferenças evolutivas.

Introduction

Medidas de séries temporais realizadas em populações sincronizadas de células à medida que progridem ao longo do ciclo celular é um método padrão para investigar os mecanismos que controlam a progressão do ciclo celular 1,2,3,4,5,6,7,8 . A capacidade de fazer comparações entre experimentos de séries temporais de sincronia/liberação é vital para nossa compreensão desses processos dinâmicos. O uso de experimentos replicados para corroborar os achados pode aumentar a confiança na reprodutibilidade das conclusões. Além disso, comparações entre condições ambientais, entre mutantes e até mesmo entre espécies podem revelar muitos novos insights sobre a regulação do ciclo celular. No entanto, a variabilidade interexperimental na recuperação da sincronia e na velocidade de progressão do ciclo celular prejudica a capacidade de fazer comparações ponto-a-tempo entre réplicas ou entre experimentos com tempo alterado do ciclo celular. Devido a esses desafios, as réplicas muitas vezes não são incluídas para a série em tempo integral (por exemplo, Spellman et ^al.4). Quando réplicas para toda a série temporal são coletadas, os dados não podem ser analisados de forma agregada, mas uma única réplica é usada para análise, e outras réplicas são frequentemente relegadas a figuras suplementares (por exemplo, Orlando et ^al.8). Além disso, comparações entre experimentos com diferentes características de recuperação ou progressão do ciclo celular são difíceis. As medidas de intervalos menores entre um evento de interesse e um marco do ciclo celular (por exemplo, emergência de gemas, entrada em fase S ou início de anáfase) podem ajudar a reduzir erros se esses eventos de referência forem rastreados 1,2,3,9,10,11,12. No entanto, diferenças sutis, mas importantes, podem permanecer não detectadas ou obscurecidas usando esses métodos ad hoc. Finalmente, as análises de célula única permitem analisar a progressão do ciclo celular sem depender de sincronização ou alinhamento¹³, embora medições em larga escala em estudos unicelulares possam ser desafiadoras e caras.

Para superar essas dificuldades, desenvolvemos o modelo Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony (CLOCCS) para auxiliar a análise de medidas de séries temporais realizadas em populações sincronizadas^14,15. CLOCCS é um modelo matemático flexível que descreve a distribuição de células sincronizadas através de fases do ciclo celular à medida que elas são liberadas da sincronia e progridem através do ciclo celular. A estrutura do processo de ramificação permite que o modelo dê conta das qualidades assimétricas das células mãe e filha após a divisão, como observado em S. cerevisiae, ao mesmo tempo em que é útil para organismos que se dividem por fissão, como S. pombe. O modelo pode receber entradas de um conjunto diverso de tipos de medição para especificar a fase do ciclo celular. Pode ingerir dados de fase do ciclo celular brotante, que incluem medidas da porcentagem de células brotadas ao longo do tempo, permitindo estimar o número de células fora da fase G1 não brotada^14,15. O modelo também pode ingerir dados de citometria de fluxo que medem o conteúdo de DNA, permitindo a avaliação das transições de pontos de referência de G1 para S, S para G2 e M para G1¹⁵. Marcadores morfológicos fluorescentes também podem ser usados para identificar a fase do ciclo celular. A marcação fluorescente de anéis de miosina, núcleos e fusos polos (SPBs) pode ser usada para determinar a fase do ciclo celular, e estes foram incorporados ao modelo CLOCCS¹¹; no entanto, essas medidas não serão descritas neste protocolo. Adicionalmente, o índice de septação foi utilizado como entrada para a modelagem dos dados de S. pombe¹⁴. Assim, o modelo pode ser usado para análises do ciclo celular em uma variedade de organismos e pode ser expandido ainda mais.

O CLOCCS é um modelo paramétrico que permite a inferência bayesiana completa de múltiplos parâmetros a partir dos dados de entrada (por exemplo, porcentagem de brotamento, conteúdo de DNA). Esses parâmetros incluem o tempo de recuperação da sincronia, a duração do período do ciclo celular (estimado separadamente para as células mãe e filha) e a posição média do ciclo celular das células em cada ponto de tempo. Esses parâmetros representam o comportamento da célula média na população, permitindo ao pesquisador mapear cada ponto de tempo para uma posição do ciclo celular expressa como um ponto de linha de vida. A conversão para pontos da linha de vida depende dos parâmetros CLOCCS lambda (λ) e mu0 (μ₀)^14,15. O parâmetro λ corresponde ao período médio do ciclo celular das células-mãe. No entanto, devido ao atraso mãe-filha^14,15, este não é o período médio do ciclo celular de toda a população que inclui tanto as células da mãe quanto as da filha. A CLOCCS infere adicionalmente o parâmetro delta (δ), que corresponde ao atraso mãe-filha e, assim, permite o cálculo do período médio do ciclo celular de toda a população. Finalmente, como cada experimento começa após a liberação da sincronização do ciclo celular, o tempo necessário para se recuperar do método de sincronização é representado pelo parâmetro CLOCCS μ₀. O CLOCCS ajusta um modelo aos dados de fase do ciclo celular de entrada e, em seguida, infere esses parâmetros usando um algoritmo de Monte Carlo de cadeia de Markov de passeio aleatório^14,15. Ao mapear vários experimentos para uma escala de tempo comum de linha de vida do ciclo celular, comparações diretas específicas de fase podem ser feitas entre réplicas ou experimentos onde o tempo de recuperação ou os períodos do ciclo celular não são idênticos 8,14,15.

Como populações sincronizadas perdem sincronia em alguma taxa ao longo da série temporal^14,15,16,17, a variabilidade na taxa de perda de sincronia também pode impedir comparações quantitativas entre experimentos. Ao identificar a localização das populações e a variância em suas distribuições, a CLOCCS explica as diferenças nas taxas de perda de sincronia. Essa poderosa ferramenta permite comparações específicas e detalhadas entre experimentos, fornecendo a capacidade de fazer comparações relevantes diretamente não apenas entre replicantes, mas também entre condições ambientais, mutantes e até mesmo espécies que têm tempos de ciclo celular dramaticamente diferentes^14,15.

Este artigo descreve um método usando CLOCCS para estimar parâmetros ajustando dados de experimentos de séries temporais de sincronia/liberação, mapear os dados para uma escala de linha de vida comum e, em seguida, fazer comparações relevantes entre réplicas ou experimentos. O alinhamento da linha de vida permite comparações diretas específicas de fase nesses experimentos, o que permite a agregação e comparação de réplicas e fazer comparações mais relevantes entre experimentos com diferentes tempos de recuperação e períodos de ciclo celular.

Protocol

1. Coleta de dados experimentais e de fase do ciclo celular

1. Sincronizar as células em relação ao ciclo celular usando o método de sincronização desejado (por exemplo, elutriação centrífuga como descrito em Leman et al.18 ou parada de feromônio de acasalamento como descrito em Rosebrock 19; tanto Leman et al.18 quanto Rosebrock ¹⁹ também incluem métodos para a liberação de sincronia). Comece a amostragem ao longo da série temporal, garantindo que a série temporal tenha pelo menos dois períodos completos de ciclo celular e, idealmente, colete pelo menos 10 amostras por ciclo celular. Em cada ponto de tempo, coletar uma amostra para dados de fase do ciclo celular (brotamento ou citometria de fluxo) e uma amostra para dados experimentais, conforme descrito abaixo.
2. Se estiver usando dados de brotamento como dados de fase do ciclo celular, colete dados sobre brotamento para o alinhamento do CLOCCS.
   1. Amostra ao longo da série temporal. Para cada momento, coletar células e fixá-las misturando 200 μL de cultura de células sonicadas com 200 μL de solução fixadora, conforme descrito em Leman et ^al.18.
   2. Para brotamento padrão, conte pelo menos 200 células por ponto de tempo usando um microscópio de luz transmitida com uma objetiva de 40x e um hemocitômetro. Adicionar a amostra celular do passo 1.2.1 ao hemocitómetro e diluir se a densidade impedir a contagem. Registre o número de células brotadas e não brotadas em cada ponto de tempo. Calcule a porcentagem de células brotadas e plote para cada ponto de tempo em uma curva de brotamento.
      Observação : outros métodos de especificar as informações de fase do ciclo celular estão disponíveis, mas eles não são descritos neste protocolo. Os demais métodos estão descritos no leiame do CLOCCS e em trabalho anterior¹¹.
3. Se estiver usando dados de conteúdo de DNA por citometria de fluxo como dados de fase do ciclo celular, colete dados de coloração de DNA por citometria de fluxo para o alinhamento CLOCCS por citometria de fluxo.
   1. Amostra ao longo da série temporal. Para cada ponto de tempo, colete células e fixe-as conforme descrito em Haase e Reed²⁰.
   2. Manchar o DNA e analisar usando análise de citometria de fluxo padrão. Um protocolo de coloração recomendado para S. cerevisiae é descrito em Haase e Reed²⁰.
4. Coletar dados ômicos associados ou experimentais relacionados. Para dados transcriptômicos padrão, coletar conforme descrito em Leman et ^al.18 e Kelliher et ^al.21,22. Certifique-se de que os dados estejam associados a pontos de tempo que contenham dados de fase do ciclo celular para permitir o alinhamento a jusante. Para um alinhamento ideal, certifique-se de que cada ponto de tempo que contém dados experimentais também tenha dados de fase associados a ele.
   NOTA: Os dados experimentais podem assumir muitas formas. Tradicionalmente, usamos o método de alinhamento descrito para alinhar experimentos transcriptômicos de séries temporais. No entanto, qualquer tipo de dado associado a pontos de tempo pode ser alinhado (i.e., proteômica²²).

2. Instalando o software necessário

NOTA: Esta seção pressupõe que o Conda, o Java 19 e o Git já estão instalados (Tabela de Materiais).

1. Baixe o repositório CLOCCS_alignment digitando o seguinte comando no terminal:
   git clone git clone https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git
2. Crie um ambiente Conda usando o arquivo conda_req.yml inserindo o seguinte comando no terminal na pasta onde o repositório CLOCCS_alignment foi clonado:
   conda env criar -f conda_req.yml

3. Utilização do CLOCCS para parametrização dos experimentos

1. Clique duas vezes no arquivo cloccs_v2023.jar na pasta CLOCCS no repositório CLOCCS_alignment e aguarde a abertura de uma interface gráfica do usuário. Esta tela permite opções de entrada para a execução do CLOCCS e exibe os resultados depois de executados.
2. Insira as configurações gerais.
   1. Defina Sim Anneal, Burn In e Iterations digitando as caixas de entrada de texto associadas. O Sim Anneal (recozimento simulado) identifica bons valores de parâmetros iniciais, o Burn In procura os modos posteriores e o estágio final permite que todas as inferências posteriores sejam desenhadas. Valores mais altos aumentam o tempo de execução, mas também aumentam a precisão.
   2. Insira as condições experimentais especificando a temperatura em Celsius e o método de sincronização usando a caixa de texto denominada Temperatura e o menu suspenso Sincronizar. Método, respectivamente.
   3. Opcionalmente, defina as configurações avançadas no menu Configurações avançadas. As configurações avançadas permitem que os priores sejam definidos para cada um dos parâmetros ("mu0", "sigma0", "sigmav", "lambda", "bud.start", "bud.end").
      Observação : mais informações sobre as configurações avançadas podem ser encontradas no readme.txt na pasta CLOCCS do repositório CLOCCS_alignment.
3. Insira as configurações para uso com os dados de brotamento.
   1. Escolha a seleção apropriada no menu suspenso Tipo de modelo . A opção padrão Bud é para informações de brotamento padrão para levedura em brotamento.
      NOTA: Outras opções mais avançadas também existem no menu suspenso: Mutante para informações de brotamento para mutantes que passam por vários ciclos de brotamento sem divisão, BudSSLSMR para informações de brotamento e informações adicionais do corpo do polo do fuso e do anel de miosina, e BudNucDivNeck para informações de brotamento e informações adicionais de núcleos de divisão e pescoço de brotamento. Essas opções avançadas estão descritas no leiame do CLOCCS e em trabalhos anteriores^11,14,15.
   2. Importe os dados usando o painel Importação de dados digitando nas caixas de entrada de texto ou carregando um arquivo clicando no botão Selecionar arquivo . A primeira coluna especifica os pontos de tempo. As duas colunas restantes especificam os dados de brotamento e podem usar qualquer uma das seguintes opções: o número de células não budadas (Sem Bud), o número de células budadas (Bud) ou o número total de células (Total).
4. Insira as configurações para uso com os dados de citometria de fluxo. Para cada experimento, execute a etapa 3.3 ou a etapa 3.4.
   NOTA: Os dados de citometria de fluxo e os dados de brotamento podem ser usados juntos. Embora anteriormente tenhamos descrito executá-los juntos¹⁵, para esta ferramenta, eles devem ser executados de forma independente e, em seguida, comparados.
   1. Converta os arquivos .fcs no formato de entrada CLOCCS correto para citometria de fluxo seguindo as instruções no arquivo suplementar 1 (também encontrado no repositório CLOCCS_alignment como CLOCCS/flow_cytometry_conversion_instructions.txt).
   2. Selecione a seleção Fluxo no menu suspenso Tipo de modelo .
   3. Importe os dados usando o painel Importação de Dados. Clique em Selecionar arquivo e selecione o arquivo gerado na etapa 3.4.1.
   4. Selecione os pontos de tempo para os quais um ajuste de CLOCCS de citometria de fluxo deve ser plotado selecionando os pontos de tempo na caixa Tempos para ajuste .
5. Depois que todas as entradas tiverem sido selecionadas para brotamento ou citometria de fluxo, clique no botão Aplicar e, em seguida, clique no botão Amostra na parte superior da tela.
6. Visualize a curva de brotamento ou gráficos de citometria de fluxo com os ajustes previstos selecionando a guia Ajustes previstos . Essa guia é aberta por padrão imediatamente após a etapa anterior.
7. Visualize os histogramas de parâmetros para cada parâmetro selecionando a guia Histogramas de parâmetro e, em seguida, selecionando a subguia que corresponde ao parâmetro de interesse nas seguintes opções: mu0, delta, sigma0, sigmav, lambda, bud.start, bud.end, etc.
8. Visualize o gráfico de pontuação posterior selecionando a guia Escore posterior .
9. Visualize as configurações e altere-as ainda mais selecionando a guia Configurações ; exiba o log das execuções anteriores selecionando a guia Log .
10. Obtenha os parâmetros CLOCCS a partir do ajuste selecionando a guia Parâmetros posteriores . A tabela resultante terá a seguinte forma: cada linha consiste em um parâmetro, com a linha final sendo a posterior. As colunas consistem no parâmetro previsto para a média, o intervalo de confiança inferior a 2,5%, o intervalo de confiança superior de 97,5% e a taxa de aceitação.
    1. Registrar os parâmetros usados para alinhamento para cada experimento: o tempo de recuperação da sincronia (μ₀) e o período médio do ciclo celular das células-mãe (λ).
    2. Calcule o período do ciclo celular calculando a média do período da célula mãe (λ) e do período da célula filha (λ + δ), onde δ é o atraso específico da filha.
       NOTA: Repita a seção 3 com todos os experimentos a serem incluídos nas comparações.

4. Conversão de pontos de tempo em pontos de linha de vida usando as funções de conversão Python e os parâmetros CLOCCS

NOTA: A conversão entre pontos de tempo e pontos de linha de vida requer duas fórmulas de conversão²¹. Uma implementação Python para conversão e visualização de dados está disponível no repositório CLOCCS_alignment e descrita abaixo.

1. Ative o ambiente Conda digitando o seguinte comando no terminal: conda activate CLOCCS_alignment
2. Abra um bloco de anotações Python interativo digitando o seguinte comando no terminal: jupyter notebook
3. Crie um novo bloco de anotações Python na pasta desejada.
   Observação : um bloco de anotações de exemplo foi incluído para demonstrar o uso padrão e pode ser encontrado em Alignment/JOVE_example.ipynb no repositório de alinhamento CLOCCS_.
4. Importe o arquivo Python que contém as funções de alinhamento executando o seguinte comando na primeira célula:
   %execute path_to_repo/cloccs_alignment/Alinhamento/utilitários.py
   1. Substitua o caminho para o repositório CLOCCS_alignment por path_to_repo.
5. Se estiver usando dados de budding como os dados da fase do ciclo celular, importe um quadro de dados contendo a porcentagem de budded em cada ponto de tempo executando o seguinte comando em uma nova célula:
   budding_df = pd.read_csv("path_to_folder/budding_filename.tsv", sep ="\t", index_col=0)
   1. Substitua o caminho e o nome do arquivo apropriados. Se o arquivo for um arquivo .csv, remova sep ="\t"
6. Se estiver usando dados de brotamento como os dados de fase do ciclo celular, alinhe os dados de brotamento a uma escala de tempo de ponto de linha de vida inserindo a seguinte função em uma nova célula:
   aligned_budding_df = df_conversion_from_parameters(budding_df, timepoints, param_mu0, param_lambda)
   1. Para pontos de tempo, substitua uma lista dos pontos de tempo para ser o índice do quadro de dados budding_df.
   2. Para param_mu0 e param_lambda, substitua os parâmetros aprendidos do CLOCCS em brotamento executado na seção 3 pelo experimento.
7. Se estiver usando dados de citometria de fluxo, importe os dados de citometria de fluxo executando o seguinte comando em uma nova célula:
   flow_samples = flow_cytometry_import(flow_input_folder)
   1. Por flow_input_folder, substitua o caminho apropriado para a pasta que contém os arquivos .fcs da citometria de fluxo.
8. Se estiver usando dados de citometria de fluxo, gere uma tabela de conversão entre os pontos de tempo e os pontos da linha de vida para cada experimento digitando o seguinte comando em uma nova célula:
   flow_converter = convert_tp_to_ll(pontos de tempo, param_mu0, param_lambda)
   1. Para pontos de tempo, substitua uma lista dos pontos de tempo dos dados de citometria de fluxo.
   2. Para param_mu0 e param_lambda, substitua os parâmetros aprendidos da citometria de fluxo CLOCCS executada na seção 3 pelo experimento.
9. Importe o quadro de dados que contém os dados experimentais para o bloco de anotações executando o seguinte comando em uma nova célula:
   data_df = pd.read_csv("path_to_folder/exp_data_filename.tsv", sep ="\t", index_col=0)
   1. Substitua o caminho e o nome do arquivo apropriados. Se o arquivo for um arquivo .csv, remova sep ="\t".
      Observação : isso pode ser feito para quaisquer dados tabulares. Os dados experimentais devem simplesmente ter os pontos de tempo como as colunas ou o índice do quadro de dados. Dados de exemplo podem ser encontrados no repositório CLOCCS_alignment.
10. Alinhe os dados experimentais a uma escala de tempo de ponto de linha de vida inserindo a seguinte função em uma nova célula:
    lifeline_aligned_df = df_conversion_from_parameters(data_df, timepoints, param_mu0, param_lambda, interpolar, lowerll, upperll)
    1. Para pontos de tempo, substitua uma lista dos pontos de tempo como o índice ou as colunas do data_df experimental da etapa anterior.
    2. Para param_mu0 e param_lambda, substitua os valores obtidos na seção 3 do CLOCCS.
       Observação : os parâmetros podem vir de qualquer execução CLOCCS executada em qualquer um dos tipos de dados de fase de ciclo celular aceitos.
    3. Opcionalmente, substitua interpolar por True ou False, ou deixe em branco (o padrão é False).
       Observação : quando definido como False, os dados não serão interpolados. Quando definido como True, os pontos da linha de vida serão arredondados e interpolados para preencher os valores entre os pontos da linha de vida, de modo que haja um ponto por inteiro no intervalo dos pontos da linha de vida. Isso permite uma melhor comparação entre conjuntos de dados.
    4. Opcionalmente, substitua lowerll e upperll por Nenhum ou valores inteiros.
       Observação : quando definido como Nenhum, todos os pontos de linha de vida após a interpolação são mantidos. Quando inteiros são fornecidos , isso trunca os dados para que os pontos da linha de vida variem do lowerll ao upperll. Isso permite a comparação entre conjuntos de dados com um lowerll ou upperll diferente.
11. Baixe o conjunto de dados alinhado à linha de vida inserindo o seguinte comando em uma nova célula: lifeline_aligned_df.to_csv("path_to_desired_location/name_of_file.tsv", sep = "\t")
12. Repita as etapas 4.5-4.11 com todos os experimentos a serem incluídos nas comparações.

5. Comparação entre curvas de brotamento e dados de citometria de fluxo

1. Plote as curvas de brotamento antes do alinhamento usando a função de utilitários Python inserindo o seguinte comando em uma nova célula:
   plot_budding_curves(list_of_budding_curves, list_for_legend = leg_list, point_type = str_type, título = str_title)
   1. Substitua uma lista contendo os quadros de dados de todas as curvas de brotamento desejadas pela plotagem por list_of_budding_curves-[bud_df1, bud_df2, bud_df3].
   2. Substitua uma lista dos rótulos pela legenda - [Experimento 1, Experimento 2, Mutante] por leg_list se desejar. Caso contrário, exclua ou substitua Nenhum.
   3. Substitua o tempo por str_type.
   4. Substitua um título de cadeia de caracteres Comparison Budding Curves por str_title se desejar. Caso contrário, substitua Nenhum ou exclua.
2. Plote as curvas de brotamento após o alinhamento usando a função de utilitários Python seguindo as instruções na etapa 5.1, mas com uma lista de curvas de brotamento alinhadas substituídas por list_of_budding_curves e com linha de vida para point_type em vez de tempo.
3. Para plotar os dados de citometria de fluxo, plote os dados associados dos arquivos .fcs nos pontos de linha de vida correspondentes usando o conversor gerado na etapa 4.8.
4. Converta os pontos da linha de vida para a fase do ciclo celular usando a tabela do conversor (Tabela 1).
   Observação : isso também pode ser plotado seguindo as instruções na etapa 5.1, mas com fase para point_type em vez de tempo.

6. Comparação dos dados experimentais

1. Determinar a lista de genes a ser plotada nos gráficos de linhas com base em informações da literatura ou nos genes de interesse para a pesquisa.
2. Use as plot_linegraph_comparison fornecidas no arquivo de utilitários Python para executar comparações de gráfico de linha no quadro de dados original, alinhado ou alinhado e interpolado digitando o seguinte comando em uma nova célula:
   plot_linegraph_comparison(list_of_dfs, list_for_legend, genelista, point_type = str_type, título = str_title)
   1. Substitua uma lista dos quadros de dados dos experimentos a serem comparados por list_of_dfs.
      Observação : os quadros de dados podem ser desalinhados, ou alinhados; No entanto, o point_type correspondente deve ser introduzido na etapa 6.2.4.
   2. Substitua uma lista dos títulos de cada quadro de dados na mesma ordem que a lista de quadros de dados para list_for_legend.
   3. Substitua uma lista dos nomes dos genes (que devem ser incluídos no índice dos quadros de dados) a serem plotados por genelista.
   4. Substitua o tipo de ponto por str_type. Use linha de vida (o padrão é escala de ponto de linha de vida) ou fase (a escala de linha de vida de fase de ciclo celular) para os quadros de dados alinhados na etapa 6.2.1 ou tempo para os quadros de dados não alinhados na etapa 6.2.1.
   5. Substitua um título de cadeia de caracteres opcional por str_title.
3. Determinar a lista de genes a serem incluídos no mapa de calor usando a literatura ou algoritmos para determinar os principais genes periódicos.
   NOTA: Para comparações adequadas do mapa de calor, os dados devem ser alinhados, interpolados e ajustados na escala de tempo na etapa 6.2; ele deve ter o mesmo valor de linha de vida inicial e final para cada experimento.
   1. Executar algoritmos de periodicidade para determinar os principais genes periódicos^23,24, ou usar os métodos alternativos desejados para determinar a lista de genes (i.e.^, resultados da literatura).
   2. Importe um arquivo de lista de genes .csv ou .tsv para o bloco de anotações usando o seguinte comando em uma nova célula:
      sort_df = pd.read_csv("path_to_folder/sorting_filename.tsv", sep="\t", index_col=0)
   3. Substitua o caminho e o nome do arquivo apropriados. Se o arquivo for um arquivo .csv, remova sep="\t".
4. Use a função fornecida plot_heatmap_comparison no arquivo de utilitários Python para executar uma comparação de mapa de calor no quadro de dados alinhado, interpolado e alinhado à fase digitando o seguinte comando em uma nova célula:
   plot_heatmap_comparison(list_of_dfs, list_for_legend, genelista, título = str_title)
   1. Substitua uma lista dos quadros de dados alinhados dos experimentos a serem comparados por list_of_dfs.
   2. Substitua uma lista dos títulos de cada quadro de dados na mesma ordem que a lista de quadros de dados para list_for_legend.
   3. Substitua uma lista dos nomes dos genes (que devem ser incluídos no índice dos quadros de dados) a serem plotados por genelista.
   4. Substitua um título de cadeia de caracteres opcional por str_title.
      NOTA: O primeiro quadro de dados na lista é aquele que será usado para ordenar os genes no mapa de calor. Os genes serão ordenados pelo máximo no primeiro período para esse quadro de dados, e a mesma ordem será usada para os quadros de dados subsequentes na lista.

Results

As etapas descritas no protocolo acima e no fluxo de trabalho da Figura 1 foram aplicadas a cinco experimentos de séries temporais sincronizadas em ciclo celular para demonstrar duas comparações representativas: entre réplicas com diferentes métodos de sincronia (feromônio de acasalamento e elutriação centrífuga¹⁸) e plataformas de sequenciamento (RNA-sequenciamento [RNA-seq] e microarray), bem como entre condições experimentais. Múltiplos experimentos foram realizado...

Discussion

Este artigo apresenta um método para avaliar de forma mais precisa e quantitativa dados de experimentos de séries temporais em populações sincronizadas de células. O método utiliza parâmetros aprendidos do CLOCCS, um modelo bayesiano de inferência que utiliza dados de fase do ciclo celular de entrada, como dados de brotamento e dados de conteúdo de DNA de citometria de fluxo, para parametrizar cada experimento^14,15. O CLOCCS usa os dados de fase do ciclo celular ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2x PBS			Para Solução Fixadora. Descrito em Leman 2014.
4% de formaldeído			para solução fixadora.
100% Etanol			Para fixação por citometria de fluxo. Descrito em Haase 2002.
Citômetro
citometria de fluxo.
	Microscópio
Para contar células e brotos.
Miniconda			https://docs.conda.io/en/latest/
		de protease	Para protocolo de citometria de fluxo. Descrito em Haase 2002.
		de RNAse A	Para protocolo de citometria de fluxo. Descrito em Haase 2002.
Invitrogen	S7020	ácido nucleico de SYTOX	para a coloração da citometria de fluxo. Descrito em Haase 2002.
Tris			pH 7,5