Aqui, apresentamos um protocolo para alcançar a fabricação em larga escala de células aderentes através de um sistema totalmente fechado baseado em microcarreadores dissolvidos grau GMP. O cultivo de células-tronco mesenquimais humanas, células HEK293T e células Vero foi validado e atendeu tanto às exigências de quantidade quanto aos critérios de qualidade para a indústria de terapia celular e gênica.
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Artigo de método
Produção de células em larga escala com base em microtransportadores porosos solúveis de grau GMP
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Pesquisadores da indústria de terapia celular e gênica (CGT) há muito enfrentam um desafio formidável na expansão eficiente e em larga escala das células. Para resolver as deficiências primárias do sistema de cultura planar bidimensional (2D), desenvolvemos de forma inovadora uma plataforma automatizada de produção de células em escala industrial fechada (ACISCP) baseada em um microtransportador poroso, solúvel e de grau GMP para a cultura 3D de células aderentes, incluindo células-tronco mesenquimais/estromais humanas (hMSCs), células HEK293T e células Vero. Para alcançar a expansão em larga escala, uma expansão de dois estágios foi conduzida com biorreatores de tanque agitado de 5 L e 15 L para produzir 1,1 x10 10 hMSCs com uma expansão geral de 128 vezes em 9 dias. As células foram colhidas por dissolução completa dos microcarreadores, concentradas, lavadas e formuladas com um sistema de processamento celular baseado em centrífuga de fluxo contínuo e, em seguida, aliquotadas com um sistema de enchimento celular. Em comparação com a cultura planar 2D, não há diferenças significativas na qualidade das hMSCs colhidas da cultura 3D. Também aplicamos esses microcarreadores porosos solúveis a outros tipos de células populares no setor CGT; especificamente, células HEK293T e células Vero foram cultivadas até densidades celulares máximas de 1,68 x 10 7 células/mL e 1,08 x 107 células/mL, respectivamente. Este estudo fornece um protocolo para o uso de uma plataforma de engenharia de bioprocessos que aproveita as características de microtransportadores dissolvidos de grau GMP e equipamentos fechados avançados para alcançar a fabricação em escala industrial de células aderentes.
Introdução
A indústria de CGT testemunhou uma expansão exponencial nas últimas duas décadas. Espera-se que a evolução dos medicamentos de última geração tratem e cure inúmeras doenças refratárias1. Desde a primeira aprovação da Food and Drug Administration (FDA) de um produto CGT, Kymriah, em 2017, a pesquisa e o desenvolvimento relacionados à CGT no mundo continuaram a crescer em um ritmo rápido, com a FDA vendo os pedidos de novos medicamentos experimentais ativos para CGT aumentarem para 500 em 20182. Previa-se que o número de aprovações de produtos CGT provavelmente seria de 54-74 nos Estados Unidos até 20302<....
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Protocolo
O cordão umbilical humano foi obtido do Hospital Beijing Tsinghua Changgeng. Todos os procedimentos e protocolos referentes à aquisição, isolamento e cultura de células-tronco mesenquimais do cordão umbilical humano (CTMSCs) foram conduzidos com consentimento informado e com a aprovação do Comitê de Ética do Beijing Tsinghua Changgeng Hospital (processo número 22035-4-02), e os procedimentos e protocolos cumpriram a declaração de Helsinque de 1964 e suas alterações posteriores ou padrões éticos comparáveis.
1. Cultura monocamada de hMSCs, células HEK293T e células Vero
- Isolar as UCMSCs humanas primárias da geleia ....
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Resultados
A plataforma ACISCP é um sistema totalmente fechado que emprega uma série de biorreatores de tanque agitado para expansão em escala, um sistema de processamento de células para colheita e formulação automatizada de células e um sistema de enchimento de células (Figura 1). As células aderentes ligam-se aos microcarreadores porosos, que podem ser dispersos no biorreator, conseguindo, assim, o cultivo em suspensão das células aderentes.
Seguindo o protocolo descrito,.......
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Discussão
Tanto a imunoterapia quanto a terapia com células-tronco utilizam células vivas como drogas; No entanto, seus produtos finais não devem ser purificados ou esterilizados da mesma forma que pequenas moléculas ou vírus. Portanto, o princípio do Quality by Design (QbD) deve ser sempre lembrado e aplicado na prática ao processo de Fabricação e Controle Químico (CMC) durante a produção de células23. Um sistema de cultura de células totalmente fechado, bem como um sistema de processamento e um sistema de.......
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Divulgações
Y.D. é um consultor científico, e H.X., Y.Z., L.G., M.L., Y.Y., W.L. e X.Y. são funcionários da Beijing CytoNiche Biotechnology Co. Os demais autores não têm interesse comercial, proprietário ou financeiro nos produtos ou empresas descritos neste artigo. Todos os outros autores declaram não ter interesses concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation for Distinguished Young Scholars (82125018).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,25% de tripsina EDTA | BasalMedia | S310JV | Usado para colheita de células 2D. |
| 3D FloTrix Digest | CytoNiche Biotech | R001-500 | Este é um reagente que dissolve especificamente os microtransportadores 3D TableTrix. |
| 3D FloTrix MSC Meio Livre | Soro CytoNiche Biotech | RMZ112 | Este é um meio sem soro, sem animais, para expansão e manutenção de células-tronco mesenquimais em cultura planar 2D, bem como cultura 3D em microtransportadores 3D TableTrix. |
| Módulo de Filtração de Uso Único 3D FloTrix | CytoNiche Biotech | R020-00-10 | Este módulo contém 0,22 μ Filtros de cápsula M usados para filtração de meio de cultura e solução de digestão. |
| Saco de armazenamento descartável 3D FloTrix (10 L) | CytoNiche Biotech | R020-00-03 | Usado como saco de alimentação para biorreator de 5 L. |
| Saco de armazenamento de uso único 3D FloTrix (3 L) | CytoNiche Biotech | R020-00-01 | Usado como sacos de semeadura ou transferência de células. |
| Saco de armazenamento descartável 3D FloTrix (50 L) | CytoNiche Biotech | R020-00-04 | Usado como saco de alimentação para biorreator de 15 L. |
| 3D FloTrix vivaPACK Enchimento Descartável Kit de consumíveis de acabamento | CytoNiche Biotech | PACK-01-01 | Este é um kit padrão adaptado ao sistema de enchimento e acabamento 3D vivaPACK. |
| Sistema de enchimento e acabamento 3D FloTrix vivaPACK para células | CytoNiche Biotech | vivaPACK | Este sistema é um dispositivo fechado de manuseio de líquidos, com funções automatizadas de mistura e exaustão de gás. As células ressuspensas em tampão de criopreservação podem ser rápida e uniformemente alicadas em 20 sacos por lote. |
| Sistema de processamento celular 3D FloTrix vivaPREP PLUS | CytoNiche Biotech | vivaPREP PLUS | Este sistema é um dispositivo baseado em centrífuga de fluxo contínuo. As células podem ser concentradas, lavadas e ressuspensas sob procedimentos completamente fechados. |
| Kit de Processamento de Células Descartáveis 3D FloTrix vivaPREP PLUS | CytoNiche Biotech | PREP-PLUS-00 | Este é um kit padrão adaptado ao processamento de células 3D vivaPREP PLUS. |
| Biorreator 3D FloTrix vivaSPIN 15 L | CytoNiche Biotech | FTVS15 | Este produto de biorreator emprega um controlador, um recipiente de tanque agitado de vidro de 15 L e assessorias. Um tubo de perfusão especial está disponível. |
| Biorreator 3D FloTrix vivaSPIN 5 L | CytoNiche Biotech | FTVS05 | Este produto de biorreator emprega um controlador, um recipiente de tanque agitado de vidro de 5 L e assessorias. Um tubo de perfusão especial está disponível. |
| Pacote de consumíveis de sistema fechado 3D FloTrix vivaSPIN (10/15 L) | CytoNiche Biotech | R020-10-10 | Este é um kit de tubos padrão adaptado ao biorreator 3D vivaSPIN de 15 L, contendo sacos de amostragem. |
| Pacote de consumíveis de sistema fechado 3D FloTrix vivaSPIN (2/5 L) | CytoNiche Biotech | R020-05-10 | Este é um kit de tubulação padrão adaptado ao biorreator 3D vivaSPIN 5 L, contendo sacos de amostragem. |
| Microtransportadores 3D TableTrix G02 | CytoNiche Biotech | G02-10-10g | Esses microtransportadores porosos e degradáveis são adequados para cultura de células HEK293T. Eles vêm pré-esterilizados em 10g/garrafa com tubos C-Flex para soldagem a tubos em biorreatores. |
| 3D TableMicrocarriers Trix V01 | CytoNiche Biotech | V01-100-10g | Esses microtransportadores porosos e degradáveis são adequados para cultura de células aderentes, eles vêm como microtransportadores não esterilizados que precisam ser autoclavados em PBS antes do uso. Eles são especialmente adequados para a produção de vacinas. |
| 3D TableMicrotransportadores Trix W01 | CytoNiche Biotech | W01-10-10g (embalagem descartável); W01-200 (comprimidos) | Esses microtransportadores porosos e degradáveis são adequados para cultura de células aderentes, especialmente para células que precisam ser colhidas como produtos finais. Eles vêm pré-esterilizados em 10g/garrafa com tubos C-Flex para soldagem a tubos em biorreatores. O produto obteve 2 qualificações para excipientes farmacêuticos da CDE, com os números de registro de [F20200000496; F20210000003]. Também recebeu a qualificação DMF para excipientes farmacêuticos da FDA, com o número de registro de [DMF:35481] |
| APC anticorpo CD45 humano | BioLegend | 368512 | Usado em citometria de fluxo para avaliação de identidade MSC |
| Calcein-AM/PI Double Staining Kit | Dojindo | C542 | Calcein-AM/PI Double Staining Kit é utilizado para coloração simultânea de fluorescência de células viáveis e mortas. Este kit contém soluções de Calceína-AM e Iodeto de Propídio (PI), que coram células viáveis e mortas, respectivamente. |
| Tampa para tampas de contêineres EZ Top para recipientes NALGENE (500mL) | Saint-Gobain | CAP-38 | As marcas e números de catálogo são apenas, por exemplo, produtos semelhantes estão disponíveis em vários fornecedores e, desde que tenham a mesma funcionalidade, os itens podem ser substituídos por outras marcas. |
| Tubulação C-Flex, Formulação 374 (0,25 pol x 0,44 pol) | Saint-Gobain | 374-250-3 | Usado para soldagem e desconexão de tubos. |
| Saco de Congelamento CryoMACS 50 | Miltenyi Biotec | 200-074-400 | Usado para expandir o 3D FloTrix vivaPACK Descartável Fill& Kit de consumíveis de acabamento. |
| Dimetil Sulfato (DMSO) | Sigma | D2650-100mL | Usado para preparação de solução de criopreservação. |
| Meio de Águia Modificado (DMEM) de Dulbecco | BasalMedia | L120KJ | Usado para cultivo de células HEK293T e Vero. |
| DURAN Original GL 45 Frasco de laboratório (2 L) | DWK ciências da vida | 218016357 | Usado para coleta de resíduos do biorreator de 5 L. |
| Garrafa de laboratório DURAN Original GL 45 (5 L) | DWK ciências da vida | 218017353 | Usado para coleta de resíduos do biorreator de 15 L. |
| DURAN Original GL 45 Frasco de laboratório (500 mL) | DWK ciências da vida | 218014459 | Usado para frasco suplementar de 0,1 M NaOH. |
| Tampas de contêineres EZ Top para recipientes NALGENE (500mL) | Saint-Gobain | EZ500 ML-38-2 | As marcas e números de catálogo são apenas para exemplo, produtos semelhantes estão disponíveis em vários fornecedores e, desde que tenham a mesma funcionalidade, os itens podem ser substituídos por outras marcas. |
| Soro fetal bovino (FBS) de qualidade superior | Wisent | 086-150 | Utilizado para cultivo de células HEK293T. |
| Anticorpo anti-CD14 humano FITC | BioLegend | 301804 | Usado em citometria de fluxo para avaliação de identidade MSC. |
| Anticorpo anti-CD34 humano FITC | BioLegend | 343504 | Usado em citometria de fluxo para avaliação de identidade MSC. |
| Anticorpo anti-CD90 humano (Thy1) FITC | BioLegend | 328108 | Usado em citometria de fluxo para avaliação de identidade MSC. |
| Citometria de fluxo | Beckman Coulter | CytoFLEX | Usado para avaliação da identidade celular. |
| Analisador de células de fluorescência | Alit ciências da vida | Countstar Rigel S2 | Usado para contagem de células. A viabilidade celular pode ser calculada por coloração com corantes AO/PI. |
| Tampa de Parafuso do Conector Multiporta GL 45 com 2 portas | DWK life sciences | 292632806 | Marcas e números de catálogo são apenas, por exemplo, produtos semelhantes estão disponíveis em vários fornecedores e, desde que tenham a mesma funcionalidade, os itens podem ser substituídos por outras marcas. |
| Medidor de glicose | Sinocare | 6243578 | Usado para detectar a concentração de glicose no meio de cultura celular e sobrenadante. |
| Solução salina balanceada de Hank (HBSS), com cálcio e magnésio | Gibco | 14025092 | Usado para preparação de solução digestiva. |
| Albumina humana 20% Behring (HSA) | CSL Behring | N/A | Usado para a preparação do tampão de lavagem. |
| Microscópio fluorescente invertido | OLYMBUS | CKX53SF | Usado para observação e imagem de campo brifgt e fluorescente. |
| Cilindro de Medição Nalgene (500 mL) | Thermo Scientific | 3662-0500PK | Usado para calibrar a velocidade do volume de manuseio de líquidos de bombas peristálticas. |
| Soro de bezerro recém-nascido (NBS) superfino | MINHAI BIO | SC101.02 | Usado para cultivo de células Vero. |
| Kit de diferenciação e caracterização adipogênica de células-tronco mesenquimais humanas OriCell | Cyagen | HUXUC-90031 | Usado para diferenciação de três linhagens de hUCMSCs. |
| Kit de diferenciação e caracterização condrogênica de células-tronco mesenquimais humanas OriCell | Cyagen | HUXUC-90041 | Usado para diferenciação de três linhagens de hUCMSCs. |
| Kit de diferenciação e caracterização osteogênica de células-tronco mesenquimais humanas | OriCell Cyagen | HUXUC-90021 | Usado para diferenciação de três linhagens de hUCMSCs. |
| Anticorpo anti-CD105 humano PE | BioLegend | 800504 | Usado em citometria de fluxo para avaliação de identidade MSC. |
| Anticorpo anti-CD19 humano PE | BioLegend | 302208 | Usado em citometria de fluxo para avaliação de identidade MSC. |
| Anticorpo anti-CD73 humano PE (Ecto-5'-nucleotidase) | BioLegend | 344004 | Usado em citometria de fluxo para avaliação de identidade MSC. |
| Anticorpo anti-HLA-DR humano PE | BioLegend | 307605 | Usado em citometria de fluxo para avaliação de identidade MSC. |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS) | Wisent | 311-010-CL | Usado na autoclavagem de vasos de vidro e microtransportadores V01 e substituição de meio de cultura. |
| Tubulação de Silicone Sanitário Curada com Platina Sani-Tech (0.13 in x 0.25 in) | Saint-Gobain | ULTRA-C-125-2F | Usado para transferência de solução acionada por bombas peristálticas. |
| Solução salina estéril | Hopebiol | HBPP008-500 | Usado para preparação de tampão de lavagem. |
| Tripsina Recombinante Tripsina | BasalMedia | S342JV | Este reagente é usado para transferência de células HEK293T e Vero. |
| Seladora de Tubos | Yingqi Biotech | Seladora de Tubos I | Esta seladora é compatível com tubos C-Flex e tubos de PVC. |
| Soldador de tubo para tubos de PVC | Chu Biotech | Tube Welder Micro I | Usado para soldagem de tubos de PVC. |
| Soldador de tubo para tubo TPE | Soldador de tubo Yingqi Biotech | I-V2 | Usado para soldagem de tubos TPE. |
| ViaStain AO / PI Manchas de Viabilidade | Nexcelom | CS2-0106-25mL | A viabilidade de fluorescência dupla, usando laranja de acridina (AO) e iodeto de propídio (PI), é o método recomendado para análise precisa da viabilidade de células primárias, como PBMCs e células-tronco em amostras contendo detritos. |
Referências
- Golchin, A., Farahany, T. Z. Biological products: Cellular therapy and FDA approved products. Stem Cell Reviews and Reports. 15 (2), 166-175 (2019).
- Young, C. M., Quinn, C., Trusheim, M. R.
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Reimpressões e permissões
