Este protocolo envolve a transfecção de sensores cAMP e bPAC-nLuc, uma proteína optogenética, para rastrear com precisão sua distribuição celular e resposta à estimulação luminosa. A abordagem inovadora de criar um mapa de resposta cAMP usando um sistema de varredura de pontos tem o potencial de avançar na pesquisa com proteínas optogenéticas em diferentes campos.
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Artigo de método
Mapeando a distribuição celular de uma proteína optogenética usando uma grade de estimulação luminosa
Neste artigo
Resumo
Resumo
Nosso objetivo era rastrear com precisão a distribuição celular de uma proteína optogenética e avaliar sua funcionalidade dentro de um local citoplasmático específico. Para conseguir isso, co-transfectamos células com sensores cAMP direcionados a núcleos e nossa proteína optogenética desenvolvida em laboratório, adenilil ciclase-nanoluciferase fotoativável bacteriana (bPAC-nLuc). bPAC-nLuc, quando estimulado com substratos de luz ou luciferase de 445 nm, gera adenosina 3',5'-monofosfato cíclico (cAMP). Empregamos um iluminador a laser de estado sólido conectado a um sistema de varredura de pontos que nos permitiu criar um padrão de grade / matriz de pequenos pontos iluminados (~ 1 μm2) em todo o citoplasma das células HC-1. Ao fazer isso, fomos capazes de rastrear efetivamente a distribuição de bPAC-nLuc direcionado a energia nuclear e gerar um mapa abrangente de resposta cAMP. Este mapa representou com precisão a distribuição celular do bPAC-nLuc, e sua resposta à estimulação luminosa variou de acordo com a quantidade de proteína no ponto iluminado. Essa abordagem inovadora contribui para a expansão do kit de ferramentas de técnicas disponíveis para investigar proteínas optogenéticas celulares. A capacidade de mapear sua distribuição e resposta com alta precisão tem um potencial de longo alcance e pode avançar em vários campos de pesquisa.
Introdução
A optogenética, nascida como uma ferramenta que revolucionou as neurociências, é agora um campo de pesquisa crescente e uma tecnologia em ascensão usada rotineiramente por muitos laboratórios em todo o mundo e em várias áreas de pesquisa em biologia. Desenvolvemos o bPAC-nLuc, uma proteína optogenética versátil, fundindo uma adenilil ciclase (AC) sensível à luz de Beggiatoa sp. (adenilil ciclase fotoativável bacteriana; bPAC) para nanoluciferase (nLuc)1,2,3. Quando estimulado com luz azul, o bPAC produz o segundo mensageiro 3',5'-monofosfato de adenosina cíclico (cAMP). nLuc é uma pequena luciferase recentemente desenvolvida que, na presença de um de seus substratos, pode gerar bioluminescência e ativar a produção de cAMP4. Assim, esta proteína optogenética pode ser ativada transitoriamente usando pulsos de luz breves ou de forma constante com Furimazina ou outros substratos de luciferase, permitindo-nos imitar diferentes padrões de sinalização de cAMP e avaliar as respostas celulares (ativação de fatores de transcrição, expressão gênica, proliferação celular, migração, etc.). Avanços recentes na sinalização do2º mensageiro enfatizaram a importância dos eventos que ocorrem em regiões citosólicas muito restritas (por exemplo, produção endossômica de cAMP para fosforilação da proteína de ligação ao elemento de resposta do cAMP (CREB) ou microdomínios de Ca2+ para translocação do fator nuclear de células T ativadas (NFAT) para o núcleo)5,6. Portanto, é importante desenvolver estratégias consistentes e sistemáticas para avaliar, imitar e bloquear a sinalização desses compartimentos em células vivas. Para mostrar a capacidade do bPAC-nLuc de ser especificamente ativado em diferentes compartimentos celulares, co-transfectamos uma linha celular derivada do hepatoma (HC-1) com o bPAC-nLuc de alvo nuclear e H208, um sensor cAMP de transferência de energia de ressonância Förster (FRET) (NLS-bPAC-nLuc; NLS-H208). As células HC-1 derivadas da linha HTC são desprovidas de atividade CA analisável, o que resulta em níveis basais de cAMP muito baixos, tornando-o ideal para medir a produção putativa de cAMP enquanto aproveita toda a faixa dinâmica dos sensores FRET < sup class = "xref" > 7, < sup class = "xref" >8. Usando um laser de estado sólido (445 nm, LDI-7, 89 North) conectado a um sistema de varredura de pontos (UGA-42 Geo, Rapp OptoElectronic), descrevemos um protocolo para estimular sistematicamente áreas circulares ou manchas muito pequenas (~ 1 μm2) dentro de células individuais. O sistema de varredura de pontos foi conectado a uma das portas traseiras de um microscópio de dois decks, o que nos permitiu estimular células e realizar medições de FRET simultaneamente por meio de um caminho de luz independente. Apresentamos um método neste protocolo onde o software SysCon Geo, fornecido com o sistema de estimulação pela Rapp OptoElectronic, é empregado para realizar uma varredura abrangente do citoplasma das células. A abordagem envolve a geração de um mapa de resposta cAMP configurando uma sequência de iluminações que estimulam as células em um padrão de grade (Figura 1).
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Protocolo
1. Cultura de células HC-1 e preparação para imagem
- Manter as células HC-1 em DMEM suplementadas com 10% de soro fetal bovino (FBS), penicilina (100 UI/L), estreptomicina (100 mg/L) e L-glutamina em placas de 10 cm e incubadas a 37 °C, 5% de CO2, em ar umidificado a 95%.
- Passe as células a cada 2-4 dias, uma vez que as células estejam ~ 90% confluentes usando diluições 1:5 ou 1:10.
- Células-semente para transfecção em lamínulas de vidro 2 dias antes do experimento.
- Trabalhando em condições estéreis em uma coifa de cultura de tecidos com meio pré-aquecido e PBS, aspire o meio de uma placa quase confluente de células e lave suavemente com 5 mL de PBS.
- Aspire o PBS e adicione 1 mL de tripsina. Incubar a 37 °C durante 3-5 min até que as células se tenham desprendido.
- Ressuspenda as células em 4 mL de meio e transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mL.
- Use um hemocitômetro para contar o número de células e calcular a densidade celular.
- Dilua as células para uma densidade de 1,5 x 104 células / mL.
- Pipetar 2 ml da suspensão celular para lamínulas de vidro de 25 mm com revestimento de poli-D-lisina numa placa de 6 poços.
- Incubar as células por aproximadamente 24 h em incubadora até 70% de confluência.
- Transfectar as células usando um kit de transfecção seguindo as instruções do fabricante usando uma proporção de 0,25 μg de DNA NLS-bPAC-nLuc / 0,75 μg de DNA NLS-H208 por 3 μL de reagente de transfecção e 2 μL de reagente P3000 diluído em meio Opti-MEM sem vermelho de fenol.
- Coloque as células na incubadora por ~ 48 h para permitir a expressão suficiente de bPAC-nLuc, essencial para produzir níveis detectáveis de cAMP.
NOTA: O nível mínimo necessário de expressão de bPAC-nLuc varia de acordo com a potência do sistema de estimulação e os parâmetros da estimulação. - Prepare as células em lamínulas para imagens.
- Aspire o meio de um poço e lave duas vezes com 2 mL de PBS.
- Levante cuidadosamente a lamínula usando uma pinça e coloque-a na câmara de imagem.
- Adicione 1 mL de Opti-MEM sem vermelho de fenol à câmara de imagem. As células também podem ser visualizadas em HBSS ou qualquer outra solução fisiológica compatível com fluorescência.
2. Simulação de luz e imagens de células vivas
- Realize cultura celular e manipulação de células que expressam NLS-bPAC-nLuc em um ambiente escuro. Para evitar a exposição a comprimentos de onda <500 nm, use uma lâmpada vermelha de luz de segurança (Tabela de Materiais) com uma lâmpada de fluorescência compacta âmbar de 13 W (Tabela de Materiais).
- Realize experimentos em um microscópio motorizado de dois decks (Tabela de Materiais) equipado com um mecanismo de luz multi-LED de 6 linhas (Tabela de Materiais), uma roda de filtro de emissão (Tabela de Materiais), estágio XY (Tabela de Materiais), uma câmera CMOS digital ORCA-Fusion (Tabela de Materiais) e uma objetiva de óleo 100x/1.4 NA (∞/0.17/FN26.5). Capture imagens usando software de microscopia digital (Tabela de Materiais). Esta configuração é capaz de estimular células e realizar medições de FRET simultaneamente usando um caminho de luz independente fornecido com um filtro dicróico ZT458rdc (Tabela de Materiais).
NOTA: Qualquer configuração de aquisição pode ser usada se permitir estimulação optogenética simultânea e imagem FRET/intensiométrica com um sensor compatível. - Ligue o UGA - 42 Geosystem. Ligue o microscópio e configure-o com os parâmetros apropriados para adquirir com o sensor H208 FRET. A configuração de aquisição dependerá dos níveis de expressão do sensor FRET. Os parâmetros típicos são tempo de simulação de 40 ms para YFP/mScarletI, 15% de potência do LED e 0,5 Hz.
- Abra o software SysCon e o software de imagem que controla o microscópio.
- Na janela Câmera, selecione a guia Calibração e escolha o comprimento de onda do laser compatível com a proteína optogenética. Para estimular o bPAC-nLuc, use um comprimento de onda de 445 nm.
- Calibre o sistema antes de cada uso. Isso é importante porque pequenas variações na configuração, ou mesmo mudanças na temperatura ambiente (RT), podem alterar a precisão da estimulação.
- Na janela da câmera, selecione a guia Câmera e clique em para iniciar a aquisição a partir do software de imagem.
- Na janela do Visualizador de imagens, visualize uma aquisição ao vivo ou anterior da fluorescência das células retiradas do software de imagem, que guiará o posicionamento dos objetos de estimulação.
- Use o modo Clique e dispare para avaliar rapidamente a capacidade de resposta de uma célula individual antes de iniciar o experimento.
- Usando a janela Gerenciador de sequências, selecione para criar uma nova sequência.
NOTA: Para verificar a calibração adequada do sistema, desenhe várias formas e tamanhos na janela do Visualizador de imagens. Estes devem corresponder precisamente aos padrões de estimulação projetados nas células, garantindo um alinhamento preciso com o design pretendido. - Na janela Visualizador de imagens , selecione o ícone Redondo na barra de ferramentas à esquerda para desenhar objetos de estimulação circulares.
- Crie vários pequenos círculos idênticos e distribua-os uniformemente para garantir a cobertura homogênea de todo o citoplasma das células a serem estimuladas.
- Clique com o botão direito do mouse em cada um para verificar a homogeneidade dos objetos de estimulação circulares. Uma janela aparecerá; use-o para examinar seu raio, posição, etc.
- Defina o raio entre 1 e 5, dependendo da objetiva usada e do tamanho da célula.
- Para ajudar com o espaçamento uniforme e o alinhamento dos círculos, use o botão na subjanela Exibir. Além disso, defina as propriedades da grade usando o botão .
- Certifique-se de que a grade ou matriz de objetos de estimulação circular uniformemente espaçados cubra totalmente a célula e seu tamanho (por exemplo, 6 x 6 ou 10 x 10) seja determinado pelo tamanho da célula. Como controle para estimulação nula que não deve desencadear nenhum evento celular, inclua alguns círculos posicionados fora da célula.
- Cada objeto criado na janela Visualizador de imagens aparecerá na janela Linha do tempo.
- Na subjanela Tempo do objeto, configure as propriedades temporais de cada objeto de estimulação (hora de início, duração, atraso).
- Na subjanela Fonte de luz, configure o comprimento de onda e a intensidade de cada objeto. Para este protocolo, certifique-se de que cada objeto use o mesmo comprimento de onda e seja idêntico em duração e intensidade. A hora de início será diferente para cada objeto, e o atraso entre eles pode variar dependendo do resultado esperado para evitar a sobreposição do efeito de diferentes estímulos.
- Na janela Linha do tempo, altere a sequência na qual cada objeto de estimulação será ativado, se necessário. Configure as estimulações em um padrão regular (por exemplo, da esquerda para a direita, de cima para baixo) ou em um padrão aleatório, dependendo do experimento específico.
- Carregue a sequência no sistema e configure o número de ciclos de sequência (execuções) que o sistema executará.
- Coloque as regiões de interesse (ROIs) no software de imagem nas posições desejadas.
- Comece a adquirir imagens de fluorescência com o microscópio e pressione na janela UGA-42.
3. Análise dos dados
- Embora o software fornecido pelo sistema de estimulação permita salvar sequências para uso posterior, ele não registra as informações reais do experimento. Portanto, documente meticulosamente todos os detalhes relacionados aos pontos e sequências de estimulação empregados durante o experimento, incluindo parâmetros como posição, intensidade, duração, número de corridas, etc. Documentar quaisquer outras condições experimentais relevantes, tais como agentes farmacológicos ou soluções específicas.
- Durante o experimento, posicione as ROIs designadas no software de imagem para capturar as mudanças de intensidade de fluorescência de toda a célula ou locais específicos dentro das células.
- Preste atenção especial ao posicionamento das ROIs em relação aos pontos de estimulação. Meça as mudanças na intensidade da fluorescência dentro ou longe das áreas estimuladas. Ajuste as posições das ROIs pós-experimento, fornecendo o software de imagem para permitir salvar as imagens adquiridas durante o experimento e não apenas os valores de intensidade da ROI.
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Resultados
Os resultados apresentados na Figura 1 mostram que apenas estimulações direcionadas ao núcleo celular foram capazes de gerar aumentos mensuráveis de cAMP. Isso confirma que a NLS-bPAC-nLuc é expressa exclusivamente no compartimento nuclear das células HC-1. É possível estimular com precisão uma proteína optogenética utilizando esse padrão de grade/matriz para mapear sua distribuição intracelular. Além disso, os maiores aumentos de cAMP em direção ao centro do...
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Discussão
O objetivo deste estudo foi monitorar com precisão a distribuição intracelular de uma proteína optogenética e avaliar seu desempenho dentro de um determinado compartimento citoplasmático. Também mostramos as capacidades de estimulação precisas de um sistema de varredura pontual em células que expressam uma proteína optogenética. Para conseguir isso, empregamos um bPAC-nLuc de alvo nuclear com altos níveis de expressão, mas uma distribuição muito confinada limitada ao núcleo. Os resultados mostraram que pontos de estimula...
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Divulgações
Os autores declaram não haver interesse conflitante.
Agradecimentos
O financiamento foi fornecido pelos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) concede R01 GM099775 e GM130612 ao DLA
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Lâmpada de fluorescência compacta âmbar de 13 W - Luzes Azuis Baixas | Photonic Developments | ||
| 3-Isobutil-1-metilxantina (IBMX) | Sigma | I7018 | |
| 6-line multi-LED Lumencor Spectra X | Lumencor | Motor de luz multi-LED de 6 linhas | |
| Corning - DMEM | Thermo Fischer | MT10013CMEA | |
| Corning - Soro fetal bovino regular | Thermo Fischer | MT35011CV | |
| Óculos de cobertura: círculos | Thermo Fischer | 12545102P | |
| GBX-2 filtro de luz de segurança vermelho escuro 5.5" | Lâmpada de | luz de segurança Kodak 1416827 Red | |
| Solução salina balanceada Hanks' (HBSS) 10x | Thermo Fischer | 14185052 | Diluído para 1x, pH ajustado |
| LDI-7 | 89 North | ||
| L-Glutamina | Thermo Fischer | BW17605E | |
| Lipofectamine 3000 | de | transfecção | Thermo Fischer |
| Olympus IX83 motorizado dois decks microscópio | Microscópio motorizado de dois decks | Olympus | |
| Opti-MEM, sem vermelho fenol | Thermo Fischer | 11058021 | |
| ORCA-fusion câmera digital CMOS | Hamamatsu | C14440-20UP | |
| Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL) | Thermo Fischer | 15140122 | |
| Solução tamponada com fosfato (1x) | Lonza | 17516F | |
| Roda de filtro de emissão prévia e conjuntos de filtros | Prior Scientific, Inc. | Roda de filtro de emissão | |
| Prior Estágio Proscan XY | Prior Scientific, Inc. | Estágio XY | |
| Slidebook 6 | Inovações | Inteligentes Software de microscopia digital | |
| Software SysCon | SysCon | Software fornecido pelo sistema de estimulação | |
| UGA-42 Geo | Rapp OptoElectronic | ||
| UPlanSApo 100x | Olympus | 100x/1.4 NA (∞/0.17/FN26.5) | |
| ZT458rdc dicróico | Chroma Technology Corp | BS, Comprimento de onda (CWL): 498 nm |
Referências
- Naim, N., et al. Luminescence-activated nucleotide cyclase regulates spatial and temporal cAMP synthesis. The Journal of Biological Chemistry. 294 (4), 1095-1103 (2019).
- Naim, N., Reece, J. M., Zhang, X., Altschuler, D. L. Dual activation of cAMP production through photostimulation or chemical stimulation. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 2173, 201-216 (2020).
- Stierl, M., et al. Light modulation of cellular cAMP by a small bacterial photoactivated adenylyl cyclase, bPAC, of the soil bacterium Beggiatoa. The Journal of Biological Chemistry. 286 (2), 1181-1188 (2011).
- Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chemical Biology. 7 (11), 1848-1857 (2012).
- Liccardo, F., Luini, A., Di Martino, R. Endomembrane-based signaling by GPCRs and G-proteins. Cells. 11 (3), 528(2022).
- Groschner, K., Graier, W. F., Romanin, C. Store-operated ca(2)+ entry (SOCE) pathways. , Springer, Vienna. (2017).
- Ross, E. M., Howlett, A. C., Ferguson, K. M., Gilman, A. G. Reconstitution of hormone-sensitive adenylate cyclase activity with resolved components of the enzyme. The Journal of Biological Chemistry. 253 (18), 6401-6412 (1978).
- Insel, P. A., Maguire, M. E., Gilman, A. G., Bourne, H. R., Coffino, P., Melmon, K. L. Beta adrenergic receptors and adenylate cyclase: products of separate genes. Molecular Pharmacology. 12, 1062-1069 (1976).
- Pizzoni, A., Zhang, X., Naim, N., Altschuler, D. L. Soluble cyclase-mediated nuclear cAMP synthesis is sufficient for cell proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 120 (4), e2208749120(2023).
- Keravis, T., Lugnier, C. Cyclic nucleotide phosphodiesterase (PDE) isozymes as targets of the intracellular signalling network: benefits of PDE inhibitors in various diseases and perspectives for future therapeutic developments. British Journal of Pharmacology. 165 (5), 1288-1305 (2012).
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Reimpressões e permissões
