Mapeando a distribuição celular de uma proteína optogenética usando uma grade de estimulação luminosa

Summary

Este protocolo envolve a transfecção de sensores cAMP e bPAC-nLuc, uma proteína optogenética, para rastrear com precisão sua distribuição celular e resposta à estimulação luminosa. A abordagem inovadora de criar um mapa de resposta cAMP usando um sistema de varredura de pontos tem o potencial de avançar na pesquisa com proteínas optogenéticas em diferentes campos.

Abstract

Nosso objetivo era rastrear com precisão a distribuição celular de uma proteína optogenética e avaliar sua funcionalidade dentro de um local citoplasmático específico. Para conseguir isso, co-transfectamos células com sensores cAMP direcionados a núcleos e nossa proteína optogenética desenvolvida em laboratório, adenilil ciclase-nanoluciferase fotoativável bacteriana (bPAC-nLuc). bPAC-nLuc, quando estimulado com substratos de luz ou luciferase de 445 nm, gera adenosina 3',5'-monofosfato cíclico (cAMP). Empregamos um iluminador a laser de estado sólido conectado a um sistema de varredura de pontos que nos permitiu criar um padrão de grade / matriz de pequenos pontos iluminados (~ 1 μm²) em todo o citoplasma das células HC-1. Ao fazer isso, fomos capazes de rastrear efetivamente a distribuição de bPAC-nLuc direcionado a energia nuclear e gerar um mapa abrangente de resposta cAMP. Este mapa representou com precisão a distribuição celular do bPAC-nLuc, e sua resposta à estimulação luminosa variou de acordo com a quantidade de proteína no ponto iluminado. Essa abordagem inovadora contribui para a expansão do kit de ferramentas de técnicas disponíveis para investigar proteínas optogenéticas celulares. A capacidade de mapear sua distribuição e resposta com alta precisão tem um potencial de longo alcance e pode avançar em vários campos de pesquisa.

Introduction

A optogenética, nascida como uma ferramenta que revolucionou as neurociências, é agora um campo de pesquisa crescente e uma tecnologia em ascensão usada rotineiramente por muitos laboratórios em todo o mundo e em várias áreas de pesquisa em biologia. Desenvolvemos o bPAC-nLuc, uma proteína optogenética versátil, fundindo uma adenilil ciclase (AC) sensível à luz de Beggiatoa sp. (adenilil ciclase fotoativável bacteriana; bPAC) para nanoluciferase (nLuc)^1,2,3. Quando estimulado com luz azul, o bPAC produz o segundo mensageiro 3',5'-monofosfato de adenosina cíclico (cAMP). nLuc é uma pequena luciferase recentemente desenvolvida que, na presença de um de seus substratos, pode gerar bioluminescência e ativar a produção de cAMP⁴. Assim, esta proteína optogenética pode ser ativada transitoriamente usando pulsos de luz breves ou de forma constante com Furimazina ou outros substratos de luciferase, permitindo-nos imitar diferentes padrões de sinalização de cAMP e avaliar as respostas celulares (ativação de fatores de transcrição, expressão gênica, proliferação celular, migração, etc.). Avanços recentes na sinalização do^2º mensageiro enfatizaram a importância dos eventos que ocorrem em regiões citosólicas muito restritas (por exemplo, produção endossômica de cAMP para fosforilação da proteína de ligação ao elemento de resposta do cAMP (CREB) ou microdomínios de Ca²⁺ para translocação do fator nuclear de células T ativadas (NFAT) para o núcleo)^5,6. Portanto, é importante desenvolver estratégias consistentes e sistemáticas para avaliar, imitar e bloquear a sinalização desses compartimentos em células vivas. Para mostrar a capacidade do bPAC-nLuc de ser especificamente ativado em diferentes compartimentos celulares, co-transfectamos uma linha celular derivada do hepatoma (HC-1) com o bPAC-nLuc de alvo nuclear e H208, um sensor cAMP de transferência de energia de ressonância Förster (FRET) (NLS-bPAC-nLuc; NLS-H208). As células HC-1 derivadas da linha HTC são desprovidas de atividade CA analisável, o que resulta em níveis basais de cAMP muito baixos, tornando-o ideal para medir a produção putativa de cAMP enquanto aproveita toda a faixa dinâmica dos sensores FRET < sup class = "xref" > 7^, < sup class = "xref" >8. Usando um laser de estado sólido (445 nm, LDI-7, 89 North) conectado a um sistema de varredura de pontos (UGA-42 Geo, Rapp OptoElectronic), descrevemos um protocolo para estimular sistematicamente áreas circulares ou manchas muito pequenas (~ 1 μm²) dentro de células individuais. O sistema de varredura de pontos foi conectado a uma das portas traseiras de um microscópio de dois decks, o que nos permitiu estimular células e realizar medições de FRET simultaneamente por meio de um caminho de luz independente. Apresentamos um método neste protocolo onde o software SysCon Geo, fornecido com o sistema de estimulação pela Rapp OptoElectronic, é empregado para realizar uma varredura abrangente do citoplasma das células. A abordagem envolve a geração de um mapa de resposta cAMP configurando uma sequência de iluminações que estimulam as células em um padrão de grade (Figura 1).

Protocol

1. Cultura de células HC-1 e preparação para imagem

1. Manter as células HC-1 em DMEM suplementadas com 10% de soro fetal bovino (FBS), penicilina (100 UI/L), estreptomicina (100 mg/L) e L-glutamina em placas de 10 cm e incubadas a 37 °C, 5% de CO₂, em ar umidificado a 95%.
2. Passe as células a cada 2-4 dias, uma vez que as células estejam ~ 90% confluentes usando diluições 1:5 ou 1:10.
3. Células-semente para transfecção em lamínulas de vidro 2 dias antes do experimento.
   1. Trabalhando em condições estéreis em uma coifa de cultura de tecidos com meio pré-aquecido e PBS, aspire o meio de uma placa quase confluente de células e lave suavemente com 5 mL de PBS.
   2. Aspire o PBS e adicione 1 mL de tripsina. Incubar a 37 °C durante 3-5 min até que as células se tenham desprendido.
   3. Ressuspenda as células em 4 mL de meio e transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mL.
   4. Use um hemocitômetro para contar o número de células e calcular a densidade celular.
   5. Dilua as células para uma densidade de 1,5 x 10⁴ células / mL.
   6. Pipetar 2 ml da suspensão celular para lamínulas de vidro de 25 mm com revestimento de poli-D-lisina numa placa de 6 poços.
   7. Incubar as células por aproximadamente 24 h em incubadora até 70% de confluência.
4. Transfectar as células usando um kit de transfecção seguindo as instruções do fabricante usando uma proporção de 0,25 μg de DNA NLS-bPAC-nLuc / 0,75 μg de DNA NLS-H208 por 3 μL de reagente de transfecção e 2 μL de reagente P3000 diluído em meio Opti-MEM sem vermelho de fenol.
5. Coloque as células na incubadora por ~ 48 h para permitir a expressão suficiente de bPAC-nLuc, essencial para produzir níveis detectáveis de cAMP.
   NOTA: O nível mínimo necessário de expressão de bPAC-nLuc varia de acordo com a potência do sistema de estimulação e os parâmetros da estimulação.
6. Prepare as células em lamínulas para imagens.
   1. Aspire o meio de um poço e lave duas vezes com 2 mL de PBS.
   2. Levante cuidadosamente a lamínula usando uma pinça e coloque-a na câmara de imagem.
   3. Adicione 1 mL de Opti-MEM sem vermelho de fenol à câmara de imagem. As células também podem ser visualizadas em HBSS ou qualquer outra solução fisiológica compatível com fluorescência.

2. Simulação de luz e imagens de células vivas

1. Realize cultura celular e manipulação de células que expressam NLS-bPAC-nLuc em um ambiente escuro. Para evitar a exposição a comprimentos de onda <500 nm, use uma lâmpada vermelha de luz de segurança (Tabela de Materiais) com uma lâmpada de fluorescência compacta âmbar de 13 W (Tabela de Materiais).
2. Realize experimentos em um microscópio motorizado de dois decks (Tabela de Materiais) equipado com um mecanismo de luz multi-LED de 6 linhas (Tabela de Materiais), uma roda de filtro de emissão (Tabela de Materiais), estágio XY (Tabela de Materiais), uma câmera CMOS digital ORCA-Fusion (Tabela de Materiais) e uma objetiva de óleo 100x/1.4 NA (∞/0.17/FN26.5). Capture imagens usando software de microscopia digital (Tabela de Materiais). Esta configuração é capaz de estimular células e realizar medições de FRET simultaneamente usando um caminho de luz independente fornecido com um filtro dicróico ZT458rdc (Tabela de Materiais).
   NOTA: Qualquer configuração de aquisição pode ser usada se permitir estimulação optogenética simultânea e imagem FRET/intensiométrica com um sensor compatível.
3. Ligue o UGA - 42 Geosystem. Ligue o microscópio e configure-o com os parâmetros apropriados para adquirir com o sensor H208 FRET. A configuração de aquisição dependerá dos níveis de expressão do sensor FRET. Os parâmetros típicos são tempo de simulação de 40 ms para YFP/mScarletI, 15% de potência do LED e 0,5 Hz.
4. Abra o software SysCon e o software de imagem que controla o microscópio.
5. Na janela Câmera, selecione a guia Calibração e escolha o comprimento de onda do laser compatível com a proteína optogenética. Para estimular o bPAC-nLuc, use um comprimento de onda de 445 nm.
6. Calibre o sistema antes de cada uso. Isso é importante porque pequenas variações na configuração, ou mesmo mudanças na temperatura ambiente (RT), podem alterar a precisão da estimulação.
7. Na janela da câmera, selecione a guia Câmera e clique em para iniciar a aquisição a partir do software de imagem.
8. Na janela do Visualizador de imagens, visualize uma aquisição ao vivo ou anterior da fluorescência das células retiradas do software de imagem, que guiará o posicionamento dos objetos de estimulação.
9. Use o modo Clique e dispare para avaliar rapidamente a capacidade de resposta de uma célula individual antes de iniciar o experimento.
10. Usando a janela Gerenciador de sequências, selecione para criar uma nova sequência.
    NOTA: Para verificar a calibração adequada do sistema, desenhe várias formas e tamanhos na janela do Visualizador de imagens. Estes devem corresponder precisamente aos padrões de estimulação projetados nas células, garantindo um alinhamento preciso com o design pretendido.
11. Na janela Visualizador de imagens , selecione o ícone Redondo na barra de ferramentas à esquerda para desenhar objetos de estimulação circulares.
12. Crie vários pequenos círculos idênticos e distribua-os uniformemente para garantir a cobertura homogênea de todo o citoplasma das células a serem estimuladas.
13. Clique com o botão direito do mouse em cada um para verificar a homogeneidade dos objetos de estimulação circulares. Uma janela aparecerá; use-o para examinar seu raio, posição, etc.
14. Defina o raio entre 1 e 5, dependendo da objetiva usada e do tamanho da célula.
15. Para ajudar com o espaçamento uniforme e o alinhamento dos círculos, use o botão na subjanela Exibir. Além disso, defina as propriedades da grade usando o botão .
16. Certifique-se de que a grade ou matriz de objetos de estimulação circular uniformemente espaçados cubra totalmente a célula e seu tamanho (por exemplo, 6 x 6 ou 10 x 10) seja determinado pelo tamanho da célula. Como controle para estimulação nula que não deve desencadear nenhum evento celular, inclua alguns círculos posicionados fora da célula.
17. Cada objeto criado na janela Visualizador de imagens aparecerá na janela Linha do tempo.
    1. Na subjanela Tempo do objeto, configure as propriedades temporais de cada objeto de estimulação (hora de início, duração, atraso).
    2. Na subjanela Fonte de luz, configure o comprimento de onda e a intensidade de cada objeto. Para este protocolo, certifique-se de que cada objeto use o mesmo comprimento de onda e seja idêntico em duração e intensidade. A hora de início será diferente para cada objeto, e o atraso entre eles pode variar dependendo do resultado esperado para evitar a sobreposição do efeito de diferentes estímulos.
18. Na janela Linha do tempo, altere a sequência na qual cada objeto de estimulação será ativado, se necessário. Configure as estimulações em um padrão regular (por exemplo, da esquerda para a direita, de cima para baixo) ou em um padrão aleatório, dependendo do experimento específico.
19. Carregue a sequência no sistema e configure o número de ciclos de sequência (execuções) que o sistema executará.
20. Coloque as regiões de interesse (ROIs) no software de imagem nas posições desejadas.
21. Comece a adquirir imagens de fluorescência com o microscópio e pressione na janela UGA-42.

3. Análise dos dados

1. Embora o software fornecido pelo sistema de estimulação permita salvar sequências para uso posterior, ele não registra as informações reais do experimento. Portanto, documente meticulosamente todos os detalhes relacionados aos pontos e sequências de estimulação empregados durante o experimento, incluindo parâmetros como posição, intensidade, duração, número de corridas, etc. Documentar quaisquer outras condições experimentais relevantes, tais como agentes farmacológicos ou soluções específicas.
2. Durante o experimento, posicione as ROIs designadas no software de imagem para capturar as mudanças de intensidade de fluorescência de toda a célula ou locais específicos dentro das células.
3. Preste atenção especial ao posicionamento das ROIs em relação aos pontos de estimulação. Meça as mudanças na intensidade da fluorescência dentro ou longe das áreas estimuladas. Ajuste as posições das ROIs pós-experimento, fornecendo o software de imagem para permitir salvar as imagens adquiridas durante o experimento e não apenas os valores de intensidade da ROI.

Results

Os resultados apresentados em Figura 1 mostram que apenas estímulos direcionados ao núcleo celular foram capazes de gerar elevações mensuráveis do AMPc. Isso confirma que NLS-bPAC-nLuc é expresso exclusivamente no compartimento nuclear das células HC-1. É possível estimular com precisão uma proteína optogenética usando esse padrão de grade/matriz para mapear sua distribuição intracelular. Além disso, as elevações mais altas do cAMP em direção ao centro nuclear refletem a maior massa de bPAC-nLuc simulada por pontos centrais em comparação com as colocadas na periferia nuclear (Figura 1).

Figura 1: O protocolo de estimulação da grade e o mapa de resposta do cAMP. Estímulos sequenciais de luz azul (445 nm; intervalo de 30 s entre pulsos; trem de pulso: 50 ms, duração total de 500 ms, 10 Hz, 7% de potência do laser) em células HC-1 transfectadas com NLS-H208 (sensor cAMP) e NLS-bPAC-nLuc. O painel esquerdo exibe a fluorescência da proteína fluorescente amarela (YFP) do H208, que foi sobreposta aos pulsos de luz reais capturados pela câmera sCMOS representados em uma única imagem. Os traços à direita mostram aumentos transitórios de cAMP desencadeados pela estimulação NLS-bPAC-nLuc em cada ponto de estimulação. A fluorescência NLS-H208 subtraída por fundo foi medida usando uma única ROI cobrindo todo o núcleo, e as razões normalizadas (R / R0) foram calculadas. As respostas nas áreas externas (linhas 1 e 7, colunas A e G) foram negativas e não são mostradas. Bar = 3 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

O objetivo deste estudo foi monitorar com precisão a distribuição intracelular de uma proteína optogenética e avaliar seu desempenho dentro de um determinado compartimento citoplasmático. Também mostramos as capacidades de estimulação precisas de um sistema de varredura pontual em células que expressam uma proteína optogenética. Para conseguir isso, empregamos um bPAC-nLuc de alvo nuclear com altos níveis de expressão, mas uma distribuição muito confinada limitada ao núcleo. Os resultados mostraram que pontos de estimulação separados por apenas ~ 1 μm podem desencadear a produção de cAMP ou não, dependendo da distribuição celular da proteína optogenética; apenas estímulos direcionados ao núcleo foram capazes de elevar os níveis de AMPc. Neste protocolo, o objetivo não era gerar elevações localizadas de cAMP, mas sim mostrar que breves estímulos luminosos podem ser precisos o suficiente para ativar proteínas optogenéticas em áreas muito restritas da célula sem estimular as proteínas circundantes. No entanto, essa abordagem constitui um controle necessário para o estudo de outras proteínas optogenéticas com distribuições difusas e/ou a geração de elevações localizadas de AMPc. Isso pode ser alcançado variando os níveis de expressão da proteína optogenética, a intensidade e a frequência da estimulação, etc. Para medir com precisão esses sinais localizados, é crucial considerar cuidadosamente os parâmetros de aquisição e as características do sensor. Isso inclui selecionar posições e tamanhos de ROI apropriados, determinar a frequência de aquisição e escolher sensores FRET/intensiométricos com afinidade, intensidade, faixa dinâmica e constante de dissociação ideais.

Em um artigo publicado recentemente, usamos uma estratégia semelhante para demonstrar funcionalmente a distribuição de um bPAC-nLuc direcionado a núcleos e a capacidade de uma fosfodiesterase modificada (PDE; ΔRI-PDE8) de abolir elevações de cAMP em uma linhagem celular derivada da tireoide⁹. Neste artigo, conduzimos a estimulação celular ao longo de uma linha reta em vez de uma grade, e os pontos de iluminação foram colocados em relação aos pontos de referência celulares (por exemplo, centro nuclear, borda nuclear, etc.) em vez de em um padrão sistemático. Notavelmente, mesmo os estímulos direcionados à borda nuclear foram insuficientes para desencadear uma resposta detectável do cAMP. Raciocinamos que isso provavelmente se devia ao estímulo de uma massa insuficiente de NLS-bPAC-nLuc⁹. No entanto, no presente protocolo, alguns estímulos direcionados para a vizinhança da borda nuclear provocaram um aumento detectável do AMPc. Essa discrepância pode ser atribuída a vários fatores, incluindo os níveis de expressão do bPAC-nLuc, as características da estimulação, a morfologia do núcleo, a presença de EDPs endógenas, proteínas tampão, etc.

Embora outras proteínas optogenéticas direcionadas ou não direcionadas possam exibir distribuições mais difusas, essa abordagem sistemática apóia a obtenção de conclusões significativas, estabelecendo cuidadosamente experimentos e analisando os dados. Além disso, essa abordagem permite direcionar estruturas celulares especializadas (por exemplo, lamellipodia, dendritos, cílios primários, etc.), facilitando comparações entre as respostas nas regiões distal e proximal dessas estruturas e/ou do corpo celular.

Essa estratégia também pode ser usada para avaliar a ativação de elementos a jusante na via do AMPc, como a proteína quinase A (PKA) ou a proteína de troca diretamente ativada pelo AMPc (EPAC1). Além disso, como o bPAC-nLuc não é influenciado pelos mesmos moduladores que os ACs endógenos, que podem ser afetados por interações locais com proteínas ou outros fatores, pode-se supor que ele gere consistentemente a mesma quantidade de cAMP dado o mesmo nível de expressão. Ao examinar a redução das elevações do cAMP ou a diminuição dos níveis de cAMP após um aumento temporário, essa abordagem permite a avaliação da degradação do cAMP, difusão ou funcionalidade e distribuição de EDPs endógenas ou transfectadas. Essa estratégia se mostra particularmente útil para avaliar o comportamento de qualquer proteína optogenética em diferentes locais celulares, ajudando a evitar o viés de colocar arbitrariamente pontos de estimulação dentro do citoplasma.

É importante levar em consideração que o tamanho do ponto de estimulação e sua energia dependerão, em última análise, das características particulares da configuração utilizada (caminhos de luz, objetivas, sistema de varredura, etc.). Para garantir resultados precisos, a expressão relativa da proteína optogenética, a sensibilidade das células ao comprimento de onda usado e quaisquer outros parâmetros devem ser levados em consideração ao conduzir cada experimento em cada sistema específico. Também é essencial observar que não estudamos até que ponto o sistema pode ser conduzido na implementação de pontos de estimulação menores e / ou grades mais densas (ou seja, pontos de estimulação menos espaçados) para avaliar sistematicamente estruturas celulares menores com maior precisão. Além disso, testamos essa estratégia usando apenas o sistema de varredura de ponto geográfico UGA-42. Essa abordagem pode ser possível usando diferentes sistemas, desde que possam gerar pontos localizados uniformemente espaçados de forma reprodutível. Cada sistema deve ser otimizado para produzir resultados semelhantes.

Finalmente, a estimulação potencial dos sensores FRET pelo sistema de estimulação deve ser cuidadosamente avaliada. Por exemplo, a proteína fluorescente ciano (CFP) certamente será estimulada ou mesmo branqueada pelo laser de 445 nm usado neste protocolo. O uso de potências de laser mais altas (ou filtros de densidade neutra (ND) de maior transmitância) aumentará as chances de estimular os sensores fluorescentes e, introduzir informações falsas ao experimento e/ou gerar problemas com a análise dos dados. O fotobranqueamento normal dos sensores FRET/intensiométricos também deve ser cuidadosamente avaliado. Finalmente, uma vez que o bPAC pode ser sensível à luz ambiente e gerar cAMP mesmo em condições escuras (a atividade escura do bPAC foi medida como 33 ± 5 pmol/min/mg de proteína³), as células devem ser cuidadosamente manipuladas após a transfecção do bPAC-nLUC para evitar contaminação por luz (por exemplo, na incubadora, antes e/ou durante os experimentos, etc.). Opcionalmente, as células podem ser incubadas com um inibidor de PDE (por exemplo, 3-isobutil-1-metilxantina; IBMX¹⁰) para determinar a atividade de linha de base do bPAC-nLuc e confirmar se as condições de iluminação usadas são apropriadamente escuras.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lâmpada de fluorescência compacta âmbar de 13 W - Luzes Azuis Baixas	Photonic Developments
3-Isobutil-1-metilxantina (IBMX)	Sigma	I7018
6-line multi-LED Lumencor Spectra X	Lumencor		Motor de luz multi-LED de 6 linhas
Corning - DMEM	Thermo Fischer	MT10013CMEA
Corning - Soro fetal bovino regular	Thermo Fischer	MT35011CV
Óculos de cobertura: círculos	Thermo Fischer	12545102P
GBX-2 filtro de luz de segurança vermelho escuro 5.5"	Lâmpada de		luz de segurança Kodak 1416827 Red
Solução salina balanceada Hanks' (HBSS) 10x	Thermo Fischer	14185052	Diluído para 1x, pH ajustado
LDI-7	89 North
L-Glutamina	Thermo Fischer	BW17605E
Lipofectamine 3000	de	transfecção	Thermo Fischer
Olympus IX83 motorizado  dois decks  microscópio	Microscópio motorizado de dois decks	Olympus
Opti-MEM, sem vermelho fenol	Thermo Fischer	11058021
ORCA-fusion câmera digital CMOS	Hamamatsu	C14440-20UP
Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL)	Thermo Fischer	15140122
Solução tamponada com fosfato (1x)	Lonza	17516F
Roda de filtro de emissão prévia e conjuntos de filtros	Prior Scientific, Inc.		Roda de filtro de emissão
Prior  Estágio Proscan XY	Prior Scientific, Inc.		Estágio XY
Slidebook 6	Inovações		Inteligentes Software de microscopia digital
Software SysCon	SysCon		Software fornecido pelo sistema de estimulação
UGA-42  Geo	Rapp OptoElectronic
UPlanSApo 100x	Olympus		100x/1.4 NA (∞/0.17/FN26.5)
ZT458rdc dicróico	Chroma Technology Corp		BS, Comprimento de onda (CWL):  498 nm