Imunofluorescência Dupla de γH2AX e 53BP1 em Linfócitos Periféricos Humanos

Resumo

Este protocolo apresenta um método para avaliar a formação e o reparo de quebras de dupla fita de DNA através da detecção simultânea de focos de γH2AX e 53BP1 em núcleos interfásicos de linfócitos periféricos humanos tratados com bleomicina.

Resumo

As quebras de fita dupla (DSBs) são uma das lesões mais graves que podem ocorrer nos núcleos celulares e, se não reparadas, podem levar a desfechos graves, incluindo câncer. A célula é, portanto, provida de mecanismos complexos para reparar DSBs, e essas vias envolvem histona H2AX em sua forma fosforilada em Ser-139 (ou seja, γH2AX) e proteína ligadora de p53 1 (53BP1). Como ambas as proteínas podem formar focos nos sítios dos DSBs, a identificação desses marcadores é considerada um método adequado para estudar tanto os DSBs quanto sua cinética de reparo. De acordo com os processos moleculares que levam à formação dos focos γH2AX e 53BP1, poderia ser mais útil investigar sua co-localização perto dos DSBs, a fim de estabelecer uma abordagem alternativa que permita quantificar os DSBs pela detecção simultânea de dois marcadores de dano ao DNA. Assim, este protocolo tem como objetivo avaliar o dano genômico induzido em linfócitos humanos pelo agente radiomimético bleomicina através da presença de focos γH2AX e 53BP1 em imunofluorescência dupla. Usando essa metodologia, também delineamos a variação no número de focos γH2AX e 53BP1 ao longo do tempo, como uma tentativa preliminar de estudar a cinética de reparo de DSBs induzidos por bleomicina.

Introdução

O dano ao DNA é continuamente induzido por agentes que podem ser endógenos, como as EROs geradas pelo metabolismo oxidativo celular, ou exógenos, tanto químicos quanto físicos¹. Dentre as lesões mais lesivas, as quebras de dupla fita (DSBs) têm papel fundamental na contribuição para a instabilidade genômica, uma vez que causam aberrações cromossômicas que, por sua vez, podem iniciar o processo de carcinogênese. Assim, as células são providas de mecanismos complexos e eficientes de reparo de^{DSBs 2}.

Quando ocorre um DSB, a célula desencadeia a resposta de dano ao DNA (DDR) onde, juntamente com o complexo MRE11/RAD50/NBS1, as quinases ATM ou ATR são recrutadas para ativar outras proteínas que retardam ou interrompem o ciclo celular³. Um alvo essencial dessas quinases é a histona H2AX, que é fosforilada em Ser-139 dentro de algumas megabases dos DSBs (ou seja, γH2AX), permitindo assim o recrutamento de vários fatores de reparo, tais como, entre outros, BRCA1 e proteína ligadora de p53 1 (53BP1)³. Posteriormente, uma via entre recombinação homóloga (HR), junção final não homóloga (NHEJ) ou recozimento de fita simples (SSA) é acionada para reparar os DSBs ^4,5. Portanto, o 53BP1 está envolvido em ditar a escolha entre FC ou EJNH, promovendo principalmente a ativação do NHEJ ao invés da FC⁶. Além disso, tanto a forma fosforilada da histona H2AX quanto a 53BP1 podem formar focos nos sítios dos DSBs. Como esses focos persistem até que a integridade da dupla fita seja restaurada, avaliar o aparecimento/desaparecimento dos focos γH2AX ou 53BP1 em um intervalo de tempo é considerado um método útil para avaliar a ocorrência e o reparo de DSBs em um sistema celular ^6,7. No entanto, de acordo com os processos moleculares descritos acima, uma vez que se espera que os focos de γH2AX e 53BP1 co-localizem próximos aos DSBs durante a^DDR8,9, pode ser útil detectar concomitantemente a presença desses marcadores em uma imunofluorescência dupla.

Assim, o objetivo deste artigo foi avaliar a adequação da quantificação simultânea dos focos γH2AX e 53BP1 para avaliar o dano genômico induzido em linfócitos periféricos humanos pelo agente radiomimético bleomicina. Usando a mesma metodologia, também tentamos delinear a cinética de reparo de DSBs induzidos por bleomicina de acordo com um procedimento experimental previamente estabelecido¹⁰.

Protocolo

O estudo foi aprovado pelo comitê de ética da Universidade de Pisa, e consentimento informado e assinado foi obtido de cada doador.

1. Formação dos focos γH2AX e 53BP1

1. Preparação de amostras e tratamento mutagénico
   1. Coletar amostras de sangue total por punção venosa de indivíduos adultos saudáveis em tubos de coleta de sangue (por exemplo, Vacutainer) contendo heparina de lítio como anticoagulante.
   2. Para garantir a preservação adequada da amostra de sangue, inicie o procedimento em até 24 h após a amostragem.
   3. Adicionar 300 μL da amostra a um tubo contendo 4,7 mL de meio completo (penicilina-estreptomicina a 0,5%, fitohemaglutinina a 0,75%, SFB a 10% previamente inativado, RPMI 1640 a 88,75%).
   4. Em seguida, adicione sulfato de bleomicina a uma concentração final de 5 μg/mL.
      CUIDADO: O sulfato de bleomicina é um agente mutagênico. Evite o contato com a pele e a inalação. Prepare a solução e adicione a amostra sob um capuz.
   5. Para cada amostra, estabelecer um controlo negativo (ausência de agente mutagénico).
   6. Colocar o tubo num termóstato a 37 °C durante 2 horas.
2. Fixação
   1. Centrifugar amostras a 540 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
   2. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet com vórtice.
   3. Adicionar 5 mL de solução hipotônica (2,87 g de KCl dissolvido em 500 mL de água deionizada) e 400 μL de solução pré-fixadora (ácido acético 5:3: metanol) para causar hemólise das hemácias.
   4. Centrifugar amostras a 540 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
   5. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 5 mL de metanol à temperatura ambiente por pelo menos 30 min para fixar as células.
   6. Em alternativa, conservar as células a -20 °C até à utilização.
3. Preparação de slides
   1. Centrifugar amostras a 540 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
   2. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 5 mL de uma solução de metanol: ácido acético 3:1. Repita essas etapas mais uma vez.
   3. No final, centrifugar novamente a solução a 540 x g durante 5 minutos à temperatura ambiente.
   4. Aspirar novamente o sobrenadante deixando solução suficiente (0,5 mL) para ressuspender o pellet, pipetar vigorosamente, soltar o pellet de célula ressuspensa nas lâminas e secar ao ar. Conservar as lâminas a 4 °C.
4. Imunofluorescência
   NOTA: A imunofluorescência é um método imunológico para identificar alvos celulares específicos usando um anticorpo primário que se liga ao próprio alvo e um anticorpo secundário fluorescente que se liga ao primário que permite localizar o alvo¹¹. Neste caso, um anti-53BP1 monoclonal de camundongo (1:50) e um anti-γH2AX policlonal de coelho (1:50) são usados como anticorpos primários, enquanto AlexaFluor568 anti-camundongo (1:400) e DyLight488 anti-coelho (1:200) são usados como anticorpos secundários, respectivamente.
   1. Lavar as lâminas duas vezes em 50 mL de PBS 1x por 5 min em frasco couplin (16 lâminas consecutivas).
   2. Em seguida, mantê-los por 30 min em solução de bloqueio (10 mL de FBS, 10 mL de PBS 10x, 80 mL de água deionizada, 300 μL de Triton-X).
   3. Adicionar a cada lâmina 10 μL de cada uma das duas soluções contendo os anticorpos primários dissolvidos na solução de bloqueio. Cubra as lâminas com fita adesiva de parafina e incube a 4 °C durante a noite.
   4. Após a incubação, realizar três lavagens em PBS 1x por 5 min.
   5. Adicionar a cada lâmina 10 μL de cada uma das duas soluções contendo os anticorpos secundários dissolvidos na solução de bloqueio. Cobrir as lâminas com fita parafínica e incubar à temperatura ambiente durante 2 h.
   6. Realize três lavagens em 1x PBS por 5 min.
   7. Adicionar 2,5 μL de solução antifade com DAPI nas lamínulas antes da montagem para contramanchar os núcleos.
      NOTA: Para avaliar a cinética dos focos, o procedimento é o mesmo descrito de 1,1 a 1,4, observando que a coleta de células e a imunofluorescência dupla são realizadas em 0 h, após 2 h pós-tratamento com bleomicina e depois, após a remoção do mutagênio, em 4 h, 6 h e 24 h pós-tratamento.

2. Análise através de microscópio de fluorescência

NOTA: "Microscópio de fluorescência" refere-se a qualquer microscópio que usa fluorescência para gerar uma imagem. O espécime é iluminado com luz de um comprimento de onda específico (ou comprimentos de onda) que é absorvida pelos fluoróforos, fazendo com que eles emitam luz de comprimentos de onda mais longos¹². AlexaFluor568 e DyLight 488 absorvem luz de aproximadamente 568 e 488 nm e emitem luz de 603 e 520 nm, respectivamente. Assim, eles são visíveis como fluorescência vermelha ou verde usando um filtro TRITC ou FITC, respectivamente.

1. Pontuar a presença de focos em cada lâmina sob uma objetiva de imersão de 100x (Figura 1).
2. Escore 200 núcleos por lâmina e conte o número de focos γH2AX/53BP1 em cada núcleo.
3. Resultados expressos em termos do número médio de focos por núcleo total pontuado. Estes incluem núcleos γH2AX/53BP1 positivos (mostrando pelo menos um sinal de fluorescência) e negativos (não mostrando nenhum sinal de fluorescência).

Resultados

Os dados obtidos pela análise em microscópio de fluorescência de linfócitos periféricos permitem avaliar três aspectos principais: a eficácia do tratamento com bleomicina em aumentar o número de focos γH2AX e 53BP1 (e, portanto, de DSBs) devido ao seu efeito mutagênico, em que medida ambos os focos co-localizados no local dos DSBs e o tempo-curso dos focos γH2AX e 53BP1 para delinear a cinética de reparo de DSBs induzidos por bleomicina. Como esperado, uma frequência muito maior de focos γH2AX e 53BP1 foi observada entre...

Discussão

A análise por imunofluorescência dos focos γH2AX e 53BP1 é um método adequado para avaliar danos genômicos em núcleos interfásicos de um sistema celular. Esse procedimento possui vários pontos críticos que podem afetar o resultado dos experimentos, principalmente, os agentes utilizados na fixação e permeabilização, o tipo de anticorpos e seus fatores de diluição, e a concentração do mutagênico.

A manutenção da integridade proteica é fundamental, uma vez que o método de imunofluorescência esper...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
AlexaFluor 568 cabra anti-rato IgG (γ 1)	Invitrogen	A21124	53BP1 anticorpo secundário
Bleoprim	Sanofi		bleomicina sulfato (mutagênico)
Solução de penicilina-estreptomicina 100X	Euroclone	ECB3001D	antibióticos para meio
de cultura PBS 10X	Termofisher	14200075	solução salina tamponada com fosfato
FBS	Euroclone	EC20180L	Soro Fetal Bovino para imunofluorescência
IgG anti-coelho de cabra (H+L) DyLight 488 Coniugated	Termofisher	#35552	γ Anticorpo secundário H2AX
Anticorpo monoclonal de camundongo anti-53BP1	Merck	MAB 3802	53BP1 anticorpo primário
Labophot 2	Nikon		Microscópio de fluorescência
P-histona H2AX (Ser139) anticorpo de coelho	Sinalização celular	#2577	&gama; Anticorpo primário H2AX
Fitohemoaglutinina	Termofisher R30852801		componente do meio de cultura
Prolongue o reagente antidesbotamento de ouro com DAPI	Cell Signaling	#8961	Solução antidesbotamento com DAPI para contracoloração
RPMI 1640	Euroclone	ECB9006L	Meio de cultura
Triton-X100	Sigma	T9284	Detergente não iônico para permeabilização