Este artigo relata a construção de células knockout da proteína E associada a centrômeros (CENP-E) usando o sistema CRISPR/Cas9 e três estratégias de triagem baseadas em fenótipos. Utilizamos a linhagem celular knockout do CENP-E para estabelecer uma nova abordagem para validar a especificidade e toxicidade dos inibidores do CENP-E, o que é útil para o desenvolvimento de fármacos e pesquisa biológica.
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Artigo de método
Geração de Linhagens Celulares Knockout da Proteína Associada ao Centrômero-E CENP-E-/- utilizando o Sistema CRISPR/Cas9
Neste artigo
Resumo
Resumo
O sistema CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 emergiu como uma ferramenta poderosa para edição precisa e eficiente de genes em uma variedade de organismos. A proteína-E associada ao centrômero (CENC-E) é uma cinesina direcionada a mais necessária para a captura de microtúbulos cinetócoros, alinhamento cromossômico e ponto de verificação de montagem do fuso. Embora as funções celulares das proteínas CENP-E tenham sido bem estudadas, tem sido difícil estudar as funções diretas das proteínas CENP-E usando protocolos tradicionais, porque a ablação CENP-E geralmente leva à ativação do ponto de verificação da montagem do fuso, parada do ciclo celular e morte celular. Neste estudo, nós nocauteamos completamente o gene CENP-E em células HeLa humanas e geramos com sucesso as células CENP-E-/- HeLa usando o sistema CRISPR/Cas9.
Três estratégias otimizadas de triagem baseadas em fenótipos foram estabelecidas, incluindo triagem de colônias celulares, fenótipos de alinhamento cromossômico e intensidades fluorescentes das proteínas CENP-E, que efetivamente melhoram a eficiência de triagem e a taxa de sucesso experimental das células knockout do CENP-E . É importante ressaltar que a deleção CENP-E resulta em desalinhamento cromossômico, localização anormal das proteínas serina/treonina quinase B (BubR1) do ponto de verificação mitótico BUB1 e defeitos mitóticos. Além disso, utilizamos o modelo de células HeLa nocaute do CENP-E para desenvolver um método de identificação de inibidores específicos do CENP-E.
Neste estudo, uma abordagem útil para validar a especificidade e toxicidade dos inibidores do CENP-E foi estabelecida. Além disso, este trabalho apresenta os protocolos de edição gênica do CENP-E utilizando o sistema CRISPR/Cas9, que pode ser uma ferramenta poderosa para investigar os mecanismos do CENP-E na divisão celular. Além disso, a linhagem celular knockout do CENP-E contribuiria para a descoberta e validação dos inibidores do CENP-E, que têm implicações importantes para o desenvolvimento de drogas antitumorais, estudos de mecanismos de divisão celular em biologia celular e aplicações clínicas.
Introdução
A edição do genoma projetado medeia as modificações direcionadas de genes em uma variedade de células e organismos. Em eucariotos, a mutagênese sítio-específica pode ser introduzida pela aplicação de nucleases seqüenciais-específicas que estimulam a recombinação homóloga do DNA-alvo1. Nos últimos anos, várias tecnologias de edição do genoma, incluindo nucleases de dedo de zinco (ZFNs)2,3, nucleases efetoras do tipo ativador de transcrição (TALENs)4,5 e meganucleaseshoming6,7
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Protocolo
1. Construção dos vetores knockout do gene CRISPR/Cas9
- Selecione a sequência de DNA genômico alvo no gene CENP-E humano (GenBank Accession No. NM_001286734.2) e projetar o sgRNA usando uma ferramenta de projeto CRISPR on-line (http://crispor.tefor.net/).
- Insira uma única sequência genômica, selecione o genoma de "Homo sapiens-human-UCSC Dec 2013 (conjunto de análise hg38) + polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs): dbSNP148", e selecione o motivo adjacente do protoespaçador "20 bp-NGG-spCas9". Escolha duas sequências guia, incluindo sgRNA-1, 5'-CGGCCGCACTCGCACGCAGA-3' e sgRNA-2 5'-TTCTTTAGAGACGCGGGCTC-3', de acor....
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Resultados
As células CENP-E-/- HeLa foram geradas com sucesso utilizando o sistema CRISPR/Cas9 (Figura 1). A linha do tempo e as etapas experimentais críticas desse método são mostradas na Figura 1. Primeiro, projetamos e sintetizamos os sgRNAs específicos do CENP-E, recoteamos e ligamos os sgRNAs no plasmídeo pX458, transfectamos o plasmídeo em células HeLa e os cultivamos por 48 h. As células transfectadas foram dissociadas e semeadas em pla.......
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Discussão
A cinesina-7 CENP-E é um regulador chave no alinhamento cromossômico e no ponto de verificação da montagem do fuso durante a divisão celular 17,19,20. A deleção genética do CENP-E geralmente resulta na ativação do ponto de verificação da montagem do fuso, parada do ciclo celular e morte celular 27,29,51,52.<.......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Agradecimentos
Agradecemos a todos os membros do Laboratório de Citoesqueleto da Fujian Medical University pelas discussões úteis. Agradecemos a Jun-Jin Lin, Zhi-Hong Huang, Ling Lin, Li-Li Pang, Lin-Ying Zhou, Xi Lin e Min-Xia Wu no Centro de Serviços de Tecnologia Pública da Fujian Medical University por sua assistência técnica. Agradecemos a Si-Yi Zheng, Ying Lin e Qi Ke do Centro de Ensino Experimental de Ciências Médicas Básicas da Fujian Medical University por seu apoio. Este estudo foi apoiado pelas seguintes bolsas: Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (número de bolsa 82001608 e 82101678), Fundação de Ciências Naturais da Província de Fujian, China (número de bol....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,25% Tripsina-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| tubo de centrífuga de 1,5 mL | Axygen | MCT-150-C | |
| Placa de 24 poços | Corning | 3524 | |
| 4S Gelred, 10.000x em água | Sangon Biotech (Xangai) | A616697 | |
| Tubo de centrífuga de 50 mL | Corning | 430828 | |
| placa de Petri de 6 cm | Corning | ||
| Reagente Químico Sinopharm | de 95% de etanol | 10009164 | |
| placa de 96 poços | Corning | 3599 | |
| Ácido acético | O Reagente Químico Sinopharm | 10000218 | Dissolver em H2O para preparar uma solução de trabalho a 10%. |
| Agarose | Sangon Biotech (Shanghai | )A620014 | |
| Alexa Fluor 488-marcado Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Beyotime | A0428 | Para imunofluorescência. Dissolva em 1% BSA / PBST. Diluição 1:500. |
| Alexa Fluor 488-marcado com Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) | Beyotime | A0423 | Para imunofluorescência. Dissolva em 1% BSA / PBST. Diluição 1:500. |
| Alexa Fluor 555-marcado Donkey Anti-Mouse IgG(H+L) | Beyotime | A0460 | Para imunofluorescência. Dissolva em 1% BSA / PBST. Diluição 1:500. |
| Etanol anidro | Sinopharm Reagente químico | 100092690 | |
| Anti-BubR1 anticorpo monoclonal de coelho | Abcam | ab254326 | para imunofluorescência. Dissolva em 1% BSA / PBST. Diluição 1:100 |
| Anticorpo monoclonal de camundongo anti-CENP-B | Santa Cruz Biotechnology | sc-376392 | Para imunofluorescência. Dissolva em 1% BSA / PBST. Diluição 1:50. |
| Anticorpo monoclonal de coelho anti-CENP-E | Abcam | ab133583 | Para imunofluorescência. Dissolva em 1% BSA / PBST. Diluição 1:100. |
| Meio de montagem anti-desbotamento | Beyotime | P0131 | Retardando a extinção de sinais fluorescentes. |
| Anticorpo monoclonal de camundongo anti-&alfa;-tubulina | Abcam | ab7291 | Para imunofluorescência. Dissolva em 1% BSA / PBST. Diluição 1:100. |
| Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer | Biotek Instruments Biotek Epoch | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sinopharm Chemical Reagent | 69003435 | |
| BpiI (BbsI) | Thermo Fisher Scientific | ER1011 | |
| CellTiter 96 ensaio aquoso de proliferação de células de uma solução | Promega | G3580 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424BK745380 | |
| Colchicine | Sinopharm Reagente Químico | 61001563 | |
| Microscópio de varredura confocal | Leica | Leica TCS SP8 | |
| Coverslip CITOTEST | 80344-1220 | ||
| DAPI | Beyotime | C1006 | |
| DH5 α células competentes | Sangon Biotech (Shanghai) | B528413 | |
| Marcador de DNA DL2000 | TaKaRa | 3427A | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | |
Mini kit de plasmídeo livre de Endo-free  | Omega | D6950 | |
| Ezup Coluna Animal Kit de Purificação de DNA Genômico | Sangon Biotech (Xangai | )B518251 | |
| Soro bovino fetal | Zhejiang Tianhang Biotechnology | 11011-8611 | |
| Reagente Químico Sinopharm | de genciana | 71019944 | Dissolva em PBS para preparar 0,1% de violeta de genciana / PBS. |
| Solução de coloração Giemsa | Sinopharm Reagente Químico | 71020260 | |
| GraphPad Prisma versão 8.0 software | GraphPad | www.graphpad.com | Análise estatística. |
| GSK923295 | Linha celular MedChemExpress | HY-10299 | |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| Incubadora umidificada | Heal Force | HF90 / HF240 | |
| Image J software | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | Processamento e análise de imagens. |
| Microscópio invertido | Nanjing Jiangnan Novel Optics | XD-202 | |
| LB pó de ágar | Sangon Biotech (Shanghai) | A507003 | |
| Reagente de transfecção Lipo6000 | Beyotime | C0526 | |
| Microscópio Nikon Ti-S2 | Nikon | Ti-S2 | |
| Opti-MEM reduzido soro meio | Gibco | 31985070 | |
| Paraformaldeído | Sinopharm Reagente Químico | 80096618 | Dissolva em PBS para preparar 4% de paraformaldeído / PBS. |
| Solução de penicilina-estreptomicina | HyClone | SV30010 | |
| kit de extração de gel de DNA de coluna SanPrep | Sangon Biotech (Shanghai) | B518131 | |
| SanPrep coluna plasmídeo mini-preparações kit | Sangon Biotech (Shanghai) | B518191 | |
| T4 DNA ligase | TaKaRa | 2011A | |
| T4 polinucleotídeo quinase | TaKaRa | 2021A | |
| TaKaRa Ex Taq | TaKaRa | RR001A | |
| Triton X-100 | Sinopharm Reagente Químico | 30188928 | Dissolver em PBS para preparar 0,25% Triton X-100/PBS. |
| Tween 20 | Sinopharm Reagente Químico | 30189328 | Dissolver em PBS para preparar 0,1% Tween 20 / PBS. |
Referências
- Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F., Marraffini, L. A. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology. 31 (3), 233-239 (2013).
- Bibikova, M., Beumer, K., Trautman, J. K., Carroll, D. Enhancing gene targeting with designed zinc finger nucleases.<....
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Reimpressões e permissões
