Method Article

Geração de Linhagens Celulares Knockout da Proteína Associada ao Centrômero-E CENP-E-/- utilizando o Sistema CRISPR/Cas9

DOI:

10.3791/65476

⸱

June 23rd, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Genetics, The School of Basic Medical Sciences, Fujian Medical University, 2Key Laboratory of Stem Cell Engineering and Regenerative Medicine, Fujian Province University, 3College of Clinical Medicine for Obstetrics & Gynecology and Pediatrics, Fujian Medical University, 4Medical Research Center, Fujian Maternity and Child Health Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artigo relata a construção de células knockout da proteína E associada a centrômeros (CENP-E) usando o sistema CRISPR/Cas9 e três estratégias de triagem baseadas em fenótipos. Utilizamos a linhagem celular knockout do CENP-E para estabelecer uma nova abordagem para validar a especificidade e toxicidade dos inibidores do CENP-E, o que é útil para o desenvolvimento de fármacos e pesquisa biológica.

Abstract

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O sistema CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 emergiu como uma ferramenta poderosa para edição precisa e eficiente de genes em uma variedade de organismos. A proteína-E associada ao centrômero (CENC-E) é uma cinesina direcionada a mais necessária para a captura de microtúbulos cinetócoros, alinhamento cromossômico e ponto de verificação de montagem do fuso. Embora as funções celulares das proteínas CENP-E tenham sido bem estudadas, tem sido difícil estudar as funções diretas das proteínas CENP-E usando protocolos tradicionais, porque a ablação CENP-E geralmente leva à ativação do ponto de verificação da montagem do fuso, parada do ciclo celular e morte celular. Neste estudo, nós nocauteamos completamente o gene CENP-E em células HeLa humanas e geramos com sucesso as células CENP-E-/- HeLa usando o sistema CRISPR/Cas9.

Três estratégias otimizadas de triagem baseadas em fenótipos foram estabelecidas, incluindo triagem de colônias celulares, fenótipos de alinhamento cromossômico e intensidades fluorescentes das proteínas CENP-E, que efetivamente melhoram a eficiência de triagem e a taxa de sucesso experimental das células knockout do CENP-E . É importante ressaltar que a deleção CENP-E resulta em desalinhamento cromossômico, localização anormal das proteínas serina/treonina quinase B (BubR1) do ponto de verificação mitótico BUB1 e defeitos mitóticos. Além disso, utilizamos o modelo de células HeLa nocaute do CENP-E para desenvolver um método de identificação de inibidores específicos do CENP-E.

Neste estudo, uma abordagem útil para validar a especificidade e toxicidade dos inibidores do CENP-E foi estabelecida. Além disso, este trabalho apresenta os protocolos de edição gênica do CENP-E utilizando o sistema CRISPR/Cas9, que pode ser uma ferramenta poderosa para investigar os mecanismos do CENP-E na divisão celular. Além disso, a linhagem celular knockout do CENP-E contribuiria para a descoberta e validação dos inibidores do CENP-E, que têm implicações importantes para o desenvolvimento de drogas antitumorais, estudos de mecanismos de divisão celular em biologia celular e aplicações clínicas.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A edição do genoma projetado medeia as modificações direcionadas de genes em uma variedade de células e organismos. Em eucariotos, a mutagênese sítio-específica pode ser introduzida pela aplicação de nucleases seqüenciais-específicas que estimulam a recombinação homóloga do DNA-alvo1. Nos últimos anos, várias tecnologias de edição do genoma, incluindo nucleases de dedo de zinco (ZFNs)2,3, nucleases efetoras do tipo ativador de transcrição (TALENs)4,5 e meganucleaseshoming6,7, foram projetadas para clivar genomas em locais específicos, mas essas abordagens requerem engenharia proteica complexa e procedimentos experimentais redundantes. Estudos têm demonstrado que o sistema CRISPR/Cas (CRISPR) é uma eficiente tecnologia de edição gênica, que medeia especificamente a clivagem de DNA sítio-específica guiada por RNA em uma ampla variedade de células e espécies8,9,10,11. A tecnologia de nocaute genético CRISPR/Cas9 revolucionou os campos da biologia básica, biotecnologia e medicina12.

As bactérias e a maioria das arqueias desenvolveram um sistema imune adaptativo baseado em RNA que usa as proteínas CRISPR e Cas para identificar e destruir vírus e plasmídeos13. Streptococcus pyogenes A endonuclease Cas9 (SpCas9) contém a resolvease da junção de Holliday semelhante a RuvC (RuvC) e o domínio His-Asn-His (HNH), que pode mediar eficientemente quebras de fita dupla (DSBs) específicas de sequência, fornecendo um RNA guia único sintético (sgRNA) contendo RNAs CRISPR (crRNA) e crRNA transativador (tracrRNA)14,15,16. Os DSBs podem ser reparados através da via de junção final não homóloga (NHEJ) ou reparo dirigido por homologia (HDR), que introduz múltiplas mutações, incluindo inserções, deleções ou substituições de nucleotídeos únicos sem cicatriz, em células de mamíferos 1,8. Tanto o NHEJ propenso a erros quanto a via HDR de alta fidelidade podem ser usados para mediar o knockout gênico por meio de inserções ou deleções, o que pode causar mutações frameshift e códons de parada prematura10.

A cinesina-7 CENP-E é necessária para a fixação do cinetocore-microtúbulo e alinhamento cromossômico durante a divisão celular 17,18,19. A microinjeção de anticorpos20,21, a depleção de siRNA22,23, a inibição química 24,25,26 e a deleção genética 27,28,29 do CENP-E levam ao desalinhamento cromossômico, à ativação do ponto de verificação da montagem do fuso e a defeitos mitóticos, o que resulta em aneuploidias e instabilidade cromossômica19,30. Em camundongos, a deleção CENP-E resulta em desenvolvimento anormal e letalidade embrionária nos estágios mais precoces do desenvolvimento 27,29,31. A deleção genética do CENP-E geralmente leva ao desalinhamento cromossômico e morte celular 26,27,29, o que é um obstáculo no estudo das funções e mecanismos das proteínas do CENP-E.

Um estudo recente estabeleceu uma linhagem celular knockout condicional CENP-E usando um método de edição genética CRISPR/Cas9 induzível por auxina-32, que permite a rápida degradação das proteínas CENP-E em um tempo relativamente curto33. No entanto, até o momento, linhagens celulares knockout estáveis do CENP-E não foram estabelecidas, o que é um desafio técnico não resolvido na biologia do CENP-E. Considerando a robustez genética34, as respostas de compensação genética 35,36,37 e ambientes intracelulares complexos, uma vez que as consequências diretas da deleção completa do CENP-E podem ser complexas e imprevisíveis, é importante estabelecer linhagens celulares knockout do CENP-E para a investigação de mecanismos de alinhamento cromossômico, ponto de verificação de montagem do fuso e vias de sinalização a jusante.

A descoberta e a aplicação dos inibidores do CENP-E são importantes para o tratamento do câncer. Até o momento, sete tipos de inibidores do CENP-E foram encontrados e sintetizados, incluindo GSK923295 e seus derivados24,25, PF-277138,39, imidazo[1,2-a]piridínico40,41, composto A42,43, sintalina44,45, UA6278446 e derivados benzo[d]pirrolo[2,1-b]tiazol47. Dentre esses inibidores, o GSK923295 é um inibidor alostérico e eficiente do CENP-E que se liga ao domínio motor do CENP-E e inibe a atividade da ATPase estimulada por microtúbulos do CENP-E com Ki de 3,2 ± 0,2 nM24,25. No entanto, comparados com os efeitos inibitórios da GSK923295 em células cancerosas cultivadas, os efeitos terapêuticos da GSK923295 em pacientes clínicos com câncernão são ideais48,49, o que também levantou preocupações sobre a especificidade da GSK923295 para o CENP-E. Além disso, a especificidade e os efeitos colaterais de outros inibidores do CENP-E sobre as proteínas do CENP-E são questões fundamentais na pesquisa do câncer.

Neste estudo, nocauteamos completamente o gene CENP-E em células HeLa usando o sistema CRISPR/Cas9. Três estratégias otimizadas de triagem baseadas em fenótipos foram estabelecidas, incluindo triagem de colônias celulares, fenótipos de alinhamento cromossômico e intensidades fluorescentes das proteínas CENP-E, para melhorar a eficiência de triagem e a taxa de sucesso da edição do gene CENP-E. Além disso, linhagens celulares knockout do CENP-E podem ser usadas para testar a especificidade de compostos candidatos para o CENP-E.

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Protocol

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1. Construção dos vetores knockout do gene CRISPR/Cas9

  1. Selecione a sequência de DNA genômico alvo no gene CENP-E humano (GenBank Accession No. NM_001286734.2) e projetar o sgRNA usando uma ferramenta de projeto CRISPR on-line (http://crispor.tefor.net/).
  2. Insira uma única sequência genômica, selecione o genoma de "Homo sapiens-human-UCSC Dec 2013 (conjunto de análise hg38) + polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs): dbSNP148", e selecione o motivo adjacente do protoespaçador "20 bp-NGG-spCas9". Escolha duas sequências guia, incluindo sgRNA-1, 5'-CGGCCGCACTCGCACGCAGA-3' e sgRNA-2 5'-TTCTTTAGAGACGCGGGCTC-3', de acordo com os escores de especificidade50, a eficiência prevista10 e os off-targets mínimos.
  3. Ordenar e sintetizar os oligonucleotídeos de DNA de fita simples (ssODNs). Diluir os ssODNs em ddH2O até uma concentração final de 100 μM. Para fosforilar e recozer os oligos de sgRNA, adicionar 1 μL de oligo anterior, 1 μL de oligo reverso, 0,5 μL de polinucleotídeo quinase T4, 1 μL de tampão polinucleotídeo quinase T4 e 6,5 μL de água livre de RNase em um tubo de reação em cadeia da polimerase (PCR) e incubar o tubo a 37 °C por 30 min, 95 °C por 5 min; em seguida, reduza para 25 °C a 5 °C min-1.
  4. Digerir o plasmídeo pX458 usando a enzima de restrição Bbsfigure-protocol-1 . Adicionar 1 μg do plasmídeo pX458, 2 μL de tampão 10x G, 1 μL de Bbsfigure-protocol-2 e adicionar ddH2O livre de RNase a 20 μL em um tubo centrífugo de 1,5 mL. Incubar o tubo a 37 °C durante 2 h. Em seguida, purificar o plasmídeo linear usando o kit de extração em gel de DNA em coluna de acordo com os protocolos do fabricante.
  5. Ligate os oligos de sgRNA no plasmídeo pX458 (plasmídeo pSpCas9(BB)-2A-green fluorescent protein (GFP), Addgene ID. 48138). Adicionar 1 μL dos oligonucleotídeos recozidos, 25 ng do plasmídeo linear, 1 μL de tampão de ligação de DNA 10x T4, 0,5 μL de DNA ligase T4 (350 U/μL) e perfazer até 10 μL com ddH2O em um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Incubar a solução de ligadura a 16 °C durante 2 horas.
  6. Incubar 10 μL do plasmídeo construído com as células DH5α competentes no gelo por 30 min, choque térmico a 42 °C por 45 s e colocá-los imediatamente no gelo por 5 min. Adicionar 500 μL de meio Luria-Bertani (LB) e semear as células em uma placa LB contendo ampicilina (100 μg/mL). Incubar a 37 °C por 16 h e triar os clones resistentes.
  7. Selecionar 5-10 colônias únicas com ponta de pipeta esterilizada e transferi-las para uma cultura de 1 mL de meio LB com ampicilina (100 μg/mL). Incubar a cultura a 37 °C e agitá-la a 180 rpm por 12-16 h.
  8. Isolar o DNA plasmidial usando um kit de extração de plasmídios de acordo com os protocolos do fabricante. Validar o DNA plasmidial de cada colônia por sequenciamento de Sanger do sítio promotor U6 usando o primer U6-Fwd 5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC-3'.
  9. Extrair e purificar os plasmídeos usando o kit de DNA plasmidial endo-livre de acordo com os protocolos do fabricante.

2. Transfecção, isolamento e triagem das células HeLa nocaute do CENP-E

  1. Cultura de células HeLa em meio de Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina/estreptomicina em estufa umidificada a 37 °C com 5% de CO2.
  2. Incubar as células HeLa usando tripsina a 0,25%/ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) a 37 °C por 2-3 min, dissociar as células por pipetagem suave e, em seguida, semear as células em novas placas na proporção de diluição de 1:4 para passagem celular.
  3. Semeando as células em uma placa de 12 poços e cultivando até 60-70% de confluência antes da transfecção. Transfectar os plasmídeos pX458-sgRNA em células HeLa usando os reagentes referenciados de acordo com os protocolos do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
    1. Misturar suavemente 1 μg de plasmídeo pX458-sgRNA validado e 50 μL de meio de soro reduzido no tubo A. Em seguida, misture suavemente 2 μL do reagente de transfecção e 50 μL de meio de soro reduzido no tubo B. Incube os tubos A e B separadamente à temperatura ambiente por 5 min.
    2. Misture suavemente o tubo A e o tubo B e incube à temperatura ambiente durante 5 minutos. Adicione a mistura a uma placa de 12 poços, incube as células por 6 h e substitua o meio por um meio DMEM fresco.
  4. Examinar células HeLa após 24 h ou 48 h usando um microscópio de fluorescência para eficiência da transfecção. Após a transfecção por 48 h, dissociar completamente as células HeLa transfectadas usando tripsina/EDTA a 0,25% a 37 °C por 3-5 min, contar o número de células usando uma câmara de Neubauer ou um contador de células automatizado e plaquear as células em três placas separadas de 96 poços para cada população transfectada de acordo com métodos de diluição seriados10.
  5. Retorne as células para uma incubadora umidificada e depois cultive-as por mais 1-2 semanas. Troque o meio de cultura uma vez a cada 3 dias. Para a triagem baseada no fenótipo e validação do knockout do CENP-E , dissociar e expandir as células em placas de 24 ou 12 poços por 5-7 dias.
  6. Triagem das células mutantes com menores diâmetros de colônia celular usando um microscópio invertido equipado com objetivas de 10x e 20x.
    NOTA: As mutações do CENP-E geralmente resultam em um aumento significativo no número de células em divisão nas colônias celulares, o que pode ser um dos indicadores-chave para a triagem das células mutantes do CENP-E .
  7. Colheita das células para extração de DNA utilizando o kit de extração de DNA genômico animal em coluna de acordo com os protocolos do fabricante. Definir as reações de PCR da seguinte forma: 0,25 μL de Taq polimerase, 5 μL de tampão 10x (Mg2+ plus), 4 μL de misturas de dNTP, 500 ng de molde de DNA, 1 μL de oligo para frente, 1 μL de oligo reverso e ajustar ddH2O para 50 μL. Use as seguintes configurações de programa de PCR para amplificação de genes: 98 °C, 10 s; 98 °C, 10 s, 55 °C, 30 s, 72 °C, 60 s durante 33 ciclos; 72 °C, 10 min, e depois segure a 4 °C.
    NOTA: Os primers específicos para clonagem do locus alvo estão listados da seguinte forma: CENP-E alvo F1, 5'-GAGGGTCCTGGCCATTTTCCTG-3'; CENP-E alvo R1, 5'-AGATCTCCGATCCTCCCCTCTC-3'; CENP-E alvo F2, 5'-TGGTAACTGCATTTTGGTGTTCTAC-3'; CENP-E alvo R2, 5'-CCTGTTGCAACGTGAGGGAAG-3'.
  8. Ligate o DNA alvo no vetor pMD18-T de acordo com os protocolos do fabricante. Transfectar o plasmídeo ligado em células DH5α competentes e cultura para seleção de clones.
  9. Execute o sequenciamento de Sanger para determinar os tipos de nocaute CENP-E . Isolar o DNA plasmidial usando um kit de extração de plasmídios de acordo com os protocolos do fabricante. Realizar o sequenciamento de Sanger do DNA plasmidial de cada colônia utilizando os primers M13 forward e reverse. Primer M13F, 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'; Primer M13R, 5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3'.
  10. Semear as células HeLa mutantes do tipo selvagem e do CENP-E em lamínulas de vidro de 12 mm em uma placa de 24 poços, respectivamente. Remover o meio DMEM completo e fixar as células em solução fixadora de paraformaldeído/solução salina tamponada com fosfato (PBS) a 4% à temperatura ambiente por 10 min.
  11. Manchar os núcleos com a solução de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) à temperatura ambiente durante 5 min. Selecionar e validar as células mutantes do CENP-E com base no fenótipo de alinhamento cromossômico usando um microscópio de fluorescência equipado com uma objetiva Plan Fluor 40x/ Abertura Numérica (NA) 0,75.
  12. Selecionar e validar as células knockout CENP-E utilizando a coloração e análise por imunofluorescência (ver secção 3) das proteínas CENP-E.

3. Coloração por imunofluorescência e microscopia confocal de alta resolução

  1. Fixar as células com solução fixadora de paraformaldeído/PBS a 4% à temperatura ambiente durante 10 min e imergir durante 2 x 5 min em 1x PBS.
    NOTA: Certifique-se de que as células estão em condições saudáveis e as células são coletadas e fixadas suavemente para evitar o descolamento celular metafásico.
  2. Permeabilizar as células com Triton X-100/PBS a 0,25% à temperatura ambiente por 10 min e mergulhá-las em 1x PBS por 2 x 5 min.
  3. Bloquear as células com BSA/PBST a 1% (0,1% Tween 20 em PBS) à temperatura ambiente durante 1 h. Diluir os anticorpos primários com BSA/PBST a 1% e incubar as amostras a 4 °C durante 12 horas.
  4. Eliminar as soluções de anticorpos primários, lavar as células 3 x 5 min com 1x PBS e incubar as células com anticorpos secundários diluídos à temperatura ambiente durante 2 h.
  5. Descarte os anticorpos secundários e lave as células em 1x PBS por 3 x 5 min.
  6. Manchar os núcleos com DAPI à temperatura ambiente por 5 min. Monte as corrediças com o meio de montagem. Sele as lâminas com esmalte.
  7. Observar e registrar as imagens de fluorescência utilizando um microscópio confocal de varredura equipado com objetiva 63x/NA 1,40.

4. Preparação cromossômica e análise cariotípica

  1. Cultivar células selvagens e CENP-E-/- HeLa em meio DMEM completo suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina/estreptomicina por 24 h e, em seguida, incubar as células selvagens e CENP-E-/- HeLa com colchicina 300 nM por 5 h.
  2. Incubar as células com tripsina/EDTA a 0,25% a 37 °C por 3 min e coletar as células em tubos de centrífuga de 1,5 mL.
  3. Centrifugar as células a 1.000 × g por 5 min à temperatura ambiente, descartar os sobrenadantes, adicionar 1,2 mL de solução de KCl 0,075 mol/L e incubar a 37 °C por 20 min.
  4. Centrifugar as células a 1.000 × g por 5 min à temperatura ambiente, descartar os sobrenadantes, adicionar 0,2 mL da solução fixadora (metanol: ácido acético glacial = 3:1) para prefixação e misturar suavemente por 1 min.
  5. Centrifugar as células a 1.000 × g por 5 min à temperatura ambiente, coletar os pellets, adicionar 1,5 mL da solução fixadora à temperatura ambiente por 10 min e, em seguida, centrifugar a 1.000 × g por 5 min à temperatura ambiente.
  6. Descarte os sobrenadantes, adicione 0,6 mL das soluções fixadoras e prepare uma suspensão celular. Adicione 3-5 gotas das suspensões celulares de uma altura de 35-40 cm nas lâminas de gelo.
    NOTA: Mantenha a altura para liberar as suspensões celulares nas lâminas em 35-40 cm; caso contrário, os cromossomos podem estar muito dispersos ou não separados uns dos outros.
  7. Secar imediatamente as lâminas com lâmpada de álcool, corar as amostras com solução corante de Giemsa a 10% por 7 min, enxaguar as lâminas com água corrente por 2 min e observar as amostras com microscópio de luz equipado com objetiva Plan Fluor 40x/NA 0,75.

5. Ensaio de formação de colônias celulares

  1. Preparar as suspensões celulares nas placas de 6 poços a uma densidade celular de 1.000-2.000 células/poço. Agite suavemente as placas para distribuir uniformemente as células.
  2. Coloque as placas de 6 poços em uma incubadora de CO2 e incube por 2-3 semanas a 37 °C com 5% de CO2. Troque o meio de cultura uma vez a cada 5 dias. Gravar as imagens utilizando microscópio invertido equipado com objetivas de 10x e 20x. Colher as células quando as colônias são visíveis (centenas de células dentro de um clone).
  3. Para estudar os efeitos da GSK923295, cultivar as células nas placas de 6 poços por 24 h e adicionar 2 mL de GSK923295 nas concentrações finais de 10, 25, 50, 100 e 200 nM.
    NOTA: Não mova a placa de cultura no estágio inicial da formação do clone para evitar a eliminação de células, que podem formar novos clones e afetar a triagem das células transfectadas.
  4. Descarte o meio de cultura e fixe as células com PFA 1% em temperatura ambiente por 10 min. Manchar as colônias com solução corante violeta de cristal a 0,1% à temperatura ambiente por 15 min. Enxaguar as amostras com 1x PBS três vezes. Registre as imagens das colônias celulares e quantifique os diâmetros de cada colônia usando o software ImageJ. Escolha a ferramenta Seleção de linha reta , clique em Analisar, escolha Medir e registre o comprimento.
  5. Enxaguar as colônias com 1 mL de solução de ácido acético a 10% por 5 min. Transferir 200 μL das soluções sobrenadantes em uma placa de 96 poços e medir os valores de absorbância usando um espectrofotômetro de microplacas a A600 nm.

6. Ensaio de viabilidade celular

  1. Semeando as células nas placas de 24 poços e cultivando-as por 48 h a 80-90% de densidade.
  2. Incubar as células com 100 μL de tripsina/EDTA a 0,25% a 37 °C por 3 min.
  3. Misture 400 μL de PBS com as células com uma pistola de pipeta. Transfira 100 μL das suspensões celulares para a placa de 96 poços.
  4. Adicionar 20 μL de solução de MTS em cada poço com uma concentração final de 317 μg/mL e misturar suavemente de acordo com os protocolos do fabricante. Incubar as amostras a 37 °C durante 1-3 h numa incubadora de CO2 .
  5. Registar os valores de absorbância de cada poço no pico de absorbância de A490 nm utilizando um espectrofotómetro de microplacas. Use um comprimento de onda de referência de A630 nm para subtrair o fundo contribuído por detritos celulares e absorbância inespecífica (Viabilidade celular = A490nm- A630 nm).

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Results

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As células CENP-E-/- HeLa foram geradas com sucesso utilizando o sistema CRISPR/Cas9 (Figura 1). A linha do tempo e as etapas experimentais críticas desse método são mostradas na Figura 1. Primeiro, projetamos e sintetizamos os sgRNAs específicos do CENP-E, recoteamos e ligamos os sgRNAs no plasmídeo pX458, transfectamos o plasmídeo em células HeLa e os cultivamos por 48 h. As células transfectadas foram dissociadas e semeadas em pla...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A cinesina-7 CENP-E é um regulador chave no alinhamento cromossômico e no ponto de verificação da montagem do fuso durante a divisão celular 17,19,20. A deleção genética do CENP-E geralmente resulta na ativação do ponto de verificação da montagem do fuso, parada do ciclo celular e morte celular 27,29,51,52.<...

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Disclosures

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Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a todos os membros do Laboratório de Citoesqueleto da Fujian Medical University pelas discussões úteis. Agradecemos a Jun-Jin Lin, Zhi-Hong Huang, Ling Lin, Li-Li Pang, Lin-Ying Zhou, Xi Lin e Min-Xia Wu no Centro de Serviços de Tecnologia Pública da Fujian Medical University por sua assistência técnica. Agradecemos a Si-Yi Zheng, Ying Lin e Qi Ke do Centro de Ensino Experimental de Ciências Médicas Básicas da Fujian Medical University por seu apoio. Este estudo foi apoiado pelas seguintes bolsas: Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (número de bolsa 82001608 e 82101678), Fundação de Ciências Naturais da Província de Fujian, China (número de bolsa 2019J05071), os Fundos Conjuntos para a Inovação da Ciência e Tecnologia, a Província de Fujian, China (número de bolsa 2021Y9160) e o projeto de financiamento de iniciação científica de talentos de alto nível da Universidade de Medicina de Fujian (número de bolsa XRCZX2017025).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,25% Tripsina-EDTAGibco25200056
tubo de centrífuga de 1,5 mLAxygenMCT-150-C
Placa de 24 poçosCorning3524
4S Gelred, 10.000x em águaSangon Biotech (Xangai)A616697
Tubo de centrífuga de 50 mLCorning430828
placa de Petri de 6 cmCorning
Reagente Químico Sinopharmde 95% de etanol10009164
placa de 96 poçosCorning3599
Ácido acéticoO Reagente Químico Sinopharm10000218Dissolver em H2O para preparar uma solução de trabalho a 10%.
AgaroseSangon Biotech (Shanghai)A620014
Alexa Fluor 488-marcado Goat Anti-Mouse IgG(H+L)BeyotimeA0428Para imunofluorescência. Dissolva em 1% BSA / PBST. Diluição 1:500.
Alexa Fluor 488-marcado com Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)BeyotimeA0423Para imunofluorescência. Dissolva em 1% BSA / PBST. Diluição 1:500.
Alexa Fluor 555-marcado Donkey Anti-Mouse IgG(H+L)BeyotimeA0460Para imunofluorescência. Dissolva em 1% BSA / PBST. Diluição 1:500.
Etanol anidroSinopharm Reagente químico100092690
Anti-BubR1 anticorpo monoclonal de coelhoAbcamab254326para imunofluorescência. Dissolva em 1% BSA / PBST. Diluição 1:100 
Anticorpo monoclonal de camundongo anti-CENP-BSanta Cruz Biotechnologysc-376392Para imunofluorescência. Dissolva em 1% BSA / PBST. Diluição 1:50.
Anticorpo monoclonal de coelho anti-CENP-EAbcamab133583Para imunofluorescência. Dissolva em 1% BSA / PBST. Diluição 1:100.
Meio de montagem anti-desbotamentoBeyotimeP0131Retardando a extinção de sinais fluorescentes.
Anticorpo monoclonal de camundongo anti-&alfa;-tubulinaAbcamab7291Para imunofluorescência. Dissolva em 1% BSA / PBST. Diluição 1:100.
Biotek Epoch Microplate SpectrophotometerBiotek Instruments Biotek Epoch
Bovine Serum Albumin (BSA)Sinopharm Chemical Reagent69003435
BpiI (BbsI)Thermo Fisher ScientificER1011
CellTiter 96 ensaio aquoso de proliferação de células de uma soluçãoPromegaG3580
CentrifugeEppendorf5424BK745380
ColchicineSinopharm Reagente Químico61001563
Microscópio de varredura confocalLeicaLeica TCS SP8
Coverslip CITOTEST80344-1220
DAPIBeyotimeC1006
DH5 α células competentesSangon Biotech (Shanghai)B528413
Marcador de DNA DL2000TaKaRa3427A
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)GibcoC11995500BT
Mini kit de plasmídeo livre de Endo-free figure-materials-1OmegaD6950
Ezup Coluna Animal Kit de Purificação de DNA GenômicoSangon Biotech (Xangai)B518251
Soro bovino fetalZhejiang Tianhang Biotechnology11011-8611
Reagente Químico Sinopharmde genciana71019944Dissolva em PBS para preparar 0,1% de violeta de genciana / PBS.
Solução de coloração GiemsaSinopharm Reagente Químico71020260
GraphPad Prisma versão 8.0 softwareGraphPadwww.graphpad.comAnálise estatística.
GSK923295Linha celular MedChemExpressHY-10299
HeLaATCCCCL-2
Incubadora umidificadaHeal ForceHF90 / HF240
Image J softwareNational Institutes of Healthhttps://imagej.nih.gov/ij/Processamento e análise de imagens.
Microscópio invertidoNanjing Jiangnan Novel OpticsXD-202
LB pó de ágarSangon Biotech (Shanghai)A507003
Reagente de transfecção Lipo6000BeyotimeC0526
Microscópio Nikon Ti-S2NikonTi-S2
Opti-MEM  reduzido  soro  meioGibco31985070
ParaformaldeídoSinopharm Reagente Químico80096618Dissolva em PBS para preparar 4% de paraformaldeído / PBS.
Solução de penicilina-estreptomicinaHyCloneSV30010
kit de extração de gel de DNA de coluna SanPrepSangon Biotech (Shanghai)B518131
SanPrep  coluna  plasmídeo  mini-preparações  kitSangon Biotech (Shanghai)B518191
T4 DNA ligaseTaKaRa2011A
T4 polinucleotídeo quinaseTaKaRa2021A
TaKaRa Ex TaqTaKaRaRR001A
Triton X-100Sinopharm Reagente Químico30188928Dissolver em PBS para preparar 0,25% Triton X-100/PBS.
Tween 20Sinopharm Reagente Químico30189328Dissolver em PBS para preparar 0,1% Tween 20 / PBS.
430166 violeta

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