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Artigo de método

Desenvolvimento de Compêndio para Carcinoma de Células Escamosas de Esôfago

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DOI:

10.3791/65480

⸱

12 de abril de 2024

 , 
1Amity Centre of Nanotechnology, Amity University Haryana, 2Amity Stem Cell Institute, Amity Medical School, Amity University Haryana, 3Clinical Biosamples & Research Services (CBRS)

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve uma ferramenta útil para identificar alterações moleculares significativas no câncer e leva ao desenvolvimento de novas abordagens diagnósticas e terapêuticas para o carcinoma de células escamosas do esôfago.

Resumo

O câncer de esôfago (CE) é a8ª malignidade mais agressiva, e seu tratamento continua desafiador devido à falta de biomarcadores que facilitem a detecção precoce. A CE se manifesta em duas formas histológicas principais - adenocarcinoma (EAD) e carcinoma de células escamosas (ESCC) - ambas exibindo variações na incidência em populações geograficamente distintas. As tecnologias de alto rendimento estão transformando a compreensão de doenças, incluindo o câncer. Um desafio significativo para a comunidade científica é lidar com dados dispersos na literatura. Para resolver isso, um pipeline simples é proposto para a análise de conjuntos de dados de microarray disponíveis publicamente e a coleta de moléculas reguladas diferencialmente entre câncer e condições normais. O pipeline pode servir como uma abordagem padrão para análise de expressão gênica diferencial, identificando genes diferencialmente expressos entre câncer e tecidos normais ou entre diferentes subtipos de câncer. O pipeline envolve várias etapas, incluindo pré-processamento de dados (envolvendo controle de qualidade e normalização de dados brutos de expressão gênica para remover variações técnicas entre amostras), análise de expressão diferencial (identificação de genes diferencialmente expressos entre dois ou mais grupos de amostras usando testes estatísticos, como testes t, ANOVA ou modelos lineares), Análise funcional (usando ferramentas de bioinformática para identificar vias e funções biológicas enriquecidas em genes diferencialmente expressos) e Validação (envolvendo validação usando conjuntos de dados independentes ou métodos experimentais, como qPCR ou imuno-histoquímica). Usando esse pipeline, uma coleção de moléculas diferencialmente expressas (DEMs) pode ser gerada para qualquer tipo de câncer, incluindo câncer de esôfago. Este compêndio pode ser utilizado para identificar potenciais biomarcadores e alvos de drogas para o câncer e melhorar a compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes à doença. Além disso, o rastreamento específico da população do câncer de esôfago usando esse pipeline ajudará a identificar alvos específicos de medicamentos para populações distintas, levando a tratamentos personalizados para a doença.

Introdução

É alarmante que a CE seja o oitavo câncer mais comum em todo o mundo e a sexta principal causa de morte em todo o mundo. China, Índia e Irã têm taxas de incidência e mortalidade alarmantemente altas. Existem dois tipos principais de CE: adenocarcinoma de esôfago (EAC ou EAD) e carcinoma de células escamosas de esôfago (ESCC)1. A CAE é mais comum no mundo ocidental, enquanto a CEC é mais comum nos países orientais, especialmente na China e no Irã2. Vários fatores de risco estão associados à CE, incluindo o uso de tabaco e álcool, obesidade e doença do refluxo gastroesofágico (DRGE). Além disso, fatores dietéticos, como falta de frutas e vegetais e consumo de bebidas e alimentos quentes, estão associados ao risco de CEC em áreas de alto risco. O diagnóstico e o tratamento precoces são importantes para melhorar os resultados dos pacientes com CE 3,4. Portanto, é importante aumentar a conscientização sobre os fatores de risco, sinais e sintomas da CE e incentivar o rastreamento regular de indivíduos de alto risco. Além disso, os esforços para abordar fatores de risco modificáveis, como o uso de tabaco e álcool e hábitos alimentares pouco saudáveis, podem ajudar a reduzir a incidência de CE. O EAD ocorre nas células das glândulas produtoras de muco na parte inferior do esôfago, perto do estômago. É frequentemente associada à DRGE, na qual o ácido estomacal e o conteúdo retornam ao esôfago. Em contraste, o CEC surge de células planas e finas que revestem a parte superior do esôfago5. É mais comum em áreas onde o uso de tabaco e álcool é generalizado, como China e Irã.

Dentre as várias condições relacionadas ao esôfago, o esôfago de Barrett (EB), condição na qual o revestimento do esôfago é substituído por células glandulares, é um precursor conhecido do EAC6. Vale a pena notar que a EB pode se desenvolver sem DRGE, mas a presença de DRGE aumenta o risco de desenvolver EB em 3 a 5 vezes. Além disso, a presença de EB aumenta o risco de desenvolver EAC em 50-100 vezes7. Além disso, alimentos e líquidos quentes ou picantes têm sido associados ao ESCC, mas não ao EAC. Compreender os fatores de risco para a CE é importante para sua prevenção e detecção precoce. Esforços para abordar fatores de risco modificáveis, como uso de tabaco, consumo de álcool, obesidade e hábitos alimentares não saudáveis, podem ajudar a reduzir a incidência de CE. Além disso, a triagem e vigilância de rotina para indivíduos de alto risco, como aqueles com disfagia ou EB, podem melhorar os resultados, permitindo a detecção e o tratamento precoces.

É certamente verdade que estudos baseados em ômicas, incluindo genômica, transcriptômica, proteômica, metilômica, miRNAômica e metabolômica, contribuíram muito para nossa compreensão dos CEs, especialmente ESCC 8,9,10,11,12,13. Esses estudos permitiram a identificação de novos biomarcadores, potenciais alvos terapêuticos e novas vias envolvidas no desenvolvimento e progressão do ESCC. No entanto, os dados gerados a partir desses estudos estão dispersos por toda a literatura, dificultando o acesso e o uso dessas informações pela comunidade científica. Portanto, é importante criar um repositório ou banco de dados que compile dados obtidos de estudos de alto ou baixo rendimento sobre cânceres específicos. Esse pacote pode ser simplificado e feito implementando algumas diretrizes básicas. Essas diretrizes incluem a seleção de estudos relevantes, a extração e organização de dados desses estudos e a garantia da qualidade e consistência dos dados. Além disso, o compêndio deve ser atualizado regularmente para incluir novos estudos e dados à medida que estiverem disponíveis. Os pesquisadores podem usar uma única plataforma para recuperar e analisar dados sobre um câncer específico, criando um compêndio ou banco de dados que combina dados de diferentes estudos. Isso ajudará a acelerar os esforços de pesquisa e, em última análise, levará a tratamentos mais eficazes e melhores resultados para pacientes com câncer.

O desenvolvimento do compêndio do câncer incorpora dados de estudos de baixo e alto rendimento. Este compêndio será um recurso valioso para pesquisadores que buscam identificar potenciais alvos diagnósticos ou terapêuticos para o câncer. Uma maneira de construir essa coleção é revisar estudos de microarray disponíveis em repositórios acessíveis ao público, como o Gene Expression Omnibus (GEO). Os estudos de microarray podem fornecer informações sobre os níveis de expressão gênica em células cancerígenas, e esses dados podem ser usados para identificar genes diferencialmente expressos (DEGs) que podem desempenhar um papel no desenvolvimento e progressão do câncer.

No entanto, deve-se notar que diferentes estudos podem ter usado métodos diferentes para analisar seus dados, o que pode ter levado à identificação de diferentes DEGs. Portanto, é importante revisar cuidadosamente cada estudo e considerar qualquer viés ou limitação potencial ao agrupar dados para o compêndio. Uma vez que os dados são coletados em uma plataforma comum, os pesquisadores podem usá-los para identificar potenciais alvos moleculares para estudos posteriores. Isso inclui examinar a expressão de um gene específico em amostras clínicas ou realizar estudos mecanicistas para entender como um determinado gene ou proteína está envolvido no desenvolvimento e progressão do câncer. No geral, a criação de um conjunto de dados sobre o câncer será um recurso valioso para os pesquisadores do câncer e ajudará a identificar novos alvos para diagnóstico e intervenções terapêuticas.

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Protocolo

1. Curadoria manual das moléculas reguladas diferencialmente em ESCC

  1. Encontrando estudos relevantes de baixo rendimento usando o PubMed
    NOTA: É importante entender a diferença básica entre técnicas de baixo rendimento e técnicas de alto rendimento. No primeiro, apenas um número limitado de amostras é estudado, e o processo geralmente é demorado, em contraste, mais tarde é mais rápido e o número de amostras pode ser analisado de uma só vez, o que é significativamente maior do que em métodos de baixo rendimento, como Northern blot e Western blot, são técnicas de baixo rendimento, enquanto o microarray de cDNA e a proteômica quantitativa baseada em LC-MS / MS são técnicas de alto rendimento14. Os mecanismos de pesquisa como o NCBI-PubMed (consulte a Tabela de Materiais) são uma boa fonte de encontrar estudos relevantes para qualquer câncer, pois é um recurso disponível publicamente para cientistas biomédicos encontrarem literatura sobre qualquer doença como ESCC. Para encontrar estudos relevantes, as etapas a seguir precisam ser seguidas.
    1. Clique no mecanismo de pesquisa do Google (consulte Tabela de materiais) para abri-lo. Isso também é usado pelos pesquisadores, pois existem periódicos que não estão indexados no PubMed, mas ainda são artigos de boa qualidade. É sempre bom pesquisar mais de um mecanismo de pesquisa para anular a probabilidade de perder algum artigo importante.
    2. Selecione a barra de pesquisa do PubMed e use operadores booleanos (AND, OR, NOT). Os operadores booleanos refinam os pesquisadores para palavras-chave relevantes usadas pelos pesquisadores para encontrar os resultados.

2. Encontrar estudos relevantes usando o PubMed

  1. Digite o endereço da web do NCBI (consulte Tabela de materiais) e clique para abri-lo.
  2. Selecione PubMed no menu da barra lateral esquerda guia Todos os bancos de dados .
  3. Digite na barra de pesquisa as palavras-chave relevantes, que buscarão os artigos relevantes. As palavras-chave devem ser usadas em combinação com os operadores booleanos, pois podem ajudar a obter os artigos que estão intimamente relacionados ao câncer / doença em questão (por exemplo, carcinoma de células escamosas do esôfago).

3. Encontrar estudos relevantes usando a expressão gênica omnibus (GEO)

NOTA: O omnibus de expressão gênica (GEO) é um repositório disponível gratuitamente para armazenar dados em microarrays de DNA. A infinidade de dados disponíveis no GEO é um bom recurso para mineração de dados para identificar moléculas reguladas diferencialmente entre câncer/doenças versus condições normais.

  1. Digite o endereço da Web GEO (consulte Tabela de materiais) e clique para abri-lo.
  2. Digite carcinoma de células escamosas do esôfago E Homo sapiens e pressione Enter.
    NOTA: Para fazer um compêndio de genes regulados diferencialmente para o câncer, é importante selecionar os estudos relevantes de onde os pesquisadores selecionarão as moléculas que são reguladas diferencialmente entre câncer e condições normais . O aspecto principal é definir os critérios para a seleção de moléculas com base na mudança de dobra. A mudança de dobra indicará se um gene/proteína é regulado para cima ou para baixo. A mudança de dobra e os valores de corte do valor p podem alterar significativamente o significado dos dados em um determinado experimento, incluindo RNAseq de microarray ou estudos proteômicos15.

4. Análise de microarray usando GEO2R

NOTA: A primeira coisa é encontrar estudos relevantes usando operadores booleanos (AND, OR, NOT). Estes serão usados em combinação com as palavras-chave 'carcinoma de células escamosas do esôfago', 'ESCC' ou 'carcinoma de células escamosas do esôfago'. O GEO2R (consulte a Tabela de Materiais) é um pacote de linguagem R disponível gratuitamente integrado ao GEO, permitindo que os usuários analisem dados de estudos de microarray de maneira amigável. Ele interage com IDs de entrada GEO e fornece uma interface para realizar análises complexas baseadas em R para identificar DEGs usando pacotes Bioconductor R para o back-end. Este pacote não apenas transforma os dados GEO, mas também apresenta sua saída na forma de tabelas .txt, que podem ser modificadas de acordo com as necessidades dos usuários16. O pacote GEO2R apresenta genes em uma ordem de significância estatística com base no valor p, mas a ordem pode ser classificada com base na mudança de log2 vezes. Além disso, os usuários podem visualizar perfis de expressão gênica como imagens de perfil GEO. Ao contrário de outras ferramentas de análise, o GEO2R é independente dos registros do conjunto de dados selecionados e pode interrogar dados reais enviados diretamente pelos investigadores. Mais de 90% dos estudos GEO podem ser analisados por esse método17. O fluxo de trabalho do GEO2R com etapas envolvidas na análise de dados de microarray usando o GEO2R é mostrado na Figura 1.

  1. Abra o site do GEO2R.
  2. Digite o acesso GSE usando o GEO no espaço de pesquisa rotulado como "Acesso GEO" e clique no botão Definir. Crie rótulos de câncer e depois normal.
  3. Atribua amostras com base no tipo, atribuindo primeiro Câncer seguido por Normal.
  4. Clique em Analisar sem alterar nenhum parâmetro padrão.
  5. Clique na lista completa de genes e baixe os dados no formato de arquivo .tsv. O domínio .tsv deve ser convertido em .xlsx antes de processar os dados.
  6. Converta a alteração de log2 vezes em mudança de dobra usando a fórmula [=(2)^(Nx), onde N é a posição da célula] no excel.
  7. Além disso, sujeite os dados obtidos na etapa 4.6 para obter os DEGs aplicando uma taxa de descoberta falsa (FDR) de 5% ou valor p ajustado (valor p ajustado) <0,05 e uma mudança de > 2,0 vezes para genes regulados positivamente e < 0,5 vezes para genes regulados negativamente.
    NOTA: FDR é uma correção aplicada aos valores-p para levar em conta vários testes, e esses dois não podem ser tratados como sinônimos um do outro. O ajuste de FDR é crucial para controlar a taxa de descobertas falsas ao realizar um grande número de testes de hipóteses.
  8. Identifique a lista de genes únicos em comparação com o estudo publicado anteriormente, submetendo os DEGs usando uma ferramenta geradora de Diagrama de Venn disponível gratuitamente on-line (Pangloss) para gerar o Diagrama de Venn para segregação de DEGs comuns e únicos (consulte a Tabela de Materiais).
  9. Além disso, sujeite a lista de genes exclusivos para identificar a Ontologia Genética.
    NOTA: Diferentes funções GO, como Ontologia do Gene: Função Molecular (GO: MF), Ontologia do Gene: Processos Biológicos (GO: BP) e Ontologia do Gene: Componente Celular (GO: CC) podem ser geradas usando g: Profiler (ver Tabela de Materiais) ou PANTHER (ver Tabela de Materiais), ambos são programas disponíveis online gratuitamente. A análise baseada em GO foi feita usando o g: Profiler.
  10. Para obter a distribuição de DEGs no genoma em cromossomos individuais, use ShinyGO (ver Tabela de Materiais).
  11. Cole toda a lista de genes exclusivos obtida do GEO2R na guia de pesquisa do ShinyGO e a espécie mais adequada selecionada foi o Homo sapiens. O ponto de corte FDR utilizado foi de 5%.
  12. Realizar a seleção de DEGs obtidos do GEO2R para posterior estudo de validação em nível de proteína. O fluxo de trabalho para extrair as informações adicionais, mas cruciais, sobre os DEGs foi mostrado na Figura 2.

5. Encontrando alias para um gene/proteína

  1. Abra a página HPRD (consulte Tabela de materiais) e clique no botão Consultar .
  2. Digite o nome da proteína ou o identificador HPRD na respectiva guia de pesquisa, pressione o botão Pesquisar na parte inferior
    NOTA: Haverá uma página aberta com uma guia rotulada como "NOMES ALTERNATIVOS", clique nela e o alias para este gene ou proteína aparecerá.

6. Encontrando o símbolo genético oficial para os DEGs

  1. Para encontrar o símbolo oficial do gene, abra o Comitê de Nomenclatura de Genes HUGO (HGNC) (consulte a Tabela de Materiais).
  2. Digite o nome obtido na análise GEO2R na barra de pesquisa da página HGNC e clique no símbolo de pesquisa . Os resultados da pesquisa mostrarão a qual símbolo genético oficial, o termo corresponde exatamente.
  3. Clique nesse link e descubra o "símbolo do gene" oficial mencionado lá.

7. Encontrando o locus gênico dos DEGs

  1. Abra a página do gene visitando o link no NCBI.
  2. Digite o símbolo genético oficial do gene e clique em pesquisar.
  3. No resultado, verifique cuidadosamente o gene e o organismo ao qual ele pertence. Depois de ter certeza da correspondência correta, clique no link e prossiga.
    NOTA: Em resumo, sob o título "Contexto genômico", haverá uma localização que na verdade é o locus do gene.

8. Encontrar informações sobre DEGs no locus OMIM Pagegene dos DEGs

  1. Abra a página OMIM (consulte Tabela de materiais).
  2. Digite o nome ou o símbolo do gene da informação do gene, particularmente "gene-fenótipo".
  3. Clique no botão de pesquisa e os resultados aparecerão para o gene de interesse. O display fornece informações sobre a "Relação Gene-Fenótipo".

9. Encontrar localização, domínio e motivo de proteína e natureza secretora da proteína codificada pelo gene

  1. Abra a página HPRD (consulte Tabela de materiais).
  2. Uma vez aberto, digite o nome da proteína ou o especificador HPRD na respectiva guia de pesquisa e pressione o botão Pesquisar na parte inferior.
  3. Haverá uma página aberta com uma guia rotulada como "Resumo". Vá até o fim na página e verifique a guia de localização para saber a localização "secundária" primária e alternativa.
    NOTA: Na mesma página, abaixo de "localização" existe um separador "Domínios e Motivos" onde estão listados os domínios e motivos para a proteína de interesse (se existirem). Novamente na mesma página, adjacente à guia "Domínios e motivos", há uma guia "Expressão" com a subguia "site de expressão". Qualquer proteína que tenha sido relatada como detectada em qualquer fluido biológico pode ser considerada como "secretora" por natureza. Se a proteína de interesse foi relatada em qualquer fluido biológico, como plasma, soro, sêmen, lágrimas extras, ela será listada lá.

10. Seleção seletiva da proteína para validação e avaliação adicional para diagnóstico ou prognóstico da malignidade de interesse

NOTA: Uma vez que moléculas únicas são identificadas, o maior desafio é como validá-las. Normalmente, o estudo de microarray fornece expressão nos níveis de mRNA, mas para o diagnóstico ou prognóstico da doença, a leitura dos níveis de proteína é crucial. Para o mesmo, amostras derivadas de pacientes ou pacientes ou linhagens celulares do mesmo câncer devem ser rastreadas para saber se a molécula é realmente expressa lá e se é capaz de discriminar entre câncer vs. normal, ou bom vs. mau prognóstico, ou diferenciar entre estágios iniciais e tardios das doenças. Para validar a molécula candidata, Western blot, ensaios imunoenzimáticos ou seja, ELISA, imunoprecipitação, imuno-histoquímica, imunocitoquímica ou ensaio são técnicas úteis 18,19,20. Ao mesmo tempo, todos esses ensaios requerem anticorpos para detectar o antígeno presente nas amostras. Os anticorpos são itens caros, por isso é sempre melhor selecionar anticorpos com base nos seguintes pontos:

  1. Verifique se o anticorpo já relatou algum trabalho de pesquisa publicado anteriormente em outras malignidades.
  2. Caso contrário, verifique a empresa fornecedora de anticorpos e veja se eles fornecem uma folha de dados com uma imagem da mancha, imunocitoquímica ou imuno-histoquímica.
    NOTA: Se alguém quiser fazer imuno-histoquímica, mas o anticorpo estiver disponível apenas para o ensaio ELISA, isso pode ser um risco para usar o anticorpo, especialmente se a molécula alvo for uma molécula portadora de domínio transmembrana, mas não o peptídeo sinal. Além disso, se o anticorpo for monoclonal ou policlonal, é melhor preferir um anticorpo monoclonal.

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Resultados

Como exemplo, o GSE161533 de acesso GEO foi usado para estudar genes explorados diferencialmente em ESCC. Os resultados representativos da análise foram mostrados na Figura 3. O GEO2R gera um gráfico de vulcão que é útil para identificar eventos que diferem significativamente entre dois grupos de sujeitos experimentais. O gráfico do vulcão apresenta a distribuição geral do gene com significância transformada -log10 (valor p) no eixo y e mudanças de dobra (com mudança de d...

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Discussão

Desde o envolvimento de técnicas OMICS de alto rendimento na biologia do câncer, a taxa de geração de dados aumentou significativamente. Isso representa um desafio para os pesquisadores, especialmente aqueles sem uma natureza experiente em computadores. Para superar ao longo dos anos, os bioinformáticos tiveram a ideia de desenvolver um banco de dados para fornecer dados de maneira organizada. Isso gerou uma resposta positiva dos pesquisadores, especialmente daqueles que não se interessa...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

MKK recebeu a bolsa TARE (Grant # TAR / 2018 / 001054) bolsa extramural (Grant # 5/13/55/2020 / NCD-III) do Conselho de Pesquisa em Ciência e Engenharia (SERB), Departamento de Ciência e Tecnologia e o Conselho Indiano de Pesquisa Médica (ICMR), Governo da Índia, Nova Delhi, respectivamente.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
NCBI-PUBMEDNCBIConsultando a seção 1. necessário para pesquisar a literatura
Um laptop/macbook ou computador pessoal com internet e um navegador da web.
g:ProfilerELIXIR infrastructurehttps://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gostReferindo-se à seção 4.10. necessário para o enriquecimento de GO:MF, GO:BP e GO:CC
Expressão gênica omnibusNCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/Referindo-se à seção 3.1. necessário para pesquisar o banco de dados de estudo de microarray
GEO2RNCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/Referindo-se à seção 3.2. necessária para analisar os dados usando a ferramenta GEO2R
GoogleGooglehttps://www.google.comReferindo-se à seção 1.1. necessária para pesquisar a literatura
HGNCHGNC é um comitê da Organização do Genoma Humano (HUGO)https://www.genenames.orgReferindo-se à seção 6.1 necessário para conhecer o símbolo genético oficial dos DEGs 
Instituto HPRDde Bioinformática, Bangluru  http://hprd.orgConsultando a seção 5.1 necessária para obter informações sobre a arquitetura da proteína 
OMIM&nbsp; Universidade Johns Hopkins, Baltimorehttp://www.omim.org/entryReferindo-se à seção 8.1 necessária para saber o ID OMIM de um determinado gene / DEG
Programa PanglossDesenvolvido por Chris Seidelhttp://www.pangloss.com/seidel/Protocols/venn.cgiReferindo-se à seção 4.9. necessário para gerar o diagrama de Venn
Laboratório PANTHERThomas na Universidade do Sul da Califórniahttp://www.pantherdb.org/geneListAnalysis.doReferindo-se à seção 4.10. necessário para o enriquecimento de GO:MF, GO:BP e GO:CC
ShinyGO Universidade Estadual de Dakota do Sulhttp://bioinformatics.sdstate.edu/goReferindo-se à seção 4.10. necessário para alocação de DEGs nos cromossomos
https://ncbi.nlm.nih.gov/pubmed

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