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Desenvolvimento de Compêndio para Carcinoma de Células Escamosas de Esôfago

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DOI:

10.3791/65480

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12 de abril de 2024

 , 
1Amity Centre of Nanotechnology, Amity University Haryana, 2Amity Stem Cell Institute, Amity Medical School, Amity University Haryana, 3Clinical Biosamples & Research Services (CBRS)

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve uma ferramenta útil para identificar alterações moleculares significativas no câncer e leva ao desenvolvimento de novas abordagens diagnósticas e terapêuticas para o carcinoma de células escamosas do esôfago.

Resumo

O câncer de esôfago (CE) é a8ª malignidade mais agressiva, e seu tratamento continua desafiador devido à falta de biomarcadores que facilitem a detecção precoce. A CE se manifesta em duas formas histológicas principais - adenocarcinoma (EAD) e carcinoma de células escamosas (ESCC) - ambas exibindo variações na incidência em populações geograficamente distintas. As tecnologias de alto rendimento estão transformando a compreensão de doenças, incluindo o câncer. Um desafio significativo para a comunidade científica é lidar com dados dispersos na literatura. Para resolver isso, um pipeline simples é proposto para a análise de conjuntos de dados de microarray disponíveis publicamente e a coleta de moléculas reguladas diferencialmente entre câncer e condições normais. O pipeline pode servir como uma abordagem padrão para análise de expressão gênica diferencial, identificando genes diferencialmente expressos entre câncer e tecidos normais ou entre diferentes subtipos de câncer. O pipeline envolve várias etapas, incluindo pré-processamento de dados (envolvendo controle de qualidade e normalização de dados brutos de expressão gênica para remover variações técnicas entre amostras), análise de expressão diferencial (identificação de genes diferencialmente expressos entre dois ou mais grupos de amostras usando testes estatísticos, como testes t, ANOVA ou modelos lineares), Análise funcional (usando ferramentas de bioinformática para identificar vias e funções biológicas enriquecidas em genes diferencialmente expressos) e Validação (envolvendo validação usando conjuntos de dados independentes ou métodos experimentais, como qPCR ou imuno-histoquímica). Usando esse pipeline, uma coleção de moléculas diferencialmente expressas (DEMs) pode ser gerada para qualquer tipo de câncer, incluindo câncer de esôfago. Este compêndio pode ser utilizado para identificar potenciais biomarcadores e alvos de drogas para o câncer e melhorar a compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes à doença. Além disso, o rastreamento específico da população do câncer de esôfago usando esse pipeline ajudará a identificar alvos específicos de medicamentos para populações distintas, levando a tratamentos personalizados para a doença.

Introdução

É alarmante que a CE seja o oitavo câncer mais comum em todo o mundo e a sexta principal causa de morte em todo o mundo. China, Índia e Irã têm taxas de incidência e mortalidade alarmantemente altas. Existem dois tipos principais de CE: adenocarcinoma de esôfago (EAC ou EAD) e carcinoma de células escamosas de esôfago (ESCC)1. A CAE é mais comum no mundo ocidental, enquanto a CEC é mais comum nos países orientais, especialmente na China e no Irã2. Vários fatores de risco estão associados à CE, incluindo o uso de tabaco e álcool, obesidade e doença do refluxo gastroesofágico (DRGE). Além disso, fatores dietéticos, como falta de frutas e vegetais e consumo de bebidas e alimentos quentes, estão associados ao risco de CEC em áreas de alto risco. O diagnóstico e o tratamento precoces são importantes para melhorar os resultados dos pacientes com CE 3,4. Portanto, é importante aumentar a conscientização sobre os fatores de risco, sinais e sintomas da CE e incentivar o rastreamento regular de indivíduos de alto risco. Além disso, os esforços para abordar fatores de risco modificáveis, como o uso de tabaco e álcool e hábitos alimentares pouco saudáveis, podem ajudar a reduzir a incidência de CE. O EAD ocorre nas células das glândulas produtoras de muco na parte inferior do esôfago, perto do estômago. É frequentemente associada à DRGE, na qual o ácido estomacal e o conteúdo retornam ao esôfago. Em contraste, o CEC surge de células planas e finas que revestem a parte superior do esôfago5. É mais comum em áreas onde o uso de tabaco e álcool é generalizado, como China e Irã.

Dentre as várias condições relacionadas ao esôfago, o esôfago de Barrett (EB), condição na qual o revestimento do esôfago é substituído por células glandulares, é um precursor conhecido do EAC6. Vale a pena notar que a EB pode se desenvolver sem DRGE, mas a presença de DRGE aumenta o risco de desenvolver EB em 3 a 5 vezes. Além disso, a presença de EB aumenta o risco de desenvolver EAC em 50-100 vezes7. Além disso, alimentos e líquidos quentes ou picantes têm sido associados ao ESCC, mas não ao EAC. Compreender os fatores de risco para a CE é importante para sua prevenção e detecção precoce. Esforços para abordar fatores de risco modificáveis, como uso de tabaco, consumo de álcool, obesidade e hábitos alimentares não saudáveis, podem ajudar a reduzir a incidência de CE. Além disso, a triagem e vigilância de rotina para indivíduos de alto risco, como aqueles com disfagia ou EB, podem melhorar os resultados, permitindo a detecção e o tratamento precoces.

É certamente verdade que estudos baseados em ômicas, incluindo genômica, transcriptômica, proteômica, metilômica, miRNAômica e metabolômica, contribuíram muito para nossa compreensão dos CEs, especialmente ESCC 8,9,10,11,12,13. Esses estudos permitiram a identificação de novos biomarcadores, potenciais alvos terapêuticos e novas vias envolvidas no desenvolvimento e progressão do ESCC. No entanto, os dados gerados a partir desses estudos estão dispersos por toda a literatura, dificultando o acesso e o uso dessas informações pela comunidade científica. Portanto, é importante criar um repositório ou banco de dados que compile dados obtidos de estudos de alto ou baixo rendimento sobre cânceres específicos. Esse pacote pode ser simplificado e feito implementando algumas diretrizes básicas. Essas diretrizes incluem a seleção de estudos relevantes, a extração e organização de dados desses estudos e a garantia da qualidade e consistência dos dados. Além disso, o compêndio deve ser atualizado regularmente para incluir novos estudos e dados à medida que estiverem disponíveis. Os pesquisadores podem usar uma única plataforma para recuperar e analisar dados sobre um câncer específico, criando um compêndio ou banco de dados que combina dados de diferentes estudos. Isso ajudará a acelerar os esforços de pesquisa e, em última análise, levará a tratamentos mais eficazes e melhores resultados para pacientes com câncer.

O desenvolvimento do compêndio do câncer incorpora dados de estudos de baixo e alto rendimento. Este compêndio será um recurso valioso para pesquisadores que buscam identificar potenciais alvos diagnósticos ou terapêuticos para o câncer. Uma maneira de construir essa coleção é revisar estudos de microarray disponíveis em repositórios acessíveis ao público, como o Gene Expression Omnibus (GEO). Os estudos de microarray podem fornecer informações sobre os níveis de expressão gênica em células cancerígenas, e esses dados podem ser usados para identificar genes diferencialmente expressos (DEGs) que podem desempenhar um papel no desenvolvimento e progressão do câncer.

No entanto, deve-se notar que diferentes estudos podem ter usado métodos diferentes para analisar seus dados, o que pode ter levado à identificação de diferentes DEGs. Portanto, é importante revisar cuidadosamente cada estudo e considerar qualquer viés ou limitação potencial ao agrupar dados para o compêndio. Uma vez que os dados são coletados em uma plataforma comum, os pesquisadores podem usá-los para identificar potenciais alvos moleculares para estudos posteriores. Isso inclui examinar a expressão de um gene específico em amostras clínicas ou realizar estudos mecanicistas para entender como um determinado gene ou proteína está envolvido no desenvolvimento e progressão do câncer. No geral, a criação de um conjunto de dados sobre o câncer será um recurso valioso para os pesquisadores do câncer e ajudará a identificar novos alvos para diagnóstico e intervenções terapêuticas.

Protocolo

1. Curadoria manual das moléculas reguladas diferencialmente em ESCC

  1. Encontrando estudos relevantes de baixo rendimento usando o PubMed
    NOTA: É importante entender a diferença básica entre técnicas de baixo rendimento e técnicas de alto rendimento. No primeiro, apenas um número limitado de amostras é estudado, e o processo geralmente é demorado, em contraste, mais tarde é mais rápido e o número de amostras pode ser analisado de uma só vez, o que é significativamente maior do que em métodos de baixo rendimento, como Northern blot e Western blot, são técnicas de baixo rendimento, enquanto o microarray de cDNA e a proteômica quantitativa baseada em LC-MS / MS são técnicas de alto rendimento14. Os mecanismos de pesquisa como o NCBI-PubMed (consulte a Tabela de Materiais) são uma boa fonte de encontrar estudos relevantes para qualquer câncer, pois é um recurso disponível publicamente para cientistas biomédicos encontrarem literatura sobre qualquer doença como ESCC. Para encontrar estudos relevantes, as etapas a seguir precisam ser seguidas.
    1. Clique no mecanismo de pesquisa do Google (consulte Tabela de materiais) para abri-lo. Isso também é usado pelos pesquisadores, pois existem periódicos que não estão indexados no PubMed, mas ainda são artigos de boa qualidade. É sempre bom pesquisar mais de um mecanismo de pesquisa para anular a probabilidade de perder algum artigo importante.
    2. Selecione a barra de pesquisa do PubMed e use operadores booleanos (AND, OR, NOT). Os operadores booleanos refinam os pesquisadores para palavras-chave relevantes usadas pelos pesquisadores para encontrar os resultados.

2. Encontrar estudos relevantes usando o PubMed

  1. Digite o endereço da web do NCBI (consulte Tabela de materiais) e clique para abri-lo.
  2. Selecione PubMed no menu da barra lateral esquerda guia Todos os bancos de dados .
  3. Digite na barra de pesquisa as palavras-chave relevantes, que buscarão os artigos relevantes. As palavras-chave devem ser usadas em combinação com os operadores booleanos, pois podem ajudar a obter os artigos que estão intimamente relacionados ao câncer / doença em questão (por exemplo, carcinoma de células escamosas do esôfago).

3. Encontrar estudos relevantes usando a expressão gênica omnibus (GEO)

NOTA: O omnibus de expressão gênica (GEO) é um repositório disponível gratuitamente para armazenar dados em microarrays de DNA. A infinidade de dados disponíveis no GEO é um bom recurso para mineração de dados para identificar moléculas reguladas diferencialmente entre câncer/doenças versus condições normais.

  1. Digite o endereço da Web GEO (consulte Tabela de materiais) e clique para abri-lo.
  2. Digite carcinoma de células escamosas do esôfago E Homo sapiens e pressione Enter.
    NOTA: Para fazer um compêndio de genes regulados diferencialmente para o câncer, é importante selecionar os estudos relevantes de onde os pesquisadores selecionarão as moléculas que são reguladas diferencialmente entre câncer e condições normais . O aspecto principal é definir os critérios para a seleção de moléculas com base na mudança de dobra. A mudança de dobra indicará se um gene/proteína é regulado para cima ou para baixo. A mudança de dobra e os valores de corte do valor p podem alterar significativamente o significado dos dados em um determinado experimento, incluindo RNAseq de microarray ou estudos proteômicos15.

4. Análise de microarray usando GEO2R

NOTA: A primeira coisa é encontrar estudos relevantes usando operadores booleanos (AND, OR, NOT). Estes serão usados em combinação com as palavras-chave 'carcinoma de células escamosas do esôfago', 'ESCC' ou 'carcinoma de células escamosas do esôfago'. O GEO2R (consulte a Tabela de Materiais) é um pacote de linguagem R disponível gratuitamente integrado ao GEO, permitindo que os usuários analisem dados de estudos de microarray de maneira amigável. Ele interage com IDs de entrada GEO e fornece uma interface para realizar análises complexas baseadas em R para identificar DEGs usando pacotes Bioconductor R para o back-end. Este pacote não apenas transforma os dados GEO, mas também apresenta sua saída na forma de tabelas .txt, que podem ser modificadas de acordo com as necessidades dos usuários16. O pacote GEO2R apresenta genes em uma ordem de significância estatística com base no valor p, mas a ordem pode ser classificada com base na mudança de log2 vezes. Além disso, os usuários podem visualizar perfis de expressão gênica como imagens de perfil GEO. Ao contrário de outras ferramentas de análise, o GEO2R é independente dos registros do conjunto de dados selecionados e pode interrogar dados reais enviados diretamente pelos investigadores. Mais de 90% dos estudos GEO podem ser analisados por esse método17. O fluxo de trabalho do GEO2R com etapas envolvidas na análise de dados de microarray usando o GEO2R é mostrado na Figura 1.

  1. Abra o site do GEO2R.
  2. Digite o acesso GSE usando o GEO no espaço de pesquisa rotulado como "Acesso GEO" e clique no botão Definir. Crie rótulos de câncer e depois normal.
  3. Atribua amostras com base no tipo, atribuindo primeiro Câncer seguido por Normal.
  4. Clique em Analisar sem alterar nenhum parâmetro padrão.
  5. Clique na lista completa de genes e baixe os dados no formato de arquivo .tsv. O domínio .tsv deve ser convertido em .xlsx antes de processar os dados.
  6. Converta a alteração de log2 vezes em mudança de dobra usando a fórmula [=(2)^(Nx), onde N é a posição da célula] no excel.
  7. Além disso, sujeite os dados obtidos na etapa 4.6 para obter os DEGs aplicando uma taxa de descoberta falsa (FDR) de 5% ou valor p ajustado (valor p ajustado) <0,05 e uma mudança de > 2,0 vezes para genes regulados positivamente e < 0,5 vezes para genes regulados negativamente.
    NOTA: FDR é uma correção aplicada aos valores-p para levar em conta vários testes, e esses dois não podem ser tratados como sinônimos um do outro. O ajuste de FDR é crucial para controlar a taxa de descobertas falsas ao realizar um grande número de testes de hipóteses.
  8. Identifique a lista de genes únicos em comparação com o estudo publicado anteriormente, submetendo os DEGs usando uma ferramenta geradora de Diagrama de Venn disponível gratuitamente on-line (Pangloss) para gerar o Diagrama de Venn para segregação de DEGs comuns e únicos (consulte a Tabela de Materiais).
  9. Além disso, sujeite a lista de genes exclusivos para identificar a Ontologia Genética.
    NOTA: Diferentes funções GO, como Ontologia do Gene: Função Molecular (GO: MF), Ontologia do Gene: Processos Biológicos (GO: BP) e Ontologia do Gene: Componente Celular (GO: CC) podem ser geradas usando g: Profiler (ver Tabela de Materiais) ou PANTHER (ver Tabela de Materiais), ambos são programas disponíveis online gratuitamente. A análise baseada em GO foi feita usando o g: Profiler.
  10. Para obter a distribuição de DEGs no genoma em cromossomos individuais, use ShinyGO (ver Tabela de Materiais).
  11. Cole toda a lista de genes exclusivos obtida do GEO2R na guia de pesquisa do ShinyGO e a espécie mais adequada selecionada foi o Homo sapiens. O ponto de corte FDR utilizado foi de 5%.
  12. Realizar a seleção de DEGs obtidos do GEO2R para posterior estudo de validação em nível de proteína. O fluxo de trabalho para extrair as informações adicionais, mas cruciais, sobre os DEGs foi mostrado na Figura 2.

5. Encontrando alias para um gene/proteína

  1. Abra a página HPRD (consulte Tabela de materiais) e clique no botão Consultar .
  2. Digite o nome da proteína ou o identificador HPRD na respectiva guia de pesquisa, pressione o botão Pesquisar na parte inferior
    NOTA: Haverá uma página aberta com uma guia rotulada como "NOMES ALTERNATIVOS", clique nela e o alias para este gene ou proteína aparecerá.

6. Encontrando o símbolo genético oficial para os DEGs

  1. Para encontrar o símbolo oficial do gene, abra o Comitê de Nomenclatura de Genes HUGO (HGNC) (consulte a Tabela de Materiais).
  2. Digite o nome obtido na análise GEO2R na barra de pesquisa da página HGNC e clique no símbolo de pesquisa . Os resultados da pesquisa mostrarão a qual símbolo genético oficial, o termo corresponde exatamente.
  3. Clique nesse link e descubra o "símbolo do gene" oficial mencionado lá.

7. Encontrando o locus gênico dos DEGs

  1. Abra a página do gene visitando o link no NCBI.
  2. Digite o símbolo genético oficial do gene e clique em pesquisar.
  3. No resultado, verifique cuidadosamente o gene e o organismo ao qual ele pertence. Depois de ter certeza da correspondência correta, clique no link e prossiga.
    NOTA: Em resumo, sob o título "Contexto genômico", haverá uma localização que na verdade é o locus do gene.

8. Encontrar informações sobre DEGs no locus OMIM Pagegene dos DEGs

  1. Abra a página OMIM (consulte Tabela de materiais).
  2. Digite o nome ou o símbolo do gene da informação do gene, particularmente "gene-fenótipo".
  3. Clique no botão de pesquisa e os resultados aparecerão para o gene de interesse. O display fornece informações sobre a "Relação Gene-Fenótipo".

9. Encontrar localização, domínio e motivo de proteína e natureza secretora da proteína codificada pelo gene

  1. Abra a página HPRD (consulte Tabela de materiais).
  2. Uma vez aberto, digite o nome da proteína ou o especificador HPRD na respectiva guia de pesquisa e pressione o botão Pesquisar na parte inferior.
  3. Haverá uma página aberta com uma guia rotulada como "Resumo". Vá até o fim na página e verifique a guia de localização para saber a localização "secundária" primária e alternativa.
    NOTA: Na mesma página, abaixo de "localização" existe um separador "Domínios e Motivos" onde estão listados os domínios e motivos para a proteína de interesse (se existirem). Novamente na mesma página, adjacente à guia "Domínios e motivos", há uma guia "Expressão" com a subguia "site de expressão". Qualquer proteína que tenha sido relatada como detectada em qualquer fluido biológico pode ser considerada como "secretora" por natureza. Se a proteína de interesse foi relatada em qualquer fluido biológico, como plasma, soro, sêmen, lágrimas extras, ela será listada lá.

10. Seleção seletiva da proteína para validação e avaliação adicional para diagnóstico ou prognóstico da malignidade de interesse

NOTA: Uma vez que moléculas únicas são identificadas, o maior desafio é como validá-las. Normalmente, o estudo de microarray fornece expressão nos níveis de mRNA, mas para o diagnóstico ou prognóstico da doença, a leitura dos níveis de proteína é crucial. Para o mesmo, amostras derivadas de pacientes ou pacientes ou linhagens celulares do mesmo câncer devem ser rastreadas para saber se a molécula é realmente expressa lá e se é capaz de discriminar entre câncer vs. normal, ou bom vs. mau prognóstico, ou diferenciar entre estágios iniciais e tardios das doenças. Para validar a molécula candidata, Western blot, ensaios imunoenzimáticos ou seja, ELISA, imunoprecipitação, imuno-histoquímica, imunocitoquímica ou ensaio são técnicas úteis 18,19,20. Ao mesmo tempo, todos esses ensaios requerem anticorpos para detectar o antígeno presente nas amostras. Os anticorpos são itens caros, por isso é sempre melhor selecionar anticorpos com base nos seguintes pontos:

  1. Verifique se o anticorpo já relatou algum trabalho de pesquisa publicado anteriormente em outras malignidades.
  2. Caso contrário, verifique a empresa fornecedora de anticorpos e veja se eles fornecem uma folha de dados com uma imagem da mancha, imunocitoquímica ou imuno-histoquímica.
    NOTA: Se alguém quiser fazer imuno-histoquímica, mas o anticorpo estiver disponível apenas para o ensaio ELISA, isso pode ser um risco para usar o anticorpo, especialmente se a molécula alvo for uma molécula portadora de domínio transmembrana, mas não o peptídeo sinal. Além disso, se o anticorpo for monoclonal ou policlonal, é melhor preferir um anticorpo monoclonal.

Resultados

Como exemplo, o GSE161533 de acesso GEO foi usado para estudar genes explorados diferencialmente em ESCC. Os resultados representativos da análise foram mostrados na Figura 3. O GEO2R gera um gráfico de vulcão que é útil para identificar eventos que diferem significativamente entre dois grupos de sujeitos experimentais. O gráfico do vulcão apresenta a distribuição geral do gene com significância transformada -log10 (valor p) no eixo y e mudanças de dobra (com mudança de dobra transformada log2 ) no eixo x (Figura 3A), e é útil para visualizar os genes que são expressos diferencialmente. Os genes destacados são significativamente expressos diferencialmente em um corte padrão de valor p ajustado de 0,05 (azul = regulado negativamente, vermelho = regulado positivamente).

Um gráfico de diferença média (MD) exibe a alteração delog 2 vezes vs. valores médios de expressão log2 e é útil para visualizar os genes que são expressos diferencialmente. No gráfico MD, os genes onde o log2 transformou as mudanças de dobra no eixo y e registram a expressão do valor médio no eixo x ( Figura 3B ). Os genes destacados são significativamente expressos diferencialmente em um valor de p ajustado padrão de 0,05 (azul = regulado negativamente, vermelho = regulado positivamente). Os gráficos de vulcões encontram os mesmos problemas que os gráficos de MA em termos de exibição de informações de apenas dois tratamentos ao mesmo tempo21.

Além disso, a Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP)22 foi usada para avaliar a relação entre ESCC e amostras normais (Figura 3C). Embora a maioria das amostras estivesse nas respectivas categorias, duas amostras ESCC foram encontradas nas amostras normais.

O GEO2R apresentou um gráfico de densidade de expressão interativo 2D (Figura 3D), que demonstrou efetivamente a densidade de expressão no conjunto de dados. Esse gráfico é útil para determinar se a normalização é necessária para DEGs. Neste gráfico, o eixo y denota densidade, enquanto o eixo x denota intensidade para ESCC (cor verde) e normal (cor violeta).

A distribuição dos valores em diferentes amostras, incluindo ESCC e normal, foi mostrada no gráfico de caixa. Essas distribuições dão dicas se as amostras são realmente adequadas para análise de expressão diferencial. Os valores centrados na mediana indicam claramente que os dados são normalizados e comparáveis entre si (Figura 3E).

Os genes identificados são filtrados com base em p < 0,05 e critérios de mudança de dobra. Os genes inalterados (com mudança de dobra entre <2,0->0,50) removidos da análise. Além disso, quando comparado com um estudo publicado anteriormente, os genes comuns encontrados são apenas 514, mas o número único de genes obtidos é 1193. É importante observar que a identificação de genes únicos usando o GEO2R pode ajudar não apenas a diminuir a redundância, mas também a enriquecer o compêndio.

Uma lista parcial de DEGs foi mencionada na Tabela 1, enquanto uma lista completa de DEGs é fornecida no Arquivo Suplementar 1. Alguns dos genes regulados positivamente pertencem à matriz extracelular, como MMP1 8,23,24, MMP12 23,25, SPP1 8,26, POSTN9 e VCAN 8,27. Entre outros genes listados na Tabela 1 estão CMPK2, AURKA28,29, CHEK127 e CDK130 são regulados positivamente e EMP127, PTK631,32, GPX327, DPT33, FHL134,35 e CRNN 8,36 são regulados negativamente no ESCC em comparação com o epitélio normal. POSTN (periostina) foi regulado positivamente no ESCC e também foi relatado no caso de adenocarcinoma de esôfago. Um estudo anterior sobre CEC relatou que a expressão da proteína POSTN não foi observada apenas na região estromal, mas também nas células tumorais, sugerindo que há uma interação entre tumor-microambiente9. A periostina é uma proteína secretada principalmente pelas células mesenquimais e desempenha um papel crucial na regulação, adesão e diferenciação dos osteoblastos, bem como no reparo de feridas. Além disso, a periostina tem sido implicada na progressão do tumor e metástase em vários tipos de câncer, incluindo ESCC. Estudos demonstraram que a periostina está envolvida na transição epitelial-mesenquimal (EMT) em cânceres e angiogênese tumoral, promovendo migração celular, motilidade, adesão e crescimento celular metastático de tumores. No esôfago de Barrett, uma condição pré-cancerosa do esôfago, há uma regulação positiva significativa do POSTN, o gene que codifica a periostina, em comparação com o tecido esofágico normal37. Na esofagite eosinofílica, uma doença inflamatória do esôfago, tanto o mRNA da periostina quanto os níveis de expressão de proteínas são regulados positivamente em comparação com o epitélio esofágico normal. Da mesma forma, no ESCC, o POSTN foi regulado positivamente em 11 vezes na análise da expressão gênica9. Essas descobertas sugerem que o POSTN pode servir como um biomarcador potencial para ESCC e outros tipos de câncer. Além disso, os níveis séricos aumentados de POSTN são relatados em pacientes com câncer de mama diagonalizados com metástases ósseas, refletindo que o POSTN também pode ser investigado como um potencial biomarcador metastático no soro de pacientes com ESCC. No geral, o POSTN parece desempenhar papéis importantes na progressão do tumor e pode ter implicações clínicas potenciais para o diagnóstico, prognóstico e tratamento do câncer.

A distribuição cromossômica de DEGs em cromossomos individuais mostra que o número máximo de genes era dos cromossomos 1-6 e X (Figura 4). A análise de vias baseada em ShinyGO mostrou que várias vias cruciais aparecem quando a análise de DEGs. Alguns deles foram a via de sinalização IL-17, digestão e absorção de proteínas, interação ECM-receptor, via de sinalização TNF, via de sinalização do receptor Toll-like, via de sinalização de quimiocinas, interação citocina-receptor de citocinas, doença hepática alcoólica, microRNAs no câncer, desregulação transcricional no câncer, ciclo celular e via de sinalização do receptor NONO-like em ESCC. Além disso, o enriquecimento dos termos GO em DEGs foi feito usando a análise g: Profiler. Diferentes termos GO para função molecular (GO: MF), componentes celulares (GO: CC) e processos biológicos (GO: BP) foram enriquecidos (Figura 5). A lista desses termos GO foi fornecida na Tabela 2.

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Figura 1: Representação esquemática para processamento dos estudos sobre carcinoma espinocelular de esôfago disponíveis em omnibus de expressão gênica usando o programa GEO2R. Diferentes etapas envolvidas na identificação de genes regulados diferencialmente (DEGs) ou moléculas reguladas diferencialmente (DEMs) foram mostradas no esquema, incluindo critérios de seleção para os DEGs com base na mudança de dobra >2,0 vezes e p < 0,05 para regulado positivamente e <0,5 e valor de p <0,05 para regulado negativamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Representação esquemática para encontrar informações adicionais sobre genes regulados diferencialmente no carcinoma de células escamosas do esôfago disponíveis usando outros recursos disponíveis publicamente. Além disso, as informações sobre os DEGs são cruciais para decidir sobre os DEGs que precisam ser selecionadas para validação e avaliação adicionais no ambiente clínico. Informações como extração de alias, símbolo genético oficial, localização cromossômica/locus gênico, OMIM, domínio/motivo, natureza secretora da proteína e disponibilidade de anticorpos adequados para validação em níveis de proteína podem ser obtidas em diferentes recursos online. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Distribuição do estudo com GSE161533 de acesso GEO usando o programa GEO2R para identificação de DEGs entre ESCC vs. normal. O programa GEO2R foi usado com parâmetros padrão que dão origem a (A) Gráfico de vulcão representando a distribuição de genes com significância transformada -log10 (valor p) no eixo y e mudanças de dobra (com mudança de dobra transformada em log2 ) no eixo x, (B) Gráfico de gráfico MD exibindo a mudança de log2 vezes vs. valores médios de expressão log2 para visualização de genes diferencialmente expressos, (C) UMAP (Uniform Manifold Approximation and Projection) mostra a segregação de amostras com base em seus tipos, (D) O gráfico de densidade de expressão complementa, pois verifica a normalização dos dados antes da análise de expressão diferencial, (E) Gráfico de caixa mostrando valores centrados na mediana nas amostras para indicar que a normalização dos dados é comparável cruzada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Distribuição de DEGs em diferentes loci cromossômicos usando a ferramenta de enriquecimento ShinyGO. (A) Genes únicos foram identificados gerando um diagrama de Venn para comparar estudos atuais e publicados anteriormente. (B) A distribuição de DEGs nos diferentes cromossomos do genoma. (C) Enriquecimento de vias para DEGs usando análise de enriquecimento baseada em ShinyGO. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Gráficos de Manhattan para ilustrar os enriquecimentos do termo GO de genes-alvo usando g: Profiler. Os genes diferencialmente expressos foram analisados por g: Profiler e o enriquecimento em termos de GO (MF: função molecular; BP: processo biológico; CC: componente celular) e as vias KEGG nas vias Reactome (REAC), WiKi-Pathways (WP), fator de transcrição (TF) e base alvo de microRNA (MIRNA) foram representadas graficamente no gráfico de Manhattan, onde o eixo x são os termos funcionais GO coloridos por categoria. Cada ponto colorido representa um termo GO. O eixo y mostra os valores de p -log10 ajustados. Os termos GO que são estatisticamente significativos para ESCC são mostrados no eixo x. MF: Função Molecular; BP: Processo biológico; CC: Componente celular; MIRNA: MicroRNA; HP: Fenótipo Humano. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Lista parcial de genes diferencialmente expressos em ESCC. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Enriquecimento de termos GO em ESCC usando g: Profiler. Clique aqui para baixar esta tabela.

Arquivo Suplementar 1: Lista Completa de genes diferencialmente expressos em ESCC. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Desde o envolvimento de técnicas OMICS de alto rendimento na biologia do câncer, a taxa de geração de dados aumentou significativamente. Isso representa um desafio para os pesquisadores, especialmente aqueles sem uma natureza experiente em computadores. Para superar ao longo dos anos, os bioinformáticos tiveram a ideia de desenvolver um banco de dados para fornecer dados de maneira organizada. Isso gerou uma resposta positiva dos pesquisadores, especialmente daqueles que não se interessam por tecnologia. Além disso, dados OMICS dispersos aqui e ali na literatura não são úteis para ninguém. Portanto, para fazer uso adequado disso, sempre houve a necessidade de uma plataforma comum onde pesquisadores com interesses especializados pudessem acessar os dados. Há vários bancos de dados sobre diferentes tipos de câncer, incluindo ONCOMINE38, ESCC ATLAS39, banco de dados de câncer de pâncreas (PCD) 40 e DDEC41.

O conceito de genes diferencialmente expressos (DEGs) surge da análise de dados de sequenciamento de RNA, onde genes que apresentam alterações significativas nos níveis de expressão em duas ou mais condições (como câncer vs. normal ou tratamento vs. controle) são identificados. Várias ferramentas foram desenvolvidas para determinar DEGs, que realizam testes estatísticos com base em quantificações dos genes expressos avaliados a partir de análises computacionais de leituras brutas de RNA-seq ou razões de intensidade geradas entre a sonda e a sequência alvo no grupo câncer vs. normal. Essas ferramentas fornecem informações relacionadas ao nível de expressão e magnitude de diferença em pares para cada gene. As análises de expressão gênica diferencial (DGE) são úteis para entender os mecanismos genéticos que contribuem para as diferenças fenotípicas nos organismos. As análises DGE têm sido aplicadas para estudar uma variedade de processos biológicos, incluindo a detecção da origem do tumor e/ou análise do microbioma. Ao identificar DEGs, essas análises podem fornecer informações sobre os fatores genéticos subjacentes que contribuem para esses processos biológicos envolvidos na tumorigênese do CEC21.

O método da ferramenta GEO2R, que está disponível publicamente e é o método preferido porque a maioria dos estudos disponíveis na literatura foi analisada usando algoritmos diferentes, o que levou a grandes diferenças na análise dos dados; Portanto, para evitar essas diferenças, essa plataforma amigável foi usada porque é gratuita e fácil de usar. Isso permite comparações entre condições como 'Câncer vs. Normal' ou 'Tratamento vs. Nenhum Tratamento'.

Nesse caso, o CEC foi escolhido por ser um câncer emergente do trato gastrointestinal (GI) na Índia e na China. Escolhemos o GSE161533 de acesso GEO para analisar usando GEO2R para identificar DEGs entre ESCC vs. normal. O estudo foi escolhido porque não incluiu pacientes com CEC que haviam recebido tratamento quimioterápico ou radioterápico anteriormente. É preferível usar amostras pareadas, se disponíveis (ESCC e normal adjacente do mesmo paciente) para qualquer análise. Isso ocorre porque se espera que o genoma do CEC e os tecidos normais do mesmo paciente sejam muito semelhantes, pois vêm do mesmo fundo genético e porque os tecidos estão no mesmo ambiente. O uso de amostras pareadas ajuda a evitar vieses na análise que podem ser introduzidos se você comparar ESCC e tecidos normais de diferentes pacientes com diferentes origens genéticas. O uso de amostras pareadas permite uma identificação mais precisa das diferenças na expressão gênica entre ESCC e tecidos normais dentro do mesmo paciente, o que pode ajudar a melhorar a especificidade dos resultados. Essa abordagem é frequentemente utilizada em estudos de expressão gênica para controlar a variabilidade individual e aumentar o poder analítico.

Pegamos todos os dados da amostra dos sujeitos envolvidos no estudo e usamos a plataforma GEO2R para analisar os dados de expressão gênica. Primeiro, atribuímos amostras de câncer, seguidas por amostras normais. Após a atribuição dessas amostras, os parâmetros padrão disponíveis no banco de dados GEO2R foram usados para identificar amostras de câncer ou tratamento e as amostras normais ou controle. Para diferenciar entre câncer e amostras normais, um limite de valor p ajustado (adj. P Val) de menos de 0,05 e um limite de mudança de dobra de >2,0 foi definido para genes regulados positivamente, e um limite de valor p ajustado (adj. P Val) de menos de 0,05 a menos e um limite de mudança de dobra de <0,5 para genes regulados negativamente. Esses limiares têm sido comumente usados em estudos de expressão gênica para identificar genes diferencialmente expressos entre câncer e normal. É importante notar que a escolha de limiares de significância pode afetar o número e a identidade dos genes identificados como diferencialmente expressos. Além disso, é importante avaliar cuidadosamente a relevância biológica dos genes identificados e realizar mais estudos de validação para confirmar os resultados.

Na literatura, tem havido uma tendência de relatar apenas os genes com pelo menos 2 vezes de alteração para genes regulados positivamente e < 0,5 vezes para genes regulados negativamente, especialmente em estudos de microarray e proteômica42. Em estudos anteriores, uma mudança de dobra de > 1,5 vezes foi considerada como regulada positivamente e < 0,67 vezes alterada para genes regulados negativamente43 , 44 , mas as tendências da literatura na última década mostram claramente que uma mudança de dobra mais alta é preferida em grande parte porque quando experimentos de validação são realizados em candidatos com baixo valor de dobra, eles são fracos ou nenhuma correlação encontrada entre os dados de mRNA e níveis de proteína45. Há um lado sombrio na escolha de uma mudança de dobra mais alta é que às vezes você perde algumas moléculas que são biologicamente relevantes na doença ou câncer, mas apenas omitidas devido ao corte preferido para fazer a lista de DEGs / DEMs. Além disso, a literatura é tendenciosa em relação a relatar que os DEGs preferem especialmente moléculas reguladas ou superexpressas em vez de moléculas subexpressas. Além disso, se a expressão de moléculas estiver em conformidade com os mesmos padrões de regulação positiva ou superexpressão em vários estudos, independentemente de serem para o mesmo câncer ou doença, é uma abordagem preferida entre os cientistas. Além disso, se o mesmo padrão de superexpressão for observado em várias doenças e relatado na literatura, ele será novamente amplamente aceito na comunidade científica.

Além disso, a semelhança das doenças depende de dados de microarray ou literatura serem empregados para a comparação. Por fim, descrições vagamente definidas de magnitudes de expressão diferencial na literatura exibem apenas uma correlação limitada com dados de mudança de dobra de microarray46.

Além disso, um compêndio pode fornecer informações adicionais de bancos de dados como o gene NCBI Entrez47, HGNC48, OMIM49, HPRD50,51, Ensemble52, KEGG53, WikiPathways54, GO55, miRBase56 e DGV57. Ao usar o GEO2R, uma avaliação do UMAP mostra como as amostras estão relacionadas. Na análise atual, duas amostras ESCC são preenchidas com amostras normais, sugerindo que há um erro de amostragem ou as amostras ESCC são heterogêneas o suficiente para aparecer no grupo de amostras normais.

A ferramenta GEO2R é amigável e facilmente acessível, mas tem algumas limitações. O GEO2R não tem a capacidade de gerar gráficos PCA e mapas de calor ou filtrar amostras após o controle de qualidade. Ele fornece apenas um único diagrama de Venn para comparações de amostras dentro da mesma série. O GEO2R é limitado a arquivos Series Matrix, evitando comparações entre séries. Além disso, o GEO2R analisa apenas dados de microarray e não possui controles de qualidade para normalidade da amostra ou comparabilidade cruzada. O GEO2R não permite um número ilimitado de resultados de pesquisa e exibe apenas os 250 principais genes para qualquer comparação de pares em um conjunto de dados. Ele também analisa conjuntos de dados com réplicas de amostra insuficientes para uma análise estatística robusta. O GEO2R fornece dados na alteração de dobra de log, o que exigia que ele fosse convertido em alteração de dobra usando r ou em uma planilha do Excel. Além disso, para representar genes regulados para cima e para baixo, é preciso usar outro software ou ferramenta online para fazer o mapa de calor 58,59,60.

Em resumo, um pipeline simples é fornecido neste artigo, que pode ser usado para fazer um compêndio para qualquer tipo de malignidade com pequenas modificações. O Compêndio é necessário para apoiar os cientistas biomédicos, especialmente para a descoberta de biomarcadores, fornecendo as moléculas candidatas para validação no ambiente clínico para seu uso para prognóstico ou diagnóstico.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

MKK recebeu a bolsa TARE (Grant # TAR / 2018 / 001054) bolsa extramural (Grant # 5/13/55/2020 / NCD-III) do Conselho de Pesquisa em Ciência e Engenharia (SERB), Departamento de Ciência e Tecnologia e o Conselho Indiano de Pesquisa Médica (ICMR), Governo da Índia, Nova Delhi, respectivamente.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
NCBI-PUBMEDNCBIConsultando a seção 1. necessário para pesquisar a literatura
Um laptop/macbook ou computador pessoal com internet e um navegador da web.
g:ProfilerELIXIR infrastructurehttps://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gostReferindo-se à seção 4.10. necessário para o enriquecimento de GO:MF, GO:BP e GO:CC
Expressão gênica omnibusNCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/Referindo-se à seção 3.1. necessário para pesquisar o banco de dados de estudo de microarray
GEO2RNCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/Referindo-se à seção 3.2. necessária para analisar os dados usando a ferramenta GEO2R
GoogleGooglehttps://www.google.comReferindo-se à seção 1.1. necessária para pesquisar a literatura
HGNCHGNC é um comitê da Organização do Genoma Humano (HUGO)https://www.genenames.orgReferindo-se à seção 6.1 necessário para conhecer o símbolo genético oficial dos DEGs 
Instituto HPRDde Bioinformática, Bangluru  http://hprd.orgConsultando a seção 5.1 necessária para obter informações sobre a arquitetura da proteína 
OMIM&nbsp; Universidade Johns Hopkins, Baltimorehttp://www.omim.org/entryReferindo-se à seção 8.1 necessária para saber o ID OMIM de um determinado gene / DEG
Programa PanglossDesenvolvido por Chris Seidelhttp://www.pangloss.com/seidel/Protocols/venn.cgiReferindo-se à seção 4.9. necessário para gerar o diagrama de Venn
Laboratório PANTHERThomas na Universidade do Sul da Califórniahttp://www.pantherdb.org/geneListAnalysis.doReferindo-se à seção 4.10. necessário para o enriquecimento de GO:MF, GO:BP e GO:CC
ShinyGO Universidade Estadual de Dakota do Sulhttp://bioinformatics.sdstate.edu/goReferindo-se à seção 4.10. necessário para alocação de DEGs nos cromossomos
https://ncbi.nlm.nih.gov/pubmed

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