Artigo de método

Respirometria de Alta Resolução para Avaliação da Função Mitocondrial em Espermatozoides Humanos

DOI:

10.3791/65493

⸱

23 de junho de 2023

 ,  , 
1Departamento de Histología y Embriología, Unidad Académica Histología y Embriología, 2Departamento de Bioquímica, Unidad Académica Bioquímica, 3Centro de Investigaciones Biomédicas (CEINBIO), Facultad de Medicina, Universidad de la República

Neste artigo

Aviso de errata

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Resumo

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A análise da função mitocondrial espermática por respirometria de alta resolução permite medir o consumo de oxigênio de espermatozoides que se movem livremente em um sistema de câmara fechada. A técnica pode ser aplicada para medir a respiração em espermatozoides humanos, o que fornece informações sobre as características mitocondriais e integridade dos espermatozoides.

Resumo

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A qualidade do sêmen é frequentemente estudada pela análise seminal de rotina, que é descritiva e muitas vezes inconclusiva. A infertilidade masculina está associada à atividade mitocondrial alterada dos espermatozoides, de modo que a medição da função mitocondrial dos espermatozoides é um indicador da qualidade dos espermatozoides. A respirometria de alta resolução é um método de medir o consumo de oxigênio de células ou tecidos em um sistema de câmara fechada. Esta técnica pode ser implementada para medir a respiração em espermatozoides humanos e fornece informações sobre a qualidade e integridade das mitocôndrias espermáticas. A respirometria de alta resolução permite que as células se movam livremente, o que é uma vantagem a priori no caso dos espermatozoides. Esta técnica pode ser aplicada com espermatozoides intactos ou permeabilizados e permite o estudo da função mitocondrial intacta dos espermatozoides e da atividade de complexos de cadeias respiratórias individuais. O instrumento de oxigrafia de alta resolução usa sensores para medir a concentração de oxigênio juntamente com um software sensível para calcular o consumo de oxigênio. Os dados são usados para calcular índices respiratórios com base nas razões de consumo de oxigênio. Consequentemente, os índices são as proporções de duas taxas de consumo de oxigênio e são normalizados internamente para o número celular ou massa proteica. Os índices respiratórios são um indicador da função e disfunção mitocondrial dos espermatozoides.

Introdução

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Estima-se que a infertilidade masculina seja responsável por 40%-50% de todos os casos de infertilidade em casais1. A análise seminal convencional desempenha um papel crucial na determinação da fertilidade masculina; no entanto, aproximadamente 15% dos homens inférteis apresentam parâmetros espermáticos normais2. Além disso, a análise seminal de rotina fornece informações limitadas sobre a função espermática e não reflete defeitos sutis espermáticos3.

As mitocôndrias espermáticas têm uma estrutura especial, pois estão dispostas como uma bainha helicoidal ao redor dos fl....

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Protocolo

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Os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética da Faculdade de Medicina da Universidade da República, Montevidéu, Uruguai.

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Figura 1: Fluxo de trabalho para respirometria de alta resolução para avaliar a função mitocondrial em espermatozoides humanos intactos e permeabilizados. O protocolo foi dividido em quatro etapas distintas: 1) preparação da amostra, 2) calibração do oxigênio no instrumento Oroboros, 3) medição do consumo de....

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Resultados

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Determinação da concentração ótima de digitonina em espermatozoides
Neste protocolo, apresentamos o uso da HRR para monitorar em tempo real as mudanças no OXPHOS em espermatozoides humanos. Uma vez que o método pode ser usado para analisar espermatozoides intactos ou permeabilizados por digitonina, apresentamos primeiramente a padronização da concentração de digitonina necessária para permeabilizar os espermatozoides (Figura 3).

A digitonina é .......

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Discussão

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A HRR depende criticamente de várias etapas: (a) a manutenção do equipamento, (b) a calibração precisa dos sensores de oxigênio, (c) a titulação do desacoplador26 e, finalmente, (d) o uso adequado de índices que representem a função mitocondrial. A manutenção do equipamento é fundamental. Recomenda-se substituir as membranas do sensor polarográfico de oxigênio regularmente e corrigir o fundo instrumental. A lavagem extensiva após a coleta de espermatozoides das câmaras é essencial para a obtenção .......

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Gostaríamos de agradecer à clínica de Andrologia Fertilab, especialmente José María Montes e Andrea Torrents, por nos permitir o acesso aos doadores. Financiamento: A.C. é apoiado por bolsas da Universidad de la República (CSIC_2018, Espacio Interdisciplinario_2021). Financiamento adicional foi obtido do Programa de Desarrollo de Ciencias Básicas (PEDECIBA, Uruguai). P.I. e R.S. são apoiados pela Universidad de la República (I+D, CSIC 2014; I+D, CSIC 2016, Iniciación a la Investigación, CSIC 2019 e FMV_1_2017_1_136490 ANII- Uruguai). P.I. é apoiado pelo POS_FMV_2018_1_1007814 e CAP-UDELAR 2020. As figuras foram ilustradas com Biorender.com.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Albumina de soro bovino livre de ácidoSigma AldrichA8806
Adenosina 5'-difosfato monopotássio sal di-hidratadoSigma AldrichA5285
Animicina A de streptomyces sp.Sigma AldrichA8674
Cloreto de cálcioSigma AldrichC4901
carbonilo cianeto-P- trifluorometoxi-fenilhidrazonaSigma AldrichC2920
DatLab software versão 4,2Oroboros Instruments GmbHN / A
D-glicoseSigma AldrichG7021
DigitoninSigma AldrichD141
EGTASigma AldrichE4378
HEPESSigma AldrichH3375
L ácido glutâmicoSigma AldrichG1251
L ácido málicoSigma AldrichM1000
Sulfato de magnésioSigma AldrichM7506
Seringas de microlitroHamilton87900 ou 80400
Câmera para microscópioBasleracA780-75gc
Microscópio Eclipse E200 com contraste de fase 10X Ph+NikonN/A
Fosfato monopotássicoSigma AldrichP5655
MOPSSigma AldrichM1254
Oligomicina ASigma Aldrich75351
Oxygraph-2 KOroboros Instruments GmbHN/A
Cloreto de potássioSigma AldrichP3911
Power O2k-RespirômetroOroboros Intruments10033-01
RotenonaSigma AldrichR8875
SacaroseSigma AldrichS0389
Bicarbonato de sódioSigma AldrichS5761
Lactato de sódioSigma AldrichL7022
Piruvato de sódioSigma AldrichP2256
Analisador de classe de esperma 6.3.0.59 Evolution-SCA ResearchMicropticN/A
Câmara de contagem de espermatozóides DRM-600Millennium Sciences CELL-VUN/A
Sal dissódico de succinatoSigma AldrichW327700

Referências

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  1. Agarwal, A., Mulgund, A., Hamada, A., Chyatte, M. R. A unique view on male infertility around the globe. Reproductive Biology and Endocrinology. 13, 37(2015).
  2. Guzick, D. S., et al. Sperm morphology, motility, and concentration in f....

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Reimpressões e permissões

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Errata

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Formal Correction: Erratum: High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa
Posted by JoVE Editors on 9/26/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa. The Protocol and Representative Result sections were updated.

Step 2.4.12 of the Protocol was updated from:

Finally, inject 1 µL of 5 mM antimycin A (2.5 µM final concentration). This is a complex II inhibitor to discriminate between the mitochondrial and residual oxygen consumption (non-mitochondrial respiration). For the analysis of complex I, add 1 µL of 1 mM rotenone (0.5 µM final concentration), an inhibitor of this complex, instead of AA. Measure the oxygen consumption until the signal decreases and stabilizes.

to:

Finally, inject 1 µL of 5 mM antimycin A (2.5 µM final concentration). This is a complex III inhibitor to discriminate between the mitochondrial and residual oxygen consumption (non-mitochondrial respiration). For the analysis of complex I, add 1 µL of 1 mM rotenone (0.5 µM final concentration), an inhibitor of this complex, instead of AA. Measure the oxygen consumption until the signal decreases and stabilizes.

Figure 3 in the Representative Results section was updated from:

Oxygen concentration analysis; graphs showing O₂ levels vs. time and digitonin effect; data chart.
Figure 3: Determination of the optimal concentration of digitonin for the permeabilization of human sperm cells. The respiration rates were measured at 37 °C in MRM medium with glutamate, malate, and adenosine diphosphate. (A) Representative respiratory trace. The blue line is the O2 concentration, and the red line represents the O2 flow per volume correlated. (B) Mitochondria respiration rate means ± standard error, n = 4. The red arrow represents the optimal concentration. Abbreviation: dig = digitonin. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Oxygen consumption analysis; graph shows O₂ concentration and flux (A) and rate vs. digitonin (B).
Figure 3: Determination of the optimal concentration of digitonin for the permeabilization of human sperm cells. The respiration rates were measured at 37 °C in MRM medium with glutamate, malate, and adenosine diphosphate. (A) Representative respiratory trace. The blue line is the O2 concentration, and the red line represents the O2 flow per volume correlated. (B) Mitochondria respiration rate means ± standard error, n = 4. The red arrow represents the optimal concentration. Abbreviation: dig = digitonin. Please click here to view a larger version of this figure.

Etiquetas

High Resolution RespirometryMitochondrial FunctionHuman SpermatozoaSperm MitochondriaOxygen ConsumptionMale InfertilitySperm QualityRespiratory IndicesATP ProductionSperm Energy Metabolism

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