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Artigo de método

Abordagem única para isolar neutrófilos de medula óssea de rato com capacidade comparável

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DOI:

10.3791/65506

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26 de abril de 2024

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1Department of Cardiovascular Surgery, West China Hospital, Sichuan University, 2Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Sichuan Provincial Pancreatitis Centre, West China Hospital, Sichuan University, 3West China-Liverpool Biomedical Research Centre, West China Hospital, Sichuan University, 4Cardiovascular Surgery Research Laboratory, West China Hospital, Sichuan University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Esta pesquisa descreve duas técnicas para isolar abundantes armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) da medula óssea de ratos. Um método combina um kit comercial de isolamento de neutrófilos com centrifugação por gradiente de densidade, enquanto o outro emprega apenas centrifugação por gradiente de densidade. Ambas as abordagens produzem NETs funcionais superando as dos neutrófilos do sangue periférico.

Resumo

O objetivo primário desta pesquisa foi desenvolver uma abordagem confiável e eficiente para isolar armadilhas extracelulares (NETs) de neutrófilos da medula óssea de ratos. Esse esforço surgiu devido às limitações associadas ao método tradicional de extração de TNEs do sangue periférico, principalmente devido à escassez de neutrófilos disponíveis para isolamento. O estudo revelou duas metodologias distintas para a obtenção de neutrófilos de rato a partir da medula óssea: um procedimento simplificado de uma etapa que produziu níveis de purificação satisfatórios e um processo de duas etapas mais demorado que exibiu maior eficiência de purificação. É importante ressaltar que ambas as técnicas produziram uma quantidade substancial de neutrófilos viáveis, variando entre 50 a 100 milhões por rato. Essa eficiência refletiu os resultados obtidos com o isolamento de neutrófilos de fontes humanas e murinas. Significativamente, neutrófilos derivados da medula óssea de ratos exibiram habilidades comparáveis para secretar NETs quando comparados com neutrófilos obtidos de sangue periférico. No entanto, o método baseado na medula óssea produziu consistentemente quantidades notavelmente maiores de neutrófilos e NETs. Esta abordagem demonstrou o potencial de obter quantidades significativamente maiores desses componentes celulares para futuras aplicações a jusante. Notavelmente, esses NETs isolados e neutrófilos são promissores para uma variedade de aplicações, abrangendo os domínios da inflamação, infecção e doenças autoimunes.

Introdução

Os neutrófilos constituem um subconjunto crítico de leucócitos que desempenham um papel fundamental na resposta imune inata. Caracterizam-se por núcleos multilobados e grânulos contendo várias proteases e peptídeos antimicrobianos1. Os neutrófilos funcionam principalmente através da degranulação, fagocitose e formação de NETs. A observação dos TNEs foi feita pela primeira vez por Takei e col. em 1996, durante um experimento em que neutrófilos foram estimulados com acetato de miristato de forbol (PMA)2. Posteriormente, o processo de formação da NET foi denominado "NETosis" por Brinkmann et al.3 em 2004. Sua pesquisa iluminou ainda mais o papel crucial dos NETs em respostas antimicrobianas mediadas por neutrófilos. NETs são estruturas semelhantes a teias compostas por cromatina, histonas e proteínas antimicrobianas que são liberadas de neutrófilos ativados em resposta a estímulos infecciosos e inflamatórios. As NETs podem imobilizar e matar patógenos invasores, aprisionando-os e expondo-os a uma alta concentração de peptídeos e proteases antimicrobianas 1,3. Além disso, os TNEs contribuem para a depuração das células apoptóticas e participam da resolução da inflamação. Estudos recentes também indicam que a formação excessiva de TNEs ou a degradação prejudicada do SNE podem levar a dano tecidual, doenças autoimunes, trombogênese e revascularização prejudicada4,5,6,7,8,9,10.

O papel patogênico dos TNEs na fibrose não controlada após infarto do miocárdio e na formação de aneurismas ventriculares tem sido demonstrado através da expansão da fibrose perivascular 4,11. O modelo de infarto do miocárdio e o isolamento de neutrófilos da medula óssea em camundongos estão bem estabelecidos. Os leucócitos polimorfonucleares (PMN), um tipo de glóbulo branco abundante no sangue humano, servem como uma excelente fonte para isolar neutrófilos humanos. Este método elimina a necessidade de colheita de medula óssea, aumentando assim a segurança e eficiência.

Os TNEs também desempenham um papel na fibrilação atrial associada ao remodelamento cardíaco. No entanto, animais de grande porte, como cães e porcos, foram utilizados para modelar a fibrilação atrial, uma vez que os camundongos não possuem um átrio considerável o suficiente para estabelecer um ciclo de reentrada ou o modelo de FA, a menos que canais iônicos específicos ou vias de sinalização sejam derrubados ou nocauteados12. Embora seja possível induzir fibrilação atrial em ratos e isolar neutrófilos do sangue periférico de ratos, como descrito anteriormente, os pesquisadores encontraram uma limitação pela qual apenas 2 x 105-5 x10 5 neutrófilos poderiam ser isolados do sangue periférico (10 mL por rato). A extração de NETs suficientes em cada momento exigiu aproximadamente 10-25 ratos (5 x 106 neutrófilos no total), resultando em um processo demorado, caro e, muitas vezes, de baixo rendimento13. A esse respeito, Li He e colaboradores apresentam uma estratégia orientada para a medula óssea para obter NETs adequados deratos14. Em seu artigo, eles fornecem uma descrição abrangente do isolamento de neutrófilos da medula óssea de ratos e comparam as capacidades de secreção de NET de neutrófilos periféricos e de medula óssea de ratos. Os dois métodos delineados atendem a objetivos experimentais distintos, ambos resultando em quantidades suficientes de neutrófilos da medula óssea de ratos, enquanto reduzem o número de ratos necessários. O método de isolamento em duas etapas demonstrou purificação superior de neutrófilos, enquanto o método de uma etapa mostrou-se eficiente em termos de tempo com níveis aceitáveis de purificação. Além disso, os pesquisadores compararam a formação de NETosis e NET entre neutrófilos da medula óssea de ratos e seus homólogos periféricos, encontrando potência igual com PMN. Esses achados contribuem significativamente para estudos relacionados a neutrófilos sobre fibrilação atrial e ressaltam a importância da seleção flexível de diferentes fontes para o isolamento de neutrófilos em vários animais experimentais com diferentes distribuições de neutrófilos.

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Protocolo

O estudo foi realizado sob uma licença de projeto (No. 20211404A) concedida pelo Comitê de Ética Animal do West China Hospital, Sichuan University, em conformidade com as diretrizes do Comitê de Ética Animal do West China Hospital, Sichuan University para o cuidado e uso de animais. De acordo com as diretrizes éticas, os ratos utilizados neste estudo foram mantidos em ambiente controlado com ciclo claro/escuro de 12 h, temperatura de 22-24 °C e umidade de 50%-60%. Os ratos tiveram acesso a ração e água ad libitum. Os animais utilizados neste estudo foram ratos machos Sprague Dawley (SD) com 6-8 semanas de idade, pesando cerca de 250 g e livres de patógenos específicos. Os animais foram obtidos de fonte comercial (ver Tabela de Materiais).

1. Isolamento de neutrófilos de rato

  1. Coleta de medula óssea
    1. Coloque o rato num recipiente apropriado para anestesia (ver Tabela de Materiais). Administrar isoflurano a 3% no rato até que o animal fique inconsciente. Verifique a ausência de uma resposta a uma pinça do dedo do pé ou da cauda para garantir a profundidade da anestesia.
    2. Uma vez que o rato está profundamente anestesiado, execute o deslocamento cervical colocando o rato em suas costas e segurando sua cauda com uma mão enquanto agarra a cabeça com a outra mão. Deslocar o pescoço rápida e firmemente aplicando uma força súbita e forte para cima na cauda enquanto puxa a cabeça para baixo até que a coluna cervical seja cortada. Aguarde a confirmação do óbito, como cessação da respiração e falta de batimentos cardíacos, antes de prosseguir com a coleta ou descarte de tecidos.
    3. Mergulhe o rato em etanol 75% e deixe-o descansar por alguns minutos para esterilizar o pelo e a pele. Deite o rato de costas e corte os membros inferiores no quadril para proteger a cabeça do fêmur. Use uma tesoura de dissecção para cortar o ligamento na articulação do hock e dobrar a articulação do joelho para trás para expor o fêmur e a tíbia.
    4. Usando pinças e tesouras, remova cuidadosamente quaisquer músculos, tendões e outros tecidos conectados aos ossos. Lave os ossos com a Solução Balanceada de Sal de Hank (HBSS) para remover quaisquer restos de tecido e sangue. Repita mais duas vezes, totalizando três lavagens. Coloque os ossos limpos em um recipiente estéril.
    5. Use uma seringa de 5 ou 10 mL com uma agulha para perfurar a medula através de ambas as extremidades do osso para soltar a matriz da medula. Lave a medula óssea com 10-15 mL de meio do Roswell Park Memorial Institute (RPMI) com outra seringa, até que nenhuma medula óssea visível possa ser liberada.
    6. Centrifugar as células da medula óssea a 300 x g durante 10 minutos a 20 °C. Adicionar 5-10 ml de tampão de lise de glóbulos vermelhos (ver Tabela de Materiais) para ressuspender as células e incubar à temperatura ambiente durante 3 minutos. Adicionar 4 vezes o volume de HBSS à mistura. Centrifugar as células a 600 x g por 5 min à temperatura ambiente, descartar o sobrenadante com uma pipeta e usar o pellet resultante para uso posterior.
  2. Isolamento de neutrófilos da medula óssea
    1. Para o método de duas etapas, execute as seguintes etapas adicionais:
      1. Isolar células da medula óssea usando o kit de isolamento de neutrófilos de rato comercializado seguindo as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
      2. Preparar um gradiente de densidade colocando em camadas 2 mL de reagente percoll a 55% (ver Tabela de Materiais), 2 mL de 65% do reagente, 2 mL de reagente a 70% e 2 mL de reagente a 80% em um novo tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugar o tubo a 800 x g durante 40 minutos a 20 °C, com a aceleração ajustada para 5 e a desaceleração ajustada para 0 ou 1.
      3. Coletar a camada de gradiente de 70%, incluindo as camadas de células no limite entre 65% e 70% de reagente de gradiente, usando uma pipeta estéril. Transfira a suspensão celular para um novo tubo centrífugo de 15 mL. Adicione 15 mL de HBSS no tubo e inverta suavemente o tubo várias vezes para lavar as células. Centrifugar o tubo a 300 x g por 10 min à temperatura ambiente para peletizar as células.
    2. Para o método de uma etapa, execute as seguintes etapas adicionais:
      1. Submeter as células da medula óssea aos gradientes sem usar o kit de isolamento de neutrófilos de rato.
      2. Coletar a camada de gradiente de 70%, incluindo as camadas de células no limite entre gradiente de 65% e 70%, usando uma pipeta estéril. Transfira a suspensão celular para um novo tubo centrífugo de 50 mL e lave as células com HBSS. Centrifugar o tubo a 400 x g por 5 min à temperatura ambiente para pellet as células.
      3. Contar os neutrófilos isolados usando um hemocitômetro e avaliar a viabilidade usando a coloração com azul de tripano.
        NOTA: O protocolo pode ser modificado dependendo do número de ratos e do número desejado de neutrófilos isolados. Uma quantidade aceitável de ossos é obtida de três ratos quando este método é usado pela primeira vez em um novo ambiente experimental. Todos os procedimentos devem ser realizados em condições estéreis. O isolamento dos neutrófilos da medula óssea deve ser realizado o mais rápido possível para minimizar o dano celular e a perda de viabilidade.

2. Aquisição de NETs de ratos

  1. Ressuspender 0,5 x 108-1 x 108 neutrófilos isolados em meio RPMI de 4 mL (suplementado com soro fetal bovino (SFB) a 10% e penicilina-estreptomicina a 1%) em placa de Petri estéril de 10 cm.
  2. Adicionar 500 nM PMA (ver Tabela de Materiais) à suspensão de neutrófilos para induzir NETosis. Incubar durante 3 h a 37 °C e 5% CO2.
  3. Para o controle negativo, adicionar DNase I (10 U/mL) na suspensão de neutrófilos para degradar os TNEs secretados.
  4. Para colher as NETs, retire o meio e lave suavemente as NETs presas à placa de Petri com HBSS. Em seguida, utilizar lavagem intensa com 4 mL de meio fresco para cada placa para desprender os NETs da placa.
  5. Recolher o meio de lavagem e a pipeta com frequência para ressuspensão completa das NETs.
  6. Centrifugar a suspensão a 300 × g durante 10 min a 20 °C para remover quaisquer células flutuantes.
  7. Transfira a suspensão que contém os TNEs para um tubo estéril e armazene a -20 °C para uso posterior dentro de 2 semanas.
    NOTA: NETs são sensíveis à degradação, por isso recomenda-se usar material recém-colhido para obter melhores resultados.

3. Verificação da presença de NETs

  1. Fixar as células (do passo 2.4) em lamínulas com paraformaldeído a 4% durante 15 minutos e NETs (do passo 2.7) durante 30 min a 1 h.
  2. Inverta a lamínula para uma gota PBS/PBST em um suporte de tubo de ensaio coberto por filme de parafina e repita o processo de lavagem três vezes por 5 min cada.
  3. Permeabilizar as células com Triton-X-100 a 0,5% por 10 min à temperatura ambiente e lavar três vezes em PBS/PBST por 1 min cada. Selar as células com o soro de burro normal a 10% (ver Tabela de Materiais) à temperatura ambiente durante 1 hora.
  4. Incubar as células com o anticorpo anti-elastase neutrofílica do rato e o anticorpo anti-mieloperoxidase do rato (ver Tabela de Materiais) durante a noite a 4 °C. Em seguida, lave a lamínula em PBS/PBST três vezes por 5 min cada.
  5. Incubar as células com o anticorpo secundário A488-conjugado burro anti-coelho IgG (H + L), A594-burro conjugado anti-ratinho IgG (H + L) e A594-conjugado cabra anti-Mouse IgG1 (ver Tabela de Materiais) à temperatura ambiente durante 1 h no escuro. Em seguida, lave a lamínula em PBS/PBST três vezes por 5 min cada.
  6. Núcleos de células coradas e esqueletos NET com 10 mg/mL de DAPI. Em seguida, lave a lamínula em PBS/PBST três vezes por 5 min cada.
  7. Coloque uma gota de meio de montagem em uma lâmina de vidro e inverta a tampa com células sobre ela. Deixe secar por 1 h para análise microscópica com lentes de imersão; caso contrário, está pronto para inspeção.
    OBS: Muito cuidado deve ser tomado ao manipular as NETs, mesmo após a fixação, pois elas são extremamente frágeis e podem ser facilmente perdidas durante o preparo.

4. Quantificação das NETs

  1. Preparar o tampão Tris-EDTA (TE) e a solução de trabalho PicoGreen (reagente de ensaio dsDNA) de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais).
  2. Preparar padrões diluindo o DNA estoque para concentrações de 1 ng/mL, 10 ng/mL, 100 ng/mL e 1 μg/mL.
    NOTA: Para quantificar a concentração de NETs, foi utilizado o kit de ensaio dsDNA (ver Tabela de Materiais), seguindo as orientações do fabricante. O tampão Tris-EDTA (TE) e os reagentes para o ensaio de dsDNA foram preparados usando um volume de 19 vezes de água bidestilada ou um volume de 199 vezes de tampão de ET, respectivamente. Posteriormente, soluções padrão (1 ng/mL, 10 ng/mL, 100 ng/mL e 1 μg/mL) foram preparadas, e cada 50 μL da amostra foi combinado com 450 μL de tampão ET.
  3. Adicionar 50 μL de cada amostra a 450 μL de tampão TE.
  4. Adicionar 100 μL de padrões ou amostras juntamente com um volume igual de solução de trabalho de reagente de ensaio a cada poço em uma placa de 96 poços, incluindo padrões e amostras.
  5. Incubar a placa à temperatura ambiente por 2-5 min, evitando a luz direta.
  6. Leia as amostras usando um leitor de microplacas de fluorescência com um espectro de emissão de cerca de 530 nm e um espectro de absorbância de cerca de 480 nm.
  7. Calcular a concentração de NETs em cada amostra usando a curva padrão gerada pelas normas.

5. Análise da secreção de NETs por citometria celular

  1. Adicionar coloração nuclear (ver Tabela de Materiais) às células incubadas na placa de 96 poços para atingir uma concentração final de 10 ng/mL e incubar por 30 min.
  2. Adicione a coloração de DNA livre de células (cfDNA, ver Tabela de Materiais) às células para atingir uma concentração final de 300 nM e incube por 10 min.
  3. Misture os corantes fluorescentes por pipetagem suave. Não descarte o sobrenadante nem lave o pellet.
  4. Coloque a placa de amostra no instrumento do citômetro.
  5. Defina os parâmetros de foco e tempo de exposição para os diferentes canais: azul (ex: 377/50 nm, em: 470/22 nm), geralmente com a exposição de 30.000 ms, verde (ex: 483/32 nm, eM: 536/40 nm) geralmente com a exposição de 5.000 ms.
  6. Capture imagens altamente uniformes de toda a placa em diferentes canais.
  7. Analise a contagem de manchas nucleares para diferentes grupos. Se forem semelhantes, a secreção de NETs pode ser determinada pela contagem de cfDNA.

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Resultados

O protocolo aqui descrito delineia dois métodos distintos, cada um caracterizado por purificação melhorada ou etapas simplificadas. Ambos os métodos produziram aproximadamente 0,5 x 108-1 x 108 neutrófilos por rato. A análise por citometria de fluxo, empregando o kit de detecção de apoptose da anexina V-FITC/PI, exibiu viabilidade celular acima de 90%, comparável às de camundongos e humanos (Figura 1). Enquanto a contaminação linfocitária parecia inevitável durante o is...

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Discussão

O isolamento de neutrófilos constitui uma etapa fundamental no estudo da NETosis, onde a seleção de um método de isolamento apropriado é fundamental para a obtenção de resultados confiáveis. Um fator importante a pesar é a ocorrência de contaminação linfocitária durante o isolamento. Enfrentar esse desafio é particularmente significativo ao isolar neutrófilos de rato da medula óssea. Apesar da distinta faixa de densidade de neutrófilos (1,0814-1,0919, com pico em 1,0919) em relação aos linfócitos (1,0337-1,0765, com pico...

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Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

Financiamento: Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (Nos. 82004154, 81900311, 82100336 e 81970345).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
A488-conjugado burro anti-coelho IgG(H + L)Invitrogen, EUAA32790
A594-conjugado burro anti-rato IgG(H + L)Invitrogen, EUAA32744
A594-conjugado cabra anti-rato IgG1 Invitrogen, EUAA21125
Mieloperoxidase anti-ratoAbcam, Inglaterraab134132
Elastase de neutrófilos anti-ratoAbcam, Inglaterraab21595
Citômetro de imagem CeligoNexelom, EUA200-BFFL-5C
DNase ISigma, EUA10104159001
soro fetal bovino (FBS)Gibco, EUA10099141C
Hank ' s Solução salina balanceada (HBSS)Gibco, EUAC14175500BT
HoechstThermofisher, EUA33342
IsofluranoRWD, ChinaR510-22-10
MowiolSigma, EUA81381
Soro de burro normalSolarbio, ChinaSL050
Paraformaldeídobiosharp, ChinaBL539A
Penicilina-estreptomicinaHyclone, EUASV30010
PercollGE, EUAP8370-1L
Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA)Sigma, EUA  P1585
Kit de ensaio Picogreen dsDNAInvitrogen, EUAP11496
Kit de isolamento de neutrófilos de ratoSolarbio, ChinaP9200
Tampão de lise de glóbulos vermelhosSolarbio, ChinaR1010
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) mídiaHyclone, EUASH30809.01B
RWD Máquina Universal de Anestesia AnimalRWD, ChinaR500
Sprague Dawley (SD) ratosDashuo, China
SytoxGreenThermofisher, EUAS7020
Tris-EDTA (TE) bufferSolarbio, ChinaT1120
Triton-X-100Biofroxx, alemão1139ML100

Referências

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