Identificação de Peptídeos de Pequenas Vesículas Extracelulares de Macrófagos Derivados da Medula Óssea

Summary

Este protocolo descreve um procedimento para isolar pequenas vesículas extracelulares de macrófagos por ultracentrifugação diferencial e extrair o peptidoma para identificação por espectrometria de massas.

Abstract

Pequenas vesículas extracelulares (EVs) são tipicamente secretadas pela exocitose de corpos multivesiculares (MVBs). Estas nanovesículas com um diâmetro de <200 nm estão presentes em vários fluidos corporais. Esses sEVs regulam vários processos biológicos, como transcrição e tradução de genes, proliferação e sobrevivência celular, imunidade e inflamação por meio de suas cargas, como proteínas, DNA, RNA e metabólitos. Atualmente, várias técnicas têm sido desenvolvidas para o isolamento de sEVs. Dentre eles, o método baseado em ultracentrifugação é considerado o padrão-ouro e é amplamente utilizado para o isolamento de sEVs. Os peptídeos são naturalmente biomacromoléculas com menos de 50 aminoácidos de comprimento. Esses peptídeos participam de uma variedade de processos biológicos com atividade biológica, como hormônios, neurotransmissores e fatores de crescimento celular. O peptidoma destina-se a analisar sistematicamente peptídeos endógenos em amostras biológicas específicas por cromatografia líquida-espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS). Aqui, introduzimos um protocolo para isolar sEVs por ultracentrifugação diferencial e extraímos peptidoma para identificação por LC-MS/MS. Este método identificou centenas de peptídeos derivados de sEVs de macrófagos derivados da medula óssea.

Introduction

Pequenas vesículas extracelulares (EVs) com diâmetro inferior a 200 nm estão presentes em quase todos os tipos de fluidos corporais e são secretadas por todos os tipos de células, incluindo urina, suor, lágrimas, líquido cefalorraquidiano e líquido amniótico¹. Inicialmente, os sEVs foram considerados como recipientes para disposição de resíduos celulares, o que levou a pesquisas mínimas na década subsequente². Recentemente, evidências crescentes indicam que os sEVs contêm proteínas específicas, lipídios, ácidos nucléicos e outros metabólitos. Essas moléculas são transportadas para as células-alvo³....

Protocol

1. Isolamento de pequenas vesículas extracelulares

NOTA: Efectuar toda a centrifugação nos passos 1.1-1.11 a 4 °C.

1. Preparação de soro fetal bovino (FBS) livre de sEVs: Centrifugar FBS durante a noite a 110.000 × g a 4 °C através de uma ultracentrífuga (ver Tabela de Materiais) para remover sEVs endógenos. Recolher o sobrenadante, filtrar, esterilizar-lhe com uma membrana de ultrafiltração de 0,2 μm e armazená-lo a -20 °C.
2. Placa cerca de 3 x 10⁷ macrófagos imortalizados derivados da medula óssea (iBMDMs) em uma placa de cultura de 150 mm e adicionar 20 mL de meio de cu....

Results

Para os sEVs isolados por ultracentrifugação diferencial (Figura 1), avaliamos sua morfologia, distribuição granulométrica e marcadores proteicos de acordo com a Sociedade Internacional de Vesículas Extracelulares (ISEV)¹⁷.

Primeiramente, a morfologia das EVs foi observada por MET, mostrando uma estrutura típica em forma de taça (Figura 2A). NTA mostrou que os sEVs isolados estavam concentrados principalmente e.......

Discussion

Ao investigar a função de sEVs, é imperativo obter sEVs de alta pureza a partir de amostras biológicas complexas para evitar quaisquer contaminações potenciais. Uma variedade de métodos para o isolamento de sEVs tem sido desenvolvida¹³, e entre esses métodos, métodos baseados em ultracentrifugação diferencial têm mostrado pureza relativamente alta de sEVs. Neste estudo, 200 mL de sobrenadante celular foram coletados por 6 h, e cerca de 200-300 μg de sEVs foram obtidos por ultracentrifugação difere.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kit de ensaio de proteína BCA	Beyotime Technology	P0012
CD9	Beyotime Technology	AF1192
Tubo de filtro centrífugo	Millipore	UFC5010BK
Frascos de centrífuga polipropileno	Beckman Coulter	357003	Centrífuga de alta velocidade
Substrato quimioluminescente	Thermo Fisher Scientific	34580
Ditiotreitol	Solarbio	D8220	100 g
de meio de cultura DMEM	Cell World	N? A
Tecnologia de Sinalização Celular	GRP94	20292
Centrífuga de alta velocidade	Beckman Coulter	Avanti JXN-26	Rotor de centrífuga (JA-25.50)
Macrófagos derivados da medula óssea imortalizados (iBMDM)	Instituto Nacional de Ciências Biológicas, China		Fornecido pelo Dr. Feng Shao (Instituto Nacional de Ciências Biológicas, China)
Iodoacetamida	Tubo	l1149	5 g
	Beckman Coulter	357448	1.5 mL, Ultracentrífuga de mesa
sistema LC de alto desempenho	Thermo Fisher Scientific	EASY-nLC 1000
Análise de rastreamento de nanopartículas	Malvern Panalytical	NanoSight LM10	NanoSight NTA3.4
Orbitrap Q Espectrômetro de massa Exactive HF-X	Thermo Fisher Scientific	N/A
Solução salina tamponada com fosfato	Solarbio	P1020
Tubos de centrífuga de polialômeros	Beckman Coulter	326823	Ultracentrífuga
Inibidor de protease	Bimake	B14002
Concentrador de vácuo	SpeedVac Eppendorf	Concentrator plus
Ultracentrífuga de mesa	Beckman Coulter	Optima MAX-XP	Rotor de ultracentrífuga (TLA 55)
Microscópio eletrônico de transmissão	HITACHI	H-7650B
TSG101	Sigma	AF8258
Ultracentrífuga	Beckman Coulter	Optima XPN-100	Rotor de ultracentrífuga (SW32 Ti)
Disruptor de célula ultrassônico	Scientz	SCIENTZ-IID
Gerador de imagens Western Blot	Bio-Rad	ChemiDocXRs	Laboratório de imagens 4.0 (beta 7)
β-actina	Sigma	A3853