Artigo de método

Bioanálise de espalhamento Raman sem superfície com base em nanossondas de Au@Carbon pontos

DOI:

10.3791/65524

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9 de junho de 2023

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1MOE Key Laboratory of Laser Life Science & Guangdong Provincial Key Laboratory of Life Science, College of Biophotonics, South China Normal University

Neste artigo

Resumo

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Neste estudo, desenvolvemos uma nanossonda de impressão digital baseada em espalhamento Raman (SERS) de baixo custo com biocompatibilidade favorável para mostrar bioimagem de células vivas livre de marcação e detectar duas cepas bacterianas, mostrando em detalhes como obter espectros SERS de células vivas em um método não destrutivo.

Resumo

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A tecnologia de espalhamento Raman aprimorado por superfície (SERS) tem atraído cada vez mais atenção no campo biomédico devido à sua capacidade de fornecer informações moleculares de impressões digitais de amostras biológicas, bem como seu potencial em análises de célula única. Este trabalho visa estabelecer uma estratégia simples para bioanálise SERS livre de marcação baseada em nanossondas de Au@carbon pontos (Au@CDs). Aqui, CDs derivados de polifenóis são utilizados como redutor para sintetizar rapidamente nanoestruturas de Au@CD núcleo-casca, o que permite um poderoso desempenho SERS mesmo quando a concentração de azul de metileno (MB) é tão baixa quanto 10-9 M, devido ao mecanismo cooperativo de realce Raman. Para a bioanálise, Au@CDs pode servir como um nanossensor SERS exclusivo para identificar os componentes celulares de bioamostras (por exemplo, células cancerosas e bactérias). As impressões digitais moleculares de diferentes espécies podem ser distinguidas após a combinação com a análise de componentes principais. Além disso, Au@CDs também permitem imagens SERS sem marcação para analisar perfis de composição intracelular. Essa estratégia oferece uma bioanálise SERS viável e livre de marcas, abrindo uma nova perspectiva para o nanodiagnóstico.

Introdução

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A análise unicelular é essencial para o estudo da revelação da heterogeneidade celular e para a avaliação do estado abrangente da célula. A resposta instantânea da célula ao microambiente também justifica a análise de célula única1. No entanto, existem algumas limitações para as técnicas atuais. A detecção de fluorescência pode ser aplicada à análise de célula única, mas é limitada pela baixa sensibilidade. Outros desafios surgem do complicado fundo de fluorescência das células e do fotoclareamento por fluorescência sob irradiação de longa duração2. O espalhamento Raman intensificado por superfície (SERS) pode se qualificar em termos de análise de célula única devido às suas vantagens, incluindo (1) refletir a informação intrínseca da impressão digital molecular e a situação instantânea, (2) sensibilidade superficial ultra-alta, (3) detecção multiplex conveniente, (4) alta fotoestabilidade, (5) detecção pode ser quantificada para análise comparativa, (6) evitar a autofluorescência celular com a excitação do comprimento de onda NIR, (7) a detecção pode ser realizada em um aquoso celular e (8) a detecção pode ser direcionada para uma região específica dentro da célula 3,4,5.

Existem dois mecanismos amplamente reconhecidos para entender o SERS como um fenômeno fundamental: o realce eletromagnético (ME) como razão dominante e o realce químico (CM). EM refere-se, em uma dada frequência do campo excitante, à oscilação de elétrons coletivos impulsionados por ondas eletromagnéticas quando a frequência da luz incidente coincide com a frequência de elétrons livres oscilando no metal, dando origem à ressonância plasmônica de superfície (SPR). Quando a SPR localizada (LSPR) ocorre através do laser incidente colidindo com as nanopartículas metálicas (NPs), leva à absorção ou espalhamento ressonante da luz incidente. Consequentemente, a intensidade do campo eletromagnético superficial dos NPs metálicos pode ser aumentada em duas a cinco ordens4. No entanto, a chave para o enorme aprimoramento no SERS não é um único NP de metal, mas a lacuna entre dois NPs, o que cria pontos quentes. O MC é gerado a partir de dois lados, incluindo (1) interações entre moléculas-alvo e NPs metálicos e (2) moléculas-alvo capazes de transferir elétrons de/para NPs metálicos 4,5. Detalhes mais exaustivos podem ser encontrados nesses artigos de revisão 4,5. Vários métodos promissores para biosensoriamento e imagem de SERS em células vivas foram apresentados na literatura anterior, por exemplo, a detecção de células apoptóticas6, proteínas em organelas7, miRNAs intracelulares8, membranas lipídicas celulares9,citocinas10 e metabólitos11 em células vivas, bem como a identificação e monitoramento de células por imagens confocais SERS2, 11,12,13. Curiosamente, o SERS livre de rótulos apresenta a vantagem única do SERS, que pode descrever espectros moleculares internos5.

Um grande problema para o SERS sem rótulo é um substrato racional e confiável. Os substratos SERS típicos são NPs de metais nobres devido à sua excelente capacidade de espalhar muita luz14. Atualmente, cada vez mais atenção é dada aos nanocompósitos devido às suas notáveis propriedades físico-químicas e biocompatibilidade. Mais significativamente, os nanocompósitos podem apresentar melhor atividade de SERS devido ao intenso EM induzido pelos pontos quentes nos nanohíbridos e ao aumento químico adicional proveniente de outros materiais não metálicos15. Por exemplo, Fei e col. usaram pontos quânticos (QDs) MoS 2 como redutores para sintetizar nanocompósitos Au NP@MoS2QD para imagens SERS de infravermelho próximo (NIR) livres de marcação de células de câncer de mama 4T1 de camundongo (células 4T1)16. Além disso, Li e col. fabricaram um substrato SERS 2D consistindo de NPs de Au e nanofolhas de ditelureto de háfnio 2D para medidas SERS livres de rótulos de bactérias patogênicas transmitidas por alimentos17. Recentemente, pontos de carbono (CDs), bons doadores de elétrons, têm sido usados como redutores sem outros redutores ou irradiação para sintetizar nanossondas de Au@carbon pontos (Au@CDs)18, que têm sido relatados como materiais eficientes para aumentar a atividade do SERS com base no efeito de transferência de carga (CT) entre núcleos de Au e cascas de CD19,20. Mais do que isso, os CDs são reconhecidos como o agente de tampamento e um estabilizador para evitar que os NPs de Au agreguem21. Além disso, abre mais possibilidades de reações com analitos, pois pode fornecer um grande número de sítios de ligação e ativos20. Aproveitando o exposto, Jin e col. desenvolveram um método rápido e controlável para fabricação de NPs Ag@CD com propriedades SERS únicas e excelentes atividades catalíticas para monitorar reações catalíticas heterogêneas em tempo real18.

Neste trabalho, foi demonstrado um método fácil e de baixo custo para a fabricação de substratos SERS Au@CD core-shell para identificar componentes celulares e bioimagem de células vivas SERS livres de marcação, bem como para detectar e diferenciar Escherichia coli (E. coli) e Staphylococcus aureus (S. aureus), o que é promissor para o diagnóstico precoce da doença e uma melhor compreensão dos processos celulares.

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Protocolo

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1. Fabricação de Au@CDs

NOTA: A Figura 1 ilustra um procedimento de fabricação para Au@CDs.

  1. Preparar solução de CD usando ácido cítrico (CA) e ácido gálico (GA) através de um procedimento típico de tratamento hidrotérmico18. Adicionar 100 μL de 3,0 mg mL-1 da solução de CD preparada em 200 μL de ácido cloroáurico 10 mM (HAuCl4) (ver Tabela de Materiais) à temperatura ambiente durante 10 s até se produzir uma suspensão roxa.
  2. Centrifugar a suspensão roxa a 4.000 × g por 10 min à temperatura ambiente e remover suavemente o sobrenadante usando uma pipeta se a remoção dos coloides Au@CD for difícil.
  3. Ressuspender o Au@CDs com 200 μL de água deionizada (resistividade de 18,2 MΩcm) para lavar o excesso de CDs.
  4. Repetir o passo 1.2 e obter os NP núcleo-casca, redispersos em 100 μL de água deionizada, e armazenar a 4 °C. Os NPs podem ser armazenados por 1 mês.

2. Caracterização da Au@CDs

  1. Microscopia eletrônica de transmissão (MET)
    1. Deixe as amostras de CD e Au@CD durante a noite a -80 °C para liofilizar a partir de uma solução congelada e esmague após liofilização em pó.
    2. Dispersar adequadamente as amostras de pó obtidas na água deionizada por sonicação, a 100% de potência, por 5 min.
    3. Solte algumas gotas da suspensão da amostra em uma grade de MET revestida com coberta com um filme de carbono rendado e capture imagens após a secagem usando um microscópio eletrônico de transmissão a uma tensão de aceleração de 200 kV (consulte a Tabela de Materiais).
  2. Espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR)
    1. Repita a etapa 2.1.1 para obter amostras de energia, triture algumas partículas de KBr pré-secas em pós em uma argamassa, adicione uma pitada da amostra e misture com os pós de KBr simultaneamente para a caracterização de IV16.
  3. Espectroscopia de absorbância ultravioleta-visível-infravermelho próximo (UV-vis-NIR)
    1. Preparar a suspensão de CDs e Au@CDs com concentração adequada para garantir que a absorbância seja menor que um e realizar a caracterização UV-vis-NIR16.
  4. Espectros Raman
    1. Ligue o laser semicondutor de 785 nm, com potência de laser de 10 mW e ampliação de 20x. Defina a duração da exposição para 5 s e o número de acumulações para três.
    2. Adicionar um volume igual de amostras de Au@CDs preparadas em 5 μL de solução de azul de metileno (MB) e misturar completamente.
    3. Coloque uma gota de suspensão sobre o substrato de latão para coletar os espectros SERS.

3. Cultura celular

  1. Cultivar células de carcinoma pulmonar epitelial humano (células A549, passadas em laboratório) em meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) e 1% de penicilina-estreptomicina e incubar em estufa umidificada a 37 °C com 5% de CO2.
  2. Semeando as células em placas de 96 poços (1 × 105 células/poço) e tratar com Au@CDs em diferentes concentrações na faixa de 20-100 μM. Use um kit de ensaio CCK-8 para medir a viabilidade celular (consulte Tabela de Materiais). Três duplicatas independentes são usadas em cada tratamento.
  3. Para realizar os experimentos SERS, prossiga seguindo as etapas abaixo:
    1. Coloque um chip de safira estéril (ver Tabela de Materiais) nas placas de 12 poços e, em seguida, semeie as células em um único poço com 1 mL de meio. Incubar as placas em uma incubadora umidificada a 37 °C com 5% de CO2durante a noite para atingir 70%-80% de confluência.
    2. Adicione o Au@CDs no único poço e incube por 4-6 h.
      NOTA: Antes da incubação, testar a estabilidade dos substratos, especialmente NPs da fase de solução. Esses materiais são suscetíveis à degradação por processos de dissolução, agregação e sedimentação durante o armazenamento e uso, o que pode diminuir as perdas de EM e diminuir a atividade de SERS. Mais significativamente, para a captação celular, poderia ser amplamente afetada pelo tamanho dos PNs22.
    3. Durante a incubação, substratos entrarão nas células através da captação endocítica. Após a incubação, observe as células em um microscópio óptico até que algumas partículas pretas sejam vistas dentro das células.
      NOTA: Se a intensidade do SERS for fraca, tente aumentar a concentração Au@CD ou prolongar o tempo de incubação.
    4. Retire o meio, lave suavemente os cavacos de safira com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e mergulhe-os em PBS para detecção de SERS16.

4. Experimentos SERS celulares

  1. Abra o computador, ligue o espectrômetro Raman, inicie o software e, em seguida, ligue o laser de 785 nm (consulte a Tabela de Materiais).
  2. Clique em Nova Medição e inicie uma nova aquisição espectral. Calibrar17 com wafers de silício antes da medição da amostra.
  3. Pegue uma lente objetiva de 20x para garantir que uma imagem celular clara seja observada e, em seguida, mude a lente objetiva para 50x. Ajuste a potência do laser de baixa para alta e o tempo de exposição e acúmulos apropriados.
    NOTA: Antes da medição do SERS, verifique a potência apropriada do laser para evitar danos celulares irreversíveis e garantir que os parâmetros de aquisição sejam consistentes. A intensidade do SERS está relacionada à potência do laser, tamanho do ponto, acúmulo e tempo de exposição.
  4. Escolha um ponto de células para medir e clique em Executar. Cada célula é medida por 20 pontos, e 10 células são medidas para obter a média.
    NOTA: Os componentes intracelulares são complicados, levando a uma grande disparidade de espectros. Portanto, pegue espectros em regiões celulares semelhantes e pegue o maior número possível de espectros.
  5. Salve os espectros.
  6. Clique em New Streamline image acquisition, depois clique em Video Review, selecione o intervalo a ser fotografado e clique em OK. Defina os parâmetros: 785 nm edge streamline, centro de 1.200 cm-1, duração de exposição de 5 s, número de acúmulos de três e potência do laser de 50%.
  7. Clique em New of Living imaging, escolha Signal to Baseline, defina o intervalo do primeiro limite 625 ao segundo limite 1.700 e, em seguida, clique em Configuração de área. Em seguida, defina as etapas adequadas e clique em Aplicar e OK. Finalmente, clique em Executar para começar a executar imagens SERS.

5. Cultura bacteriana e medidas de SERS

  1. Diluir culturas noturnas de E. coli e S. aureus (1:100) em 5 mL do novo meio Luria-Bertani (LB) (ver Tabela de Materiais). Após o crescimento a 37 °C a A600 0,4 a 0,6, centrifugar a cultura a 5.000 × g por 5 min para peletizar as células.
  2. Ressuspender os pellets em 1 mL de PBS seguido de uma centrifugação de 5 min 5.000 × g (à temperatura ambiente) duas vezes.
  3. Misture a cultura bacteriana com o Au@CDs e observe a mistura diretamente sob a plataforma SERS.

6. Análise dos dados

  1. Suavize os espectros e corrija a linha de base.
  2. Realizar análise de componentes principais (ACP)16 com os dados processados.

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Resultados

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A fabricação do Au@CDs está ilustrada na Figura 1. Os CDs foram preparados a partir de CA e GA através de um processo hidrotermal típico18. Au@CDs foram rapidamente sintetizados pela redução do HAuCl4 por CDs em meio aquoso à temperatura ambiente. O tamanho e a morfologia das CDs e Au@CDs podem ser observados por ETM e MET de alta resolução (HR)23. Os CDs preparados são monodispersos com tamanhos pequenos de...

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Discussão

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Em resumo, Au@CDs com um shell de CD ultrafino de 2,1 nm foram fabricadas com sucesso. Os nanocompósitos apresentam sensibilidade SERS superior às NPs puras de Au. Além disso, Au@CDs possuem excelente desempenho em reprodutibilidade e estabilidade a longo prazo. Outras pesquisas incluem tomar Au@CDs como substratos para realizar imagens SERS de células A54931 e detectar duas cepas bacterianas32. Foi provado que Au@CDs pode ser usado como uma sonda SERS ultrassensível princi...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32071399 e 62175071), pelo Programa de Ciência e Tecnologia de Guangzhou (2019050001), pela Fundação de Pesquisa Básica e Aplicada de Guangdong (2021A1515011988) e pela Fundação Aberta do Laboratório Chave de Ciência e Tecnologia Optoeletrônica para Medicina (Universidade Normal de Fujian), Ministério da Educação da China (JYG2009).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
10x tampão PBS (cultura de células)Langeco TechnologyBL316A
placa de cultura de células de 6 poçosLABSELECT11110
Kit de Contagem de Células-8 (CCK-8)GLPBIOGK10001
Ácido cítricoShanghai Aladdin Biochemical TechnologyC108869
CO2 incubadoraThermo Fisher Technologies3111
Agitador magnético de temperatura constanteSartorius Scientific InstrumentsSQP
Centrífuga criogênica de alta velocidadeShanghai BoxunSW-CJ-2FD
DMEM meio de cultura de células de alta glicoseProcellPM150210
Balança eletrônicaSartorius Scientific InstrumentsSQP
Marcador enzimáticoThermo Fisher Technologies3111
Soro bovino fetalZhejiang Tianhang Biological Technology11011-8611
Figura 1Figdraw.
Espectrômetro infravermelho de FourierThermo, AméricaNicolet 380
LiofilizadorTecanInfinite F50
Ácido gálicoShanghai Aladdin Biochemical TechnologyG104228
Espectrômetro Raman portátilOCEANHOOD, Xangai, ChinaUspectral-PLUS
HAuCl4Guangzhou Pharmaceutical Company (Guangzhou)
Microscópio eletrônico de transmissão de alta resoluçãoThermo Fisher TechnologiesFEI Tecnai G2 Spirit T12
Autoclave de alta temperaturaShanghai BoxunYXQ-LS-50S  figure-materials-1
Microscópio invertidoNanjing Jiangnan Yongxin ÓpticoXD-202
LB Caldo BRHuankai picoorganismo028320
Refrigerador médico de temperatura ultrabaixaThermo Fisher TechnologiesULTS1368
Azul de metilenoSigma-Aldrich
Pancreatina Célula Solução DigestivabeyotimeC0207
Penicilina estreptomicina dupla resistênciaShanghai BoxunYXQ-LS-50S  figure-materials-2
Medidor de água puroMillipore, EUAdo sistema
Renishaw
Chip de safirabeyotime
Banho-maria termostáticoChangzhou Noki
Mesa ultra-limpaShanghai BoxunSW-CJ-2FD
Absorção de luz UV-visível espectrômetroMADAPA, ChinaUV-6100S
Fio 3.4Renishaw
Espectrômetro Raman Milli-Q

Referências

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