Aqui, apresentamos um protocolo para realizar imagens de cálcio de dois fótons no prosencéfalo dorsal de zebrafish adultos.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Imagem de cálcio de dois fótons da atividade do prosencéfalo em peixes-zebra adultos com comportamento
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O peixe-zebra adulto (Danio rerio) exibe um rico repertório de comportamentos para o estudo das funções cognitivas. Eles também têm um cérebro em miniatura que pode ser usado para medir atividades em regiões cerebrais por meio de métodos de imagem óptica. No entanto, relatos sobre o registro da atividade cerebral em peixes-zebra adultos têm sido escassos. O presente estudo descreve procedimentos para a realização de imagens de cálcio de dois fótons no prosencéfalo dorsal de zebrafish adultos. Nós nos concentramos em etapas para impedir que peixes-zebra adultos movam suas cabeças, o que fornece estabilidade que permite imagens de varredura a laser da atividade cerebral. Os animais com a cabeça contida podem mover livremente suas partes do corpo e respirar sem ajudas. O procedimento visa encurtar o tempo da cirurgia de apoio de cabeça, minimizar o movimento cerebral e maximizar o número de neurônios registrados. Uma configuração para apresentar um ambiente visual imersivo durante a imagem de cálcio também é descrita aqui, que pode ser usada para estudar correlatos neurais subjacentes a comportamentos desencadeados visualmente.
Introdução
A imagem por fluorescência do cálcio com indicadores codificados geneticamente ou corantes sintéticos tem sido um poderoso método de medir a atividade neuronal em animais com comportamento, incluindo primatas não humanos, roedores, aves e insetos1. A atividade de centenas de células, até aproximadamente 800 μm abaixo da superfície cerebral, pode ser medida simultaneamente por meio de imagens com múltiplos fótons 2,3. A atividade de tipos celulares específicos também pode ser medida pela expressão de indicadores de cálcio em populações neuronais geneticamente definidas. A aplicação do mé....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Todos os procedimentos com animais foram aprovados e realizados de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Academia Sinica. Detalhes dos instrumentos de pesquisa podem ser encontrados na Tabela de Materiais.
1. Preparação da câmara de gravação
- Prepare um tanque semi-hexagonal, uma placa de base e um estágio de cabeça (Figura 1A; Arquivos complementares 1-3). O estágio principal consiste em dois postes metálicos presos a uma placa circular. A placa circular contém ranhuras que podem ser travadas na placa de base....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
O protocolo consiste em duas partes: cirurgia de apoio de cabeça e cintilografia de cálcio de dois fótons das atividades neuronais no prosencéfalo. O sucesso da cirurgia é definido pela sobrevivência do animal e pela estabilidade do apoio de cabeça. A taxa de sobrevida pode ser muito melhorada pela perfusão frequente da solução de EMT a 0,01% pela boca durante a cirurgia. Os peixes devem se recuperar da anestesia e respirar ativamente dentro de 1-2 minutos após serem imersos na água do tanque de peixes. A imagem de cálci.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para conter a cabeça de peixes-zebra adultos para imagens de cálcio de dois fótons. Há duas etapas críticas para obter um apoio de cabeça que seja estável o suficiente para imagens de varredura a laser. Primeiro, a barra da cabeça deve ser colada nos locais de fixação específicos dos crânios. Outras partes do crânio são muitas vezes muito finas para fornecer estabilidade mecânica e podem até ser fraturadas durante movimentos fortes do corpo. Em segundo lugar, a pele acima dos loca.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Instituto de Biologia Molecular, Academia Sinica, e Conselho Nacional de Ciência e Tecnologia, Taiwan. A Oficina de Máquinas do Instituto de Física, Academia Sinica ajudou a fabricar peças personalizadas. Também queremos agradecer a P. Argast (Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research, Basileia, Suíça) pelo projeto do mecanismo de bloqueio rápido do estágio principal.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Cartão de aquisição | MBF Biociências | Vidrio vDAQ | Microscópio |
| Filme de retroprojeção | Kimoto | Tela Diland - GSK | Estímulo visual presente |
| Filtro passa-banda (510/80 nm) | Chroma | ET510/80m | Microscópio |
| Placa base para o tanque semi-hexagonal | Feito sob medida | ver arquivos suplementares | Câmara de gravação |
| Filtro da câmera (< 875 nm) | Óptica Edmund | #86-106 | Registro de comportamento |
| Filtro da câmera (>700 nm) | Óptica Edmund | #43-949 | Registro de comportamento |
| Lente da câmera | Thorlabs | MVL50M23 | Registro de comportamento |
| Visão Camaleão-S | Coerente | Visão-S | Laser |
| Placa circular para o estágio de cabeça | Feito sob medida | ver arquivos suplementares | Câmara de gravação |
| Controlador para atuador piezo | Instrumento Physik | E-665. CR | Microscópio |
| Amplificador de corrente | Thorlabs | TIA60 | Microscópio |
| Elitedent Q-6 | Rolence Enterprise | Q-6 | Cirurgia: Lâmpada UV |
| Filtro de Emissão 510/80 nm | Chroma | ET510/80m | Microscópio |
| Barra de cabeça | Feito sob medida | ver arquivos suplementares | Câmara de gravação |
| Luz infravermelha | Thorlabs | M810L3 | Registro de comportamento |
| Projetor de LED | AAXA | Projetor P2B LED Pico | Estímulo visual presente |
| Papel de papel úmido (Kimwipe) | Ciência Kimtech | 34155 | Cirurgia: papel úmido |
| Estágio de amostragem motorizado XY | Zaber | X-LRM050 | Microscópio |
| Filtros de Densidade de Neutro (50% de Transmissão) | Thorlabs | NE203B | Estímulo visual presente |
| & Oslash; Suporte de 1/2" | ThorLabs | PH1.5V | Cirurgia: tubo oco para canhão |
| & Oslash; Poste óptico de aço inoxidável de 1/2" | ThorLabs | TR150/M | Cirurgia: módulo de carregamento de peixes |
| Lente objetiva 16x, 0,8NA | Nikon | CF175 | Microscópio |
| Argila de modelagem à base de óleo | Ly Hsin Clay | C4086 | Cirurgia: suporte da barra de cabeça |
| Adesivo óptico | Produtos Norland | NOA68 | Cirurgia: cola curável por UV |
| Tubo fotomultiplicador | Hamamatsu | H11706P-40 | Microscópio |
| Atuador piezo | Instrumento Physik | P-725.4CA PIFOC | Microscópio |
| Célula Pockels | Conópticos | M350-80-LA-BK-02 | Microscópio |
| Filtro Red Wratten (> 600 nm) | Óptica Edmund | #53-699 | Estímulo visual presente |
| Sistema de Varredura Ressonante-Galvo | INSS | RGE-02 | Microscópio |
| Grampo de ângulo reto para ø Poste de 1/2" | ThorLabs | RA90/M | Cirurgia: módulo de carregamento de peixes |
| Grampo Rotativo para Ø Poste de 1/2" | ThorLabs | SWC/M | Cirurgia: módulo de carregamento de peixes |
| ScanImage | MBF Biociências | Versão básica | Microscópio |
| Tanque semi-hexagonal | Feito sob medida | ver arquivos suplementares | Câmara de gravação |
| Super-Bond C&; Uniforme B | Sun Medical Co. | Super-Bond C&; B | Cirurgia: cimento dentário |
| Metanassulfonato de tricaína | Sigma Aldrich | E10521 | Cirurgia: anestésico |
| Câmera USB | FLIR | BFS-U3-13Y3M-C | Registro de comportamento |
| Vetbond | 3M | 1469SB | Cirurgia: cola de tecido |
Referências
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Chow, D. M., et al. Deep three-photon imaging of the brain in intact adult zebrafish. Nature Methods. 17 (6), 605-608 (2020).
- Mittmann, W., et al.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
