Aqui, discutimos um fluxo de trabalho para preparar, dissecar, montar e obter imagens de cérebros de explantes vivos de larvas de terceiro ínstar de Drosophila melanogaster para observar a dinâmica celular e subcelular sob condições fisiológicas.
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Artigo de método
Imagem de células vivas de cérebros de larvas de terceiro ínstar de Drosophila melanogaster
Neste artigo
Resumo
Resumo
As células-tronco neurais de Drosophila (neuroblastos, RNs doravante) sofrem divisões assimétricas, regenerando o neuroblasto auto-renovador, ao mesmo tempo em que formam uma célula-mãe do gânglio diferenciador (GMC), que sofrerá uma divisão adicional para dar origem a dois neurônios ou glia. Estudos em RNs descobriram os mecanismos moleculares subjacentes à polaridade celular, orientação fusiforme, auto-renovação e diferenciação de células-tronco neurais. Essas divisões celulares assimétricas são facilmente observáveis através de imagens de células vivas, tornando os RNs larvais ideais para investigar a dinâmica espaço-temporal da divisão celular assimétrica em tecidos vivos. Quando devidamente dissecados e imageados em meio suplementado com nutrientes, os RNs em cérebros explantes dividem-se robustamente por 12-20 h. Os métodos descritos anteriormente são tecnicamente difíceis e podem ser desafiadores para aqueles que estão começando na área. Aqui, um protocolo é descrito para a preparação, dissecção, montagem e imagem de explantes cerebrais de larvas de terceiro ínstar vivas usando suplementos de corpo gorduroso. Problemas potenciais também são discutidos, e exemplos são fornecidos de como essa técnica pode ser usada.
Introdução
A divisão celular assimétrica (DCA) é o processo pelo qual componentes subcelulares como RNA, proteínas e organelas são particionados desigualmente entre as células filhas 1,2. Esse processo é comumente visto em células-tronco, que sofrem DCA para dar origem a células-filhas com diferentes destinos de desenvolvimento. Drosófila Os RNs dividem-se assimetricamente para produzir um RN, que retém sua caule, e uma célula-mãe ganglionar (GMC). O GMC sofre novas divisões para produzir neurônios diferenciadores ou glia3. RNs em divisão assimétrica são abundantes no cérebro em desenvolv....
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Protocolo
OBS: A Figura 1 mostra os materiais necessários para a realização deste estudo.
1. Considerações e preparativos para a experiência
- Evitar que as larvas se superlotem.
NOTA: A qualidade do cérebro das larvas de explantes está diretamente relacionada com a saúde e qualidade das larvas antes da dissecção. Larvas desnutridas por superlotação geralmente produzem cérebros de baixa qualidade30.- Certifique-se de que não mais do que 20-30 larvas estão presentes por prato de tampa de refeição para evitar a desnutrição. Exemplos disso podem ser vistos na
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Resultados
Dissecção e imagem de NBs do lobo cerebral central expressando Pins::EGFP e Cherry::Jupiter
Para mostrar este protocolo, larvas expressando Cherry::Jupiter13 e endogenamente marcadas Pins::EGFP16 (w; worGal4, UAS-cherry::jupiter/CyO; Pinos::EGFP/TM6B, Tb) foram fotografados por 4 h usando o protocolo descrito usando lâminas de imagem de múltiplos poços (Figura 5C,D). Dados adicionais foram obtidos de larvas .......
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Discussão
Este protocolo descreve uma abordagem para a obtenção de imagens de cérebros vivos de explantes de larvas de Drosophila melanogaster . O protocolo aqui descrito permite que cérebros de explantes sejam observados por 12-20 h sob as condições experimentais adequadas. Atenção especial deve ser dada à preparação das amostras e ao planejamento dos experimentos desejados. Como mencionado acima, um dos fatores mais críticos que determinam a qualidade do tecido dissecado é a saúde das larvas. Para alcançar a mais alta q.......
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Divulgações
Os autores não têm divulgações financeiras a declarar.
Agradecimentos
Esta pesquisa é apoiada por R35GM148160 (C. C.) e um National Institutes of Health (NIH) Training Grant T32 GM007270 (R. C. S)
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,22 µ m Membrana de polietersulfona (PES) | Genesee | 25-231 | Filtros acionados por vácuo |
| Ágar Ágar | granulado | Genesee | 20-248 |
| Computador analítico | Dell | NA | CPU Intel Xeon Gold 5222 com dois processadores de 3,80 GHz executando o Windows 10 em um sistema operacional de 64 bits Soro de |
| crescimento bovino | HyClone | SH30541.02 | |
| Lâminas | de imagem com câmaraMicroscópio Confocal Ibidi | 80826 | |
| Nikon | NA | ||
| Lâmina de metal usinada sob medida | NA | NA | Veja Cabernard and Doe 2013 (Ref. 34) para especificações |
| Pratos de dissecação Fisher | Scientific | 5024343 | de micro ponto de porcelana de 3 poços |
| Fórceps de Dissecção | World Precision Instruments | Dumont #5 | |
| Microscópio de Dissecção | Leica | NA | |
| Tesoura de Dissecção | Fine Science Tools (FST) | 15003-08 | |
| Gaiola de coleta de embriões | Genesee | 59-100 | |
| Flypad com acesso a CO2 para anestesiar moscas adultas | Genesee | 59-172 | |
| Membrana permeável a gás | YSI | 98095 | Membrana permeável a gás |
| Tampa de vidro Slides | Microscopia Eletrônica Ciências | 72204-03 | # 1.5; 22 mm x 40 mm lamínulas de vidro |
| Imaris | Oxford Instruments | NA | Alternativas: Fiji, Volocity, Aivia |
| Imaris File Converter | Oxford Instruments | NA | |
| Fermento Instantâneo | Saf-Instant | NA | |
| Melaço | Genesee | 62-117 | |
| Placa de Petri | Greiner Bio-One | 628161 | placa de Petri de 60 mm x 15 mm |
| Vaselina Vaselina | NA | ||
| Meio de Insetos da Schneider com L-glutamina e bicarbonato de sódio líquido | Millipore Sigma | S0146 | |
| Software de aquisição de SlideBook | 3i | NA | |
| Unidade de Filtração a Vácuo com 0,22 µ µ m Filtro de membrana PES | Genesee Scientific, GenClone | 25-231 |
Referências
- Delgado, M. K., Cabernard, C. Mechanical regulation of cell size, fate, and behavior during asymmetric cell division. Current Opinion in Cell Biology. 67, 9-16 (2020).
- Sunchu, B., Cabernard, C. Principles and mechanisms of asymmetric cell division.
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Reimpressões e permissões
