Aqui, descrevemos um método para alterar seletivamente a expressão gênica no plexo coroide, evitando qualquer impacto em outras áreas cerebrais.
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Artigo de método
Knockdown direcionado de genes no plexo coroide
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O plexo coroide (PCh) serve como uma porta de entrada crítica para a infiltração de células imunes no sistema nervoso central (SNC) em condições fisiológicas e patológicas. Pesquisas recentes mostraram que regular a atividade da ChP pode oferecer proteção contra distúrbios do SNC. No entanto, estudar a função biológica da ChP sem afetar outras regiões cerebrais é um desafio devido à sua estrutura delicada. Este estudo apresenta um novo método para knockdown gênico em tecido ChP usando vírus adenoassociados (AAVs) ou enzima de recombinação de ciclização (Cre) proteína recombinase consistindo de sequência TAT (CRE-TAT). Os resultados demonstram que, após a injeção de AAV ou CRE-TAT no ventrículo lateral, a fluorescência foi concentrada exclusivamente na ChP. Usando esta abordagem, o estudo derrubou com sucesso o receptor de adenosina A 2A (A2A R) na ChP usando RNA de interferência (RNAi) ou Cre/locus de sistemas X-overP1 (Cre/LoxP), e mostrou que esse knockdown poderia aliviar a patologia da encefalomielite autoimune experimental (EAE). Essa técnica pode ter implicações importantes para pesquisas futuras sobre o papel da ChP nos distúrbios do SNC.
Introdução
Acreditava-se que o plexo coroide (PCc) ajudava a manter a homeostase funcional do cérebro por meio da secreção de líquido cefalorraquidiano (LCR) e fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF)1,2. Pesquisas crescentes nas últimas três décadas têm revelado que a ChP representa uma via distinta para a infiltração de células imunes no sistema nervoso central (SNC).
As tight junctions (TJs) da ChP, compostas por um epitélio de ChP monocamada, mantêm a homeostase imunológica, impedindo a entrada de macromoléculas e células imunes no cérebro3. No entanto, sob cer....
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Protocolo
Todos os procedimentos em animais descritos neste estudo foram conduzidos de acordo com as diretrizes descritas no Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Médica de Wenzhou.
1. Animais
- Compre camundongos C57BL/6 machos com idade entre 8-12 semanas e pesando 20-22 g.
- Obter a linhagem transgênica Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato (Ai9) e camundongos machos A2ARflox/fox .
- Atribua aleatoriamente os camundongos a dois grupos e aloja-se em gaiolas, com um máximo de cinco camundon....
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Resultados
knockdown de A2AR específico para ChP por injeção ICV de AAV2/5-shRNA ou CRE-TAT
O papel de A2AR na ChP como um poderoso regulador da informação neural na patogênese do EAE permanece obscuro. Derrubar a expressão de A 2A R específica de ChP poderia lançar luz sobre os efeitos regulatórios de A2AR no sistema imunológico central em EAE e outras inflamações do sistema nervoso. Este estudo usou a injeção ICV de CRE-TAT para diminuir a expressão de A 2A R na ChP .......
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Discussão
A pesquisa apresentou duas abordagens distintas para o knockdown direcionado de genes ChP. A primeira abordagem envolveu a injeção ICV de CRE-TAT, que contém Cre recombinase, em camundongos A2AR flox/flox. A segunda abordagem envolveu a injeção de ICV de AAV2/5 carregando shRNA de A2AR. Utilizando essas duas estratégias, o trabalho conseguiu o knockdown seletivo de A 2A R dentro da ChP e foi capaz de demonstrar os efeitos protetores da inibição da sinalização A2AR na ChP na pat.......
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Divulgações
Os autores afirmam que não têm interesses financeiros concorrentes ou outras divulgações a declarar.
Agradecimentos
Agradecemos o apoio da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (Grant No. 31800903, concedido a W. Zheng) e do Wenzhou Science and Technology Project (No. Y2020426, concedido a Y. Y. Weng) por este trabalho.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Camundongos A2ARflox/flox | Laboratório Estadual de Oftalmologia, Optometria e Ciências Visuais, Universidade | ||
| AAV2/5-A2AR-ShRNA vírus | Shanghai Heyuan Biotechnology Co. LTD | pt-4828 | |
| meio de montagem antifade | Beyotime Biotechnology | 0100-01 | |
| capilar de vidro de borosilicato | Beijing Meiyaxian Technology Co. Ltd | B100-50-10 | |
| aparelho estereotáxico cerebral | RWD, Shenzhen | 69100 | |
| C57BL / 6 camundongos | Pequim Vital Charles River Laboratory Animal Technology Company | ||
| CRE-TAT recombinase | Millipore | SCR508 | |
| DAPI | Absin | B25A031 | |
| máquina de fatiar congelada | Leica | CM1950 | |
| H37Ra | Becton Dickinson e companhia | 231141 | |
| seringa Hamilton | Hamilton, American | P/N: 86259 | |
| confocal | Zeiss | LSM900 | |
| Freunds | Sigma | F5506 | |
| MOG35-55 | Suzhou Qiangyao Biotechnology Co., LTD | 4010006243 | |
| OCT cola | Epredia | 6502p | |
| paraformaldeído | Chengdu Kelong reagente químico Empresa | 30525-89-4 | |
| pentobarbital sódico | de pipeta PC13003 | Boyun Biotech | |
| Eppendorf | N45014F | ||
| PrimeScript 1ª fita | Takara | 6110A | |
| Sistema de PCR em Tempo Real | BioRad | CFX96 | |
| Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato camundongos | Jackson Laboratory | ||
| sacarose | Sangon Biotech | A502792-0500 | |
| homogeneizador de super alta velocidade | IKA | 3737025 | |
| Trizol | Invitrogen | solução | |
| Empresa de reagentes químicos Chengdu Kelong | 1330-20-7 |
Referências
- Damkier, H. H., Brown, P. D., Praetorius, J. Cerebrospinal fluid secretion by the choroid plexus. Physiological Reviews. 93 (4), 1847-1892 (2013).
- Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system.....
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Reimpressões e permissões
