Usando imagens STED de células vivas para visualizar a ultraestrutura da membrana interna mitocondrial em modelos de células neuronais

As mitocôndrias são organelas eucarióticas de origem endossimbiótica responsáveis pela regulação de vários processos celulares chave, incluindo metabolismo intermediário e produção de ATP, homeostase iônica, biossíntese lipídica e morte celular programada (apoptose). Essas organelas são topologicamente complexas, contendo um sistema de membrana dupla que estabelece múltiplos subcompartimentos¹ (Figura 1A). A membrana mitocondrial externa (MOO) faz interface com o citosol e estabelece contatos diretos interorganelas ^2,3. A membrana mitocondrial interna (MIM) é uma membrana conservadora de energia que mantém gradientes iônicos armazenados principalmente como um potencial de membrana elétrica (ΔΨ_m) para conduzir a síntese de ATP e outros processos que requerem energia ^4,5. O IMM é subdividido em membrana de contorno interno (IBM), que é intimamente aprimida ao OMM, e estruturas salientes chamadas cristas que são ligadas pela membrana de cristas (CM). Esta membrana delineia o compartimento mais interno da matriz a partir do espaço intracristal (ICS) e do espaço intermembrana (IMS).

As mitocôndrias possuem uma morfologia dinâmica baseada em processos contínuos e equilibrados de fissão e fusão que são governados por mecanoenzimas da superfamília das^dinaminas6. A fusão permite maior conectividade e formação de redes reticulares, enquanto a fissão leva à fragmentação mitocondrial e possibilita a remoção de mitocôndrias danificadas pela mitofagia⁷. A morfologia mitocondrial varia de acordo com o tipo^{de tecido 8} e o estágio de desenvolvimento⁹ e é regulada para permitir que as células se adaptem a fatores como necessidades energéticas 10,11 e estressores ¹². Características morfométricas padrão das mitocôndrias, como a extensão da formação da rede (interconectada vs. fragmentada), perímetro, área, volume, comprimento (relação de aspecto), arredondamento e grau de ramificação, podem ser medidas e quantificadas por microscopia óptica padrão, pois os tamanhos dessas características são maiores que o limite de difração da luz (~200 nm)¹³.

A arquitetura das cristas define a estrutura interna das mitocôndrias (Figura 1B). A diversidade de morfologias das cristas pode ser amplamente categorizada em plana (lamelar ou discoidal) ou tubular-vesicular14. Todas as cristas se fixam na IBM através de estruturas tubulares ou semelhantes a slots, denominadas cristae junctions (CJs) que podem servir para compartimentar o IMS do ICS e o IBM do CM¹⁵. A morfologia das cristas é regulada por complexos proteicos chave do IMM, incluindo (1) o sítio de contato mitocondrial e o sistema organizador de cristas (MICOS) que reside nas CJs e estabiliza os contatos IMM-OMM 16, (2) a GTPase da atrofia óptica 1 (OPA1) que regula o remodelamento das cristas^17,18,19 e (3) a F₁F_O ATP sintase que forma conjuntos oligoméricos estabilizadores nas pontas das cristas (CTs)^{20, 21º}. Além disso, o IMM é enriquecido em fosfolipídios não bicamadas, fosfatidiletanolamina e cardiolipina, que estabilizam o IMM altamente curvo²². As cristas também são dinâmicas, demonstrando alterações morfológicas sob diversas condições, como diferentes estados metabólicos 23,24, com diferentes substratos respiratórios 25, sob inanição e estresse oxidativo 26,27, com apoptose ^28,29 e com o envelhecimento ³⁰. Recentemente, foi demonstrado que as cristas poderiam sofrer grandes eventos de remodelação em uma escala de tempo de segundos, ressaltando sua natureza dinâmica³¹. Várias características das cristas podem ser quantificadas, incluindo dimensões das estruturas dentro das cristas individuais (por exemplo, largura da CJ, comprimento e largura da crista) e parâmetros que relacionam cristas individuais com outras estruturas (por exemplo, espaçamento intra-cristas e ângulo incidente das cristas em relação à OMM)³². Estes parâmetros quantificáveis das cristas mostram uma correlação direta com a função. Por exemplo, a extensão da produção de ATP mitocondrial está positivamente relacionada com a abundância de cristas, quantificada como densidade de cristas ou número de cristas normalizado para outra característica (por exemplo, cristas por área de OMM)^33,34,35. Como a morfologia do IMM é definida por características nanométricas, compreende a ultraestrutura mitocondrial, que requer técnicas de imagem que forneçam resolução maior que o limite de difração da luz. Como descrito a seguir, tais técnicas incluem microscopia eletrônica e microscopia de super-resolução (nanoscopia).

As células neurais e gliais do sistema nervoso central (SNC) são particularmente dependentes da função mitocondrial. Em média, o cérebro constitui apenas 2% do peso corporal total, mas utiliza 25% da glicose corporal total e é responsável por 20% do consumo de oxigênio corporal, tornando-o vulnerável a prejuízos no metabolismo energético³⁶. As doenças neurodegenerativas progressivas (DNs), incluindo a doença de Alzheimer (DA), a esclerose lateral amiotrófica (ELA), a doença de Huntington (DH), a esclerose múltipla (EM) e a doença de Parkinson (DP), são algumas das patologias mais extensamente estudadas até o momento, com esforços de pesquisa que vão desde a compreensão dos fundamentos moleculares dessas doenças até a busca de potenciais intervenções e prevenção terapêutica. Os DEs estão associados ao aumento do estresse oxidativo originado, em parte, por espécies reativas de oxigênio (EROs) geradas pela cadeia de transporte de elétrons mitocondrial (ETC)³⁷, bem como a alterações no manuseio do cálcio mitocondrial 38 e no metabolismo lipídico mitocondrial³⁹. Essas alterações fisiológicas são acompanhadas por defeitos observados na morfologia mitocondrial que estão associados com DA 40,41,42,43,44, ELA 45,46, HD^47,48,49, EM ⁵⁰ e DP ^51,52,53. Esses defeitos estruturais e funcionais podem ser acoplados por complexas relações de causa e efeito. Por exemplo, dado que a morfologia das cristas estabiliza as enzimas OXPHOS⁵⁴, as ROS mitocondriais não são geradas apenas pela ETC, mas também atuam para danificar a infraestrutura na qual a ETC reside, promovendo um ciclo de ROS feed-forward que aumenta a suscetibilidade a danos oxidativos. Além disso, foi demonstrado que a desorganização das cristas desencadeia processos como a liberação de DNA mitocondrial (mtDNA) e vias inflamatórias ligadas a distúrbios autoimunes, metabólicos e relacionados à idade⁵⁵. Portanto, a análise da estrutura mitocondrial é a chave para uma compreensão completa dos DEs e seus fundamentos moleculares.

Métodos populares de visualização de cristas, incluindo microscopia eletrônica de transmissão, tomografia eletrônica e tomografia crioeletrônica (crio-TE), e tomografia de raios-X, em particular a tomografia de raios X criomole, têm revelado achados importantes e trabalhos com uma variedade de tipos de amostras56,57,58,59,60. Apesar dos recentes avanços em direção à melhor observação da ultraestrutura organelar, esses métodos ainda vêm com a ressalva de exigir a fixação da amostra e, portanto, não podem capturar diretamente a dinâmica em tempo real das cristas. A microscopia de fluorescência de super-resolução, particularmente nas formas de microscopia de iluminação estruturada (SIM), microscopia de reconstrução óptica estocástica (STORM), microscopia de localização fotoativada (PALM), microscopia de expansão (ExM) e microscopia de depleção de emissão estimulada (STED), tornaram-se formas populares de visualização de estruturas que requerem resolução abaixo do limite de difração que restringe os métodos clássicos de microscopia óptica. Quando a ExM é usada em conjunto com outra técnica de super-resolução, os resultados são impressionantes, mas a amostra deve ser fixada e corada em gel⁶¹. Em comparação, SIM, PALM/STORM e STED foram usados com sucesso com amostras vivas, e novos e promissores corantes que geralmente coram o IMM fornecem uma abordagem nova e fácil para imagens ao vivo da dinâmica das mitocôndrias cristas 62,63,64,65,66. Avanços recentes em corantes vivos para imagens STED melhoraram o brilho e a fotoestabilidade do corante, e esses corantes têm como alvo o IMM em um grau mais alto de especificidade do que seus antecessores. Esses desenvolvimentos permitem a coleta de experimentos de longo prazo em timelapse e z-stack com imagens de super-resolução, abrindo as portas para uma melhor análise de células vivas da ultraestrutura e dinâmica mitocondrial.

Neste estudo, são apresentados protocolos para obtenção de imagens de células SH-SY5Y indiferenciadas e diferenciadas coradas com o corante PKmito Orange (PKMO) usando STED⁶³. A linhagem celular SH-SY5Y é um derivado subclonado três vezes da linhagem celular parental, SK-N-SH, gerada a partir de biópsia de medula óssea de neuroblastoma metastático^67,68,69,70. Essa linhagem celular é um modelo in vitro comumente utilizado na pesquisa de DN, particularmente em doenças como DA, DH e DP, nas quais a disfunção mitocondrial está fortemente implicada10,43,71,72,73. A capacidade de diferenciar células SH-SY5Y em células com fenótipo semelhante a um neurônio por meio da manipulação de meios de cultura tem se mostrado um modelo adequado para pesquisas em neurociência sem depender de células neuronais primárias^10,74. Nesse protocolo, ácido retinóico (AR) foi adicionado ao meio de cultura celular para induzir a diferenciação de células SH-SY5Y. A AR é um derivado da vitamina A e demonstrou regular o ciclo celular e promover a expressão de fatores de transcrição que regulam a diferenciação neuronal⁷⁵. Um protocolo para cultivo e imagem de células vivas de neurônios isolados do hipocampo de ratos também é fornecido. Demonstrou-se que o hipocampo é afetado pela degeneração mitocondrial e, juntamente com o córtex, desempenha um papel importante no envelhecimento e na DN76,77,78,79,80.

1. Propagação e diferenciação de células SH-SY5Y

1. Preparação de meios para crescimento e manutenção celular
   1. Preparar meio de águia modificado de Dulbecco completo e com alto teor de glicose (DMEM, 4,5 g/L de D-glicose, 4 mM de L-glutamina, 110 mg/L de piruvato de sódio) suplementado com um antibiótico-antimicótico final de 1% (v/v) (10.000 unidades/mL de penicilina, 10.000 μg/mL de estreptomicina e 25 μg/mL de anfotericina B) e quantidades variáveis de soro fetal bovino (FBS) (ver Tabela de Materiais). As quantidades de FBS nos meios de diferenciação variam entre 10%, 5% ou 2% (v/v) de SFB final.
2. Manutenção celular
   1. Manter as células em DMEM suplementado com FBS a 10% (v/v) e colocá-las a 37 °C e 5% CO₂, em seguida, semear em DMEM contendo 5% (v/v) de SFB para diferenciação. Os estoques de células congeladas foram armazenados em FBS com 10% (v/v) de dimetilsulfóxido (DMSO) a 1-2 x 10⁷ células/mL.
3. Preparação de ácido retinóico (AR)
   1. Dissolver 7,51 mg de all-trans-RA (ver Tabela de Materiais) em 5 mL de etanol 95% recém-preparado para obter 5 mM de solução-mãe. Verificar a concentração com absorbância a 350 nm (ɛ = 44.300 M-1 cm-1), obtida da ficha de informações do produto do protocolo⁸¹ do fabricante, utilizando uma diluição da ^{solução-mãe} a 5 μM em etanol. Conservar 5 mM de existências protegidas da luz a 4 °C durante um período máximo de 6 semanas.
4. Preparação de poli-D-lisina para revestimento de lamínulas
   NOTA: O protocolo de produto poli-D-lisina (PDL), encontrado na seção Documentos e downloads do site do fornecedor⁸², fornece informações para revestir uma variedade de vasos de cultura.
   1. Este protocolo inclui volumes baseados em um recipiente com câmara de 2 poços com uma área de 4 cm² por poço com fundos de vidro de borossilicato estéril #1,5 (ver Tabela de Materiais). Diluir a solução-mãe de PDL duas vezes para 50 μg/mL com PBS de Dulbecco (DPBS; sem cálcio, sem magnésio).
      NOTA: #1.5 ou #1.5H coverglass são ambas espessuras aceitáveis, que são essenciais para a qualidade da imagem. Outras espessuras induzirão aberração esférica e devem ser evitadas.
5. Revestimento de deslizamento com PDL
   NOTA: As lamínulas podem ser expostas à luz ultravioleta (UV) por 10-15 minutos em um armário de biossegurança para esterilização adicional.
   1. Aplicar 1,2 mL de solução de PDL 50 μg/mL em cada poço de lamínulas estéreis em um gabinete de cultura celular e incubar à temperatura ambiente por 1 h. Retire a solução de PDL e lave três vezes com 3,6 mL de água destilada. Depois de completar a lavagem final, deixe a câmara revestida secar por 2 h exposta ao ar antes de enxaguar e usar imediatamente ou armazenar com um recipiente hermético a 4 °C por até 2 semanas.
      NOTA: Enxágue bem as tampas, pois o excesso de PDL pode ser tóxico para as células.
6. Diferenciação de células SH-SY5Y com AR
   NOTA: Não utilize células acima da passagem 15. As células são passadas em 80%-90% de confluência. Os procedimentos de diferenciação diferem, mas seguem etapas semelhantes. Diferenciação adicional de neuroblastomas para neurônios maduros é obtida com tratamento adicional com fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF)68,83,84,85^, mas não foi realizada neste protocolo.
   OPCIONAL: Estabelecer células por pelo menos 24 h antes da semeadura em vidro de cobertura. Para preparar as células a partir de estoques congelados, descongele rapidamente 1 mL de frasco congelado de células e adicione a 9 mL de meio pré-aquecido suplementado com FBS a 10%, depois gire para baixo a 350 x g por 10 min (à temperatura ambiente) e descarte o sobrenadante para remover o DMSO. Ressuspender o pellet de células em 5 mL de meio pré-aquecido e células de sementes em frasco T-25. Quando as células atingirem 80%-90% de confluência, passe as células por contagem e semeadura para diferenciação, quando aplicável.
   1. Dia 0: Células da semente.
      1. Semeando as células numa tampa de câmara a partir de existências congeladas ou de um balão de trabalho. Use uma densidade de semeadura de 1,5 x 10⁴ células/cm².
         NOTA: Um único poço em um vidro de cobertura padrão de 2 poços com 4 cm² de área de cultura exigirá 6,0 x 10⁴ células. As células que permanecerão indiferenciadas devem ser semeadas com DMEM suplementado com 10% (v/v) de SFB, e as células que serão diferenciadas devem ser semeadas com DMEM suplementado com 5% (v/v) de SFB.
   2. Dia 1: Iniciar o tratamento de diferenciação da AR.
      1. Preparar DMEM suplementado com 5% (v/v) de SFB, 1% (v/v) antibiótico-antimicótico e uma concentração final de 10 μM de RA ou etanol do mesmo volume de aditivo para servir como controle do veículo para este procedimento de diferenciação. Remova o meio da tampa de câmara usada para semeadura, enxágue com 1x PBS e adicione o novo DMEM aos poços.
   3. Dia 3: Substitua o meio por meios frescos contendo AR ou etanol.
      1. Remover o meio do Dia 1 e substituir por meio fresco suplementado com 2% (v/v) de SFB, 1% (v/v) antibiótico-antimicótico e 10 μM de AR ou 95% de etanol do mesmo volume de aditivo para servir como controle do veículo para este procedimento de diferenciação. Remova o meio da tampa de câmara usada para semeadura, enxágue com 1x PBS e adicione novos meios aos poços.
   4. Dia 6: Realizar a imagem das células.
      NOTA: Os tempos de diferenciação celular variam de acordo com o protocolo, mas seis dias de exposição à AR são suficientes para induzir um fenótipo semelhante a um neurônio em células SH-SY5Y⁸⁶.
      1. Realizar imagens ao vivo, com detalhes nas seções 3 e 4 (Figura 2).

2. Cultura primária de neurônios hipocampais de ratos

1. Preparação de materiais para isolamento de neurônios hipocampais de ratos.
   1. Preparar DMEM fresco suplementado.
      1. Filtrar-esterilizar uma mistura de DMEM (glicose alta, sem piruvato de sódio) suplementada com FBS inativado pelo calor a 10% (v/v), solução de piruvato de sódio a 1% (v/v) e penicilina-estreptomicina a 1% (10.000 U/mL). Conservar até 2 semanas a 4 °C.
   2. Preparar meios de crescimento de neurônio frescos suplementados.
      1. Filtrar-esterilizar uma mistura de meios de crescimento de neurônios suplementados com 2% (v/v) suplemento B27, 0,25% (v/v) suplemento de glutamina e 1% (v/v) penicilina-estreptomicina (ver Tabela de Materiais). Conservar até 2 semanas a 4 °C.
2. Preparar a cultura primária do neurônio hipocampal.
   1. Preparar a cultura primária do neurônio hipocampal seguindo o trabalho publicado anteriormente⁸⁷ e a partir do protocolo do produto no local do fabricante a partir do qual o hipocampo dissecado do rato E18 é obtido⁸⁸ (ver Tabela de Materiais). Esse protocolo resulta em uma população majoritariamente neuronal com <2% de astrócitos.
      NOTA: O meio de hibernação com o qual este tecido é enviado será usado para etapas futuras neste protocolo. Não descarte ele.
   2. Preparar materiais e meios para dissociação tecidual.
      1. Chame uma pipeta Pasteur para diminuir o diâmetro da abertura e guarde-a em papel alumínio para evitar contaminação até o uso. Pré-aqueça o DMEM preparado, a solução tamponada de sal de 1X Hank (HBSS) e o meio de crescimento de neurônios a 37 °C. Adicionar 2 flocos de DNAase com pinça estéril a um tubo cônico de 15 mL.
   3. Realizar dissociação tecidual.
      1. Remover o máximo possível do meio de hibernação no hipocampo dissecado de ratos E18 antes de colocar o tecido no tubo cônico de 15 mL contendo DNAase e incubar brevemente a 37 °C. Adicionar 900 μL de 1X HBSS seguido de 100 μL de tripsina a 0,5%. Incubar o tecido a 37 °C durante 15 minutos.
         NOTA: As placas revestidas com PDL podem ser retiradas do armazenamento e colocadas em uma incubadora até o uso durante este tempo de incubação.
   4. Realizar homogeneização tecidual e contagem celular.
      1. Após incubação com tripsina, retirar o meio e adicionar 1 mL de meio de hibernação-DNAase pré-aquecido da etapa anterior ao tecido e homogeneizar com a pipeta de Pasteur. A mídia parecerá opaca e, em seguida, gradualmente clara à medida que a homogeneização continua.
      2. Adicione neurônios dissociados a um novo tubo com 4 mL de DMEM pré-aquecido e, em seguida, conte as células usando um contador de células.
   5. Realizar plaqueamento celular e crescimento de células primárias.
      1. Células de placa a uma densidade de aproximadamente 1,65 x 10⁴ células/cm² em DMEM. Para uma cobertura de vidro com câmara de 2 poços (4 cm 2), semeie 65.000 – 70.000 células por poço com² mL de DMEM. Incubar as células a 37 °C e 5% CO 2 durante₂ h antes de verificar a aderência. Quando as células começarem a aderir, remova 1 mL de meio e substitua-o pelo mesmo volume de meio de hibernação, agite suavemente para misturar. Uma vez que o meio é misturado, repita este processo e remova metade do meio presente e substitua pelo mesmo volume de meio de crescimento de neurônio, em seguida, misture suavemente.
         NOTA: O dia do plaqueamento é considerado dia in vitro (DIV) 0, e as células estão prontas para obter imagens na DIV 7 (Figura 2).

3. Preparação de células para imagens de células vivas

NOTA: Os tipos celulares e a origem (ou seja, células cultivadas e primárias) podem diferir nos requisitos de coloração; ver relatórios publicados para mais detalhes^62,63.

1. Preparo de PKmito Orange
   NOTA: Outros corantes que geralmente coram o IMM foram relatados^64,65,66 e estão disponíveis comercialmente. A PKMO é a única utilizada neste protocolo.
   1. Ressuspender PKMO em pó (ver Tabela de Materiais) em DMSO de acordo com as instruções do fabricante⁸⁹. Aspirar o meio das células e lavar em meio pré-aquecido sem vermelho de fenol. Preparar um estoque de PKMO em DMEM pré-aquecido, livre de fenol e sem vermelho suplementado com 2% (v/v) de FBS ou 10% (v/v), dependendo do estado de diferenciação, HEPES para uma concentração final de 20 mM, e 1% (v/v) antibiótico-antimicótico antes de colorir as células seguindo as instruções do fabricante. Esta formulação, sem PKMO, é o meio de imagem de células vivas.
2. Coloração celular com PKMO
   1. Incubar as células com o corante a 37 °C e 5% CO_2, durante 30 min. Lavar as células três vezes com meios de imagem de células vivas e, para a lavagem final, incubar durante 30 minutos a 37 °C, 5% de CO₂.
   2. Adicione mídia de imagem de célula viva fresca e pré-aquecida. As células agora estão prontas para exames de imagem.
      NOTA: Tratamentos agudos (por exemplo, medicamentos e/ou estressores), quando usados, são adicionados antes de imagens ao vivo; veja a seção Discussão e a Figura Suplementar 1.

4. Imagem de células vivas por microscopia STED

NOTA: Este protocolo utiliza um sistema STED construído em torno de um microscópio invertido, com o sistema especificado na Tabela de Materiais. Este sistema é equipado com lasers de excitação pulsada (laser de 561 nm com potência nominal ~300 μW) e um laser de depleção STED pulsado de 775 nm (potência nominal de 1,2 W), um scanner de galvano continuamente ajustável e um detector de fotodiodo de avalanche (APD) baseado em filtro de 615/20 nm. Uma lente de imersão em óleo 100x/1.40 para STED é usada aqui. O software Lightbox é utilizado para aquisição de imagens. Todos os detalhes fornecidos estão relacionados diretamente a este software e configuração do sistema.

1. Diretrizes gerais e etapas para exames de imagem
   1. Use uma incubadora de estágio ou câmara ambiental para manter a viabilidade celular, mas experimentos de curto prazo à temperatura ambiente também são aceitáveis. Essas etapas são específicas para a configuração do STED descrita acima.
   2. Selecione os conjuntos de laser e filtro para geração de imagens.
      1. Use parâmetros para um corante laranja selecionando o(s) corante(s) usado(s) na coloração da Lista de Corantes, ou aquele com propriedades espectrais mais próximas do(s) corante(s) usado(s). Torne-os ativos clicando duas vezes ou arrastando-os para a lista de exemplo, onde diz "Arraste o(s) corante(s) aqui".
   3. Selecione uma região para a imagem.
      1. Em uma visão geral, crie uma região de interesse (ROI) ao redor de uma mitocôndria de interesse selecionando o botão ROI retangular e clicando e arrastando para moldar a região. O ROI pode ser redimensionado e girado usando os cantos da ROI ou bordas curvas que aparecem enquanto passa o mouse sobre um canto.
         NOTA: Um resumo dos parâmetros de imagem sugeridos pode ser encontrado na Tabela 1. Esses parâmetros foram ajustados empiricamente usando aqueles previamente relatados para essa configuração STED e combinação de corantes⁶³.
   4. Configurar o gating.
      1. Ao lado do menu Geral , selecione o menu Fechar ou clique e segure para adicionar o menu à exibição. Recomenda-se que o acoplamento do detector STED seja ajustado para 1-1,05 a 7,8-7,85 ns, como apresentado aqui. Os tempos de fechamento podem variar e ser tão curtos quanto 1-1,05 a 7-7,05 ns.
   5. Ajustar a intensidade adequadamente de acordo com a amostra.
      NOTA: Geralmente, o poder de excitação usado para STED é 2-3 vezes a potência usada para confocal, de modo que uma amostra que requer 5% de potência de laser de excitação para confocal pode usar 10%-15% de potência de laser de excitação durante a aquisição de STED.
      1. Ajuste o laser de excitação para STED para 15%-20% e o laser de depleção STED para 20%-25% com acúmulos de 10 linhas. Use um tempo de permanência de pixel de 4 μs com um tamanho de pixel de 20-25 nm. O orifício foi mantido a 1,0 UA para células cultivadas e 0,7 UA para células primárias do hipocampo de ratos, a fim de melhorar a secção óptica nas mitocôndrias mais densamente embaladas.
         NOTA: Imagens confocais e STED podem ser adquiridas para comparação lado a lado (Figura 3A, B, Figura 4A) ou somente STED podem ser adquiridas.
2. Informações adicionais para séries temporais/séries z
   1. Selecione a série temporal.
      1. Selecione o menu suspenso Hora. Defina o número de iterações (5 usadas aqui) e o intervalo de tempo (25 ou 30 s usados aqui) desejados para um timelapse (Figura 3C, D, Figura 4B).
         Observação : se o intervalo for menor do que o tempo de aquisição, as iterações continuarão sem qualquer atraso. Ao executar um timelapse, o acionamento de uma unidade de foco perfeita ou rastreamento de foco semelhante é altamente recomendado para evitar possíveis desvios.
   2. Defina o intervalo de volume.
      1. Defina o intervalo de volume z conforme desejado, ativando a opção Volume e ajustando as duas extremidades do intervalo. Os tamanhos de passo utilizados neste protocolo para aquisição de imagens 2D foram de 150-200 nm. O tamanho do passo recomendado em relação à amostragem de Nyquist necessária para a deconvolução de STED bruto pode ser calculado com ferramentas on-line⁹⁰.
         NOTA: A potência do laser de depleção STED e o número de planos fotografados podem aumentar o fotobranqueamento do corante e a exposição à luz da célula a níveis prejudiciais. Verifique se há sinais de fototoxicidade e fotodano após a aquisição.

5. Ferramentas analíticas e de processamento para ultraestrutura mitocondrial

NOTA: O processamento de imagens (ou seja, deconvolução) é opcional, mas normalmente usado ao criar e analisar imagens STED para publicação. A deconvolução para melhorar o contraste e reduzir o ruído é altamente sugerida para a segmentação ideal das cristas individuais, como descrito a seguir (Figura 2).

1. Deconvolução da imagem STED
   NOTA: O software utilizado para a deconvolução neste protocolo é fornecido na Tabela de Materiais.
   1. Defina os parâmetros microscópicos da imagem.
      NOTA: Certifique-se de que os metadados do microscópio são inseridos corretamente nos parâmetros microscópicos da imagem. Isso inclui a montagem do índice de refração médio; meio de imersão; tamanho do pixel; comprimentos de onda de excitação, emissão e depleção; e qualquer outra informação relevante. Modelos com esses parâmetros podem ser salvos para reutilização.
   2. Desconvolute imagens STED brutas com o algoritmo do software.
      1. O acesso a algoritmos de deconvolução automatizados em software de deconvolução permite o processamento de imagens de deconvolução hands-off. Selecione o botão Expresso e defina o tipo de deconvolução como Rápido, Padrão, Agressivo ou Conservador para diferentes graus de poder de deconvolução. Imagens representativas usando configurações Express Deconvolution with Aggressive são mostradas (Figura 3, Figura 4 e Figura 5).
      2. Salve as imagens do software de deconvolução no formato ICS2.
   3. Para deconvolução manual, execute as seguintes etapas.
      1. Resumidamente, ao executar a deconvolução manual, salve os modelos do assistente de deconvolução para consistência e tenha a opção de carregar um modelo ao iniciar o assistente. Use informações de PSF (função de propagação de ponto medido) se geradas com a configuração e os parâmetros de aquisição.
      2. Recorte a imagem STED bruta, se necessário, antes de fazer com que o software de deconvolução estabilize automaticamente a imagem. Complementos aos pacotes de software de deconvolução permitem a compensação específica de possíveis artefatos de imagem, como deriva térmica e aberrações cromáticas.
      3. Em seguida, gere um histograma logarítmico para executar manualmente ou automaticamente a subtração em segundo plano. Selecione o algoritmo clássico de deconvolução de estimativa de máxima verossimilhança (CMLE).
         Observação : para deconvolução, os valores chave a serem ajustados são o limite de relação sinal-ruído, o número de iterações e o limite de qualidade. Esses valores podem ser ajustados e a deconvolução pode ser visualizada para determinar as configurações ideais.
2. Segmentação e análise de partículas
   NOTA: Este protocolo utiliza FIJI (Is Just ImageJ), um software de código aberto (consulte Tabela de Materiais), para segmentação e análise. Outros softwares comparáveis, incluindo CellProfiler, Icy, Ilastik e QuPath, estão disponíveis para esses fins.
   1. Preparar imagens para segmentação.
      1. Abra as imagens STED raw .obf ou arquivos .ics2 do software de deconvolução indo para Arquivo → Abrir ou clicando e arrastando os arquivos para a barra de ferramentas do ImageJ. A partir daqui, qualquer processamento que facilite a segmentação das imagens pode ser realizado antes da segmentação.
      2. Para manter as alterações consistentes, registre funções usando Plug-ins → Macros → Grave e copie e cole comandos de tecla em uma nova macro, de Plug-ins → Nova Macro →. Certifique-se de selecionar a imagem a ser processada antes de executar a macro.
         NOTA: As alterações comumente aceitáveis para quantificação de tamanho e forma incluem corte, projeção de uma pilha z e subtração em plano de fundo com suavização desabilitada. As alterações devem ser realizadas de forma consistente entre as imagens dentro de um conjunto de dados e relatadas.
   2. Ajustar configurações de segmentação Weka treinável
      NOTA: Detalhes adicionais com instruções passo a passo para o uso da ferramenta de segmentação semi-automatizada e análises a jusante para mitocôndrias foram publicados⁹¹.
      1. Abra as imagens STED desconvolvidas no plugin Trainable Weka Segmentation (TWS)⁹² , localizado em Plugins → Segmentation → Trainable Weka Segmentation. Nas Configurações de segmentação, selecione os recursos de desfoque gaussiano, projeções de membrana e filtro Sobel . O padrão de espessura de membrana é 1 e o padrão de tamanho de patch de membrana é 19.
      2. Rotule a classe 1 ou 2 como "Cristae" e a outra como "Background" (Figura 2). Os modelos também podem ser salvos com o botão Salvar classificador . Selecione o classificador Load para reutilizar essas configurações para outras imagens.
   3. Execute rastreamentos de classe TWS.
      1. Use a ferramenta de linha ou outras formas para realçar algumas das cristas ou plano de fundo. Pelo menos algumas seleções de fundo devem incluir espaços entre as cristas. Desenhe uma linha sobre a estrutura para atribuir a qualquer classe e, em seguida, selecione o botão Adicionar a no lado direito para cristas ou fundo. Clique duas vezes em um rastreamento para remover a estrutura desse rótulo.
   4. Realizar treinamento de classificação TWS.
      1. Selecione o botão Classificar trem no lado esquerdo para gerar um mapa com base nas informações fornecidas ao plugin. A sobreposição de classes segmentadas pode ser ativada e desativada com o botão Alternar sobreposição, e a opacidade da sobreposição pode ser ajustada em Configurações. O classificador pode ser retreinado com etiquetas adicionais. Quando estiver satisfeito, selecione o botão Obter Probabilidade.
   5. Meça as partículas.
      1. Usando o mapa de probabilidade cristae, limite a imagem para gerar uma máscara e, em seguida, vá para Analisar → Analisar partículas. Geralmente, o tipo de limite padrão pode ser usado e o intervalo ajustado para garantir que todas as cristas sejam contabilizadas. As medidas fornecidas pela análise de partículas podem ser ajustadas por Analisar → Definir Medidas.
         NOTA: Exemplos de parâmetros de tamanho e forma, como área, perímetro, circularidade e proporção das cristas, são medidos e exibidos com base nas medidas selecionadas (Figura 2, Figura 5A, Tabela Suplementar 1).
      2. OPCIONAL: Selecione a imagem STED bruta com as mesmas dimensões da imagem desconvolvida e aplique as ROIs do gerente e, em seguida, selecione Medir no gerenciador de ROI para obter valores de intensidade.
   6. Obter gráficos de linha.
      1. Gráficos de linhas foram gerados a partir das imagens STED desconvolvidas. Desenhe uma linha multiponto, ajuste a espessura da linha para vários pixels de largura para calcular a média do ruído e gire a linha para se ajustar às mitocôndrias (Figura 2, Figura 5B). O gráfico de linhas resultante gerado é usado para medir distâncias pico-a-pico para relatar a periodicidade e distribuição das cristas em um determinado intervalo.
         NOTA: Relacionadamente, a densidade de cristas pode ser relatada como a contagem de cristas independentes dentro de uma determinada área, conforme determinado pela medição da parte externa da mitocôndria. A área mitocondrial pode ser determinada aplicando-se um filtro à imagem STED desconvolvida ou crua para gerar uma máscara. Certifique-se de que a máscara se ajusta com precisão ao contorno das mitocôndrias antes de medir a área.

Este protocolo descreve as condições de crescimento celular para células cultivadas e primárias com foco em imagens STED de células vivas e subsequentes análises de cristas mitocondriais. Projeções feitas com ImageJ de mitocôndrias de células SH-SY5Y indiferenciadas (Figura 3A) e SH-SY5Y diferenciadas por AR (Figura 3B) podem ser coletadas como pilhas z com confocal e STED tradicionais, e as imagens STED brutas podem então ser desconenvolvidas. Imagens com timelapse também podem ser realizadas e posteriormente desconvolvidas (Figura 3C,D). Usando parâmetros de imagem ligeiramente diferentes para neurônios primários do hipocampo de ratos (Tabela 1), imagens STED confocais e brutas podem ser adquiridas como pilhas z, e as imagens STED brutas podem ser desconvolvidas (Figura 4A). Imagens em timelapse de mitocôndrias de neurônios primários também são possíveis (Figura 4B). Em geral, as imagens de lapso de tempo devem ser capazes de mostrar eventos dinâmicos mitocondriais.

Quando as projeções STED brutas e STED z-stack desconvolvidas das amostras usadas para segmentação parecem consistentes, medições quantitativas são realizadas. O plugin TWS usa a imagem STED desconvolvida para segmentar para fazer uma máscara de probabilidade, que é então usada para criar uma máscara binária das cristas para obter parâmetros de tamanho e forma (Figura 5A). As regiões dessa máscara são salvas no gerenciador de ROI e podem ser aplicadas à imagem STED bruta se desejado para medir diferenças na intensidade relativa. As projeções STED deconvolved também podem ser usadas para determinar a periodicidade e densidade das cristas em uma determinada área (Figura 5B).

Figura 1: Morfologia mitocondrial. As mitocôndrias possuem um sistema de duas membranas que define diferentes subcompartimentos (A). Cristae são dobras da membrana interna com características definidas (B). Abreviações: OMM, membrana mitocondrial externa; ICS, espaço intracristal; IMS, espaço intermembrana; MC, membrana das cristas; IBM, membrana de contorno interno; MIM, membrana mitocondrial interna; TC, ponta das cristas; CJ, junção de cristae. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Esquema do fluxo de trabalho. As células SH-SY5Y ou neurônios primários do hipocampo de rato são cultivados em uma cobertura revestida de PDL. As células SH-SY5Y são cultivadas em paralelo para permanecerem indiferenciadas ou submetidas à diferenciação da AR ao longo de seis dias. Neurônios primários do hipocampo de ratos foram cultivados em uma cobertura revestida com PDL após serem isolados de seções hipocampais por sete dias. Uma vez prontas para serem imageadas, as células foram coradas com PKMO e imageadas com STED. As imagens STED brutas são então desconvolvidas e as imagens desconvolvidas são processadas em FIJI para obter medidas de tamanho e forma, como densidade de cristas, área, perímetro, circularidade e proporção de cristas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Imagem das mitocôndrias em células SH-SY5Y. Projeções representativas de STED confocal (esquerda), STED bruta (centro) e desconvolvida de Huygens (direita) de mitocôndrias de células SH-SY5Y não diferenciadas (A) e diferenciadas por AR (B) com coloração PKMO são mostradas. Um timelapse com intervalos de 30 s e 5 iterações de células SH-SY5Y diferenciadas por AR é mostrado (C) com regiões selecionadas (caixas brancas) expandidas sobre (D) usando imagens dimensionadas dessas regiões sem interpolação. Barras de escala: A,B, 250 nm; C,D, 1 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Imagem das mitocôndrias em neurônios primários do hipocampo de ratos. Projeções representativas de STED (esquerda), STED bruto (centro) e STED desconvolvido de Huygens (direita) de mitocôndrias de neurônios primários do hipocampo de ratos são mostradas (A). Um timelapse com intervalos de 25 s e 5 iterações de mitocôndrias nesses neurônios é mostrado (B). Barras de escala: A, 250 nm; B, 1 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Processamento de imagens STED desconvolvidas no ImageJ. O uso representativo do plugin Trainable Weka Segmentation para medir o tamanho e a forma das cristas é mostrado (A). Da esquerda para a direita, as seguintes imagens são mostradas: a imagem STED desconvolvida, o mapa de probabilidade baseado na segmentação do plugin TWS, a máscara de limiar em FIJI usando o mapa de probabilidade como entrada, a máscara com as ROIs delineadas e as ROIs sobrepostas à imagem STED desconvolvida original. As medidas resultantes de área, perímetro, circularidade e proporção correspondentes a esses objetos podem ser encontradas na Tabela Suplementar 1. Um gráfico de linhas usando a imagem STED desconvolvida para medir distâncias pico-a-pico como uma leitura para a densidade de cristas é mostrado (B). Barras de escala: 0,5 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Resumo dos parâmetros de aquisição de STED. As configurações usadas para imagens STED 2D para cada tipo de célula, SH-SY5Y indiferenciado, SH-SY5Y diferenciado por AR e neurônios primários do hipocampo de ratos são exibidos. Para todos os lapsos de tempo, 5 iterações foram tomadas com intervalos variáveis com base no tamanho do ROI.

Figura suplementar 1: Imagem de células SH-SY5Y com adição de β amiloide (Aβ). Imagens representativas confocais (esquerda), STED brutas (centro) e STED desconvolvidas (direita) de células SH-SY5Y diferenciadas por AR com coloração PKMO (superior) e Aβ-HiLyte647 (inferior) são mostradas (A). Projeções z-stack mescladas de PKMO STED bruto (verde) com STED Aβ bruto (magenta) (B) ou PKMO STED desconvolvido (verde) com STED Aβ desconvolvido (magenta) (C) são mostradas. Barras de escala: 0,5 μm. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 1: Medidas de tamanho e forma das cristas segmentadas. As medidas de tamanho e forma de área (μm2), perímetro (μm), circularidade e proporção, correspondentes aos objetos delineados na Figura 5A a partir de mitocôndrias segmentadas, são mostradas. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 2: Resumo dos parâmetros de aquisição com amostras de β amiloide. As configurações usadas para imagens STED 2D de PKMO e Aβ-HiLyte647 em células SH-SY5Y indiferenciadas e diferenciadas por AR são exibidas. Confocal de Aβ-HiLyte647 pode ser usado sozinho, pois não há estrutura específica para resolver; Imagens STED de Aβ-HiLyte647 são mostradas aqui para tamanhos de partículas menores. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 1: Protocolo de tratamento com β amiloide. Clique aqui para baixar este arquivo.

Os autores não têm nada a revelar.