Triagem análoga de fentanil usando LC-TIMS-TOF MS/MS

Resumo

Um método para a triagem de análogos de fentanil com base em seu tempo de retenção, mobilidade e padrão de fragmentação de espectrometria de massa.

Resumo

O uso de fentanil e o surgimento de análogos de fentanil nas últimas décadas tornaram-se uma preocupação crescente para a comunidade em geral. O fentanil e seus análogos são os principais contribuintes para overdoses fatais e não fatais nos Estados Unidos. Os casos mais recentes de overdose relacionada ao fentanil estão ligados ao fentanil fabricado ilicitamente e sua potência extrema associada. No presente trabalho, descrevemos um protocolo analítico de alto rendimento para a triagem de análogos do fentanil. O uso de cromatografia líquida complementar, espectrometria de mobilidade de íons aprisionados e espectrometria de massa em tandem permite a separação e atribuição de centenas de análogos de fentanil de uma única amostra em uma única varredura. A abordagem descrita aproveita o desenvolvimento recente de aquisição dependente de dados e aquisição independente de dados usando acumulação paralela na armadilha de mobilidade seguida de fragmentação sequencial usando dissociação induzida por colisão. Os análogos do fentanil são atribuídos com confiança com base em seu tempo de retenção, mobilidade e padrão de fragmentação da EM.

Introdução

O fentanil e seus análogos são os principais contribuintes para overdoses fatais e não fatais nos Estados Unidos ^1,2. O Centro de Controle e Prevenção de Doenças (CDC) informou que o número de mortes por overdose relacionadas a opioides sintéticos de 2013 a 2021 foi superior a 258.000. Somente em 2021, mais de 68.000 mortes por overdose podem ser atribuídas a opioides sintéticos, totalizando 82% de todas as mortes relacionadas a overdose no país³. Desde 2013, centenas de análogos do fentanil foram identificados, com potência variável⁴. Com o surgimento de análogos de fentanil fabricados ilicitamente, o próprio opioide sintético de programação II continua sendo o opioide sintético mais popular disponível nos Estados Unidos³. De acordo com o Centro de Pesquisa e Educação em Ciências Forenses (CFSRE), o análogo de fentanil mais relatado em 2022 foi o fluorofentanil, com opioides sintéticos adicionais não relacionados ao fentanil agora sendo introduzidos na oferta volátil do mercado de drogas em um ritmo rápido⁵.

Devido ao volume esmagador de fentanil e análogos relacionados ao fentanil circulando no mercado de drogas, a DEA implementou um programa de perfil de assinatura de fentanil intitulado Operação Death Dragon, a fim de rastrear a metodologia usada para sintetizar esses compostos com a esperança de vincular as apreensões de drogas à sua origem⁶. Em 2018, 94% das apreensões de drogas foram identificadas como sintetizadas pelo método Janssen, enquanto os 6% restantes foram sintetizados pelo método de Siegfried⁶. A principal diferença entre os dois métodos é a presença do análogo do fentanil, benzil fentanil, detectado como impureza no método Janssen, enquanto a presença de despropionil fentanil (4-ANPP), um metabólito/precursor do fentanil, é uma impureza detectada ao sintetizar com o método de Siegfried⁷.

O uso de cromatografia gasosa e líquida em conjunto com espectrometria de massa (GC-MS e LC-MS, respectivamente) para a triagem e quantificação direcionadas de opioides sintéticos é regularmente implementado em laboratórios de toxicologia. O GC-MS tem sido considerado o padrão-ouro para a detecção de drogas de abuso em espécimes biológicos. O acesso a bibliotecas espectrais de massa disponíveis publicamente⁸ e instrumentação comercializada como sistemas plug and play⁹ são algumas das razões pelas quais o GC-MS permaneceu parte integrante dos laboratórios tanto para triagem abrangente quanto para quantificação direcionada ^9,10. No entanto, os métodos atuais de quantificação de GC-MS na literatura tendem a ter um escopo limitado de analitos¹¹ e rapidamente se tornam desatualizados e não aplicáveis aos casos atuais. Mais importante, os limites de detecção e quantificação não são comparáveis aos métodos LC-MS (< 1 ng/mL)¹², aumentando, portanto, o potencial de resultados falso-negativos. Uma dessas comparações entre GC-MS e LC-MS, que analisou amostras post-mortem, observou que de 134 casos identificados positivamente de carfentanil, um dos opioides sintéticos mais potentes até o momento, 104 desses casos foram negativos para carfentanil utilizando GC-MS¹³. Em laboratórios de análise de drogas, o GC-MS é mais frequentemente utilizado e alterável para opioides sintéticos devido à alta concentração das amostras analisadas. No entanto, o GC-MS ainda é utilizado em conjunto com técnicas adicionais, como espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR) e microscopia eletrônica de varredura (MEV) para a confirmação desses compostos¹⁴. A aplicação de GC-MS à análise de espécimes biológicos em toxicologia forense requer métodos de preparação de amostras que incluam a extração desses compostos usando extração líquido-líquido (LLE) ou extração em fase sólida (SPE)¹⁵. O LLE pode ser conduzido com uma variedade de solventes, no entanto, em um laboratório de alta produção, o LLE pode não ser econômico ou oportuno. O LLE consome grandes quantidades de solventes, bem como o volume da amostra, enquanto a alternativa, SPE, pode ser automatizada e requer um volume mínimo de amostra¹⁶. Um estudo recente de GC-MS relatou a separação de 20 análogos isoméricos diferentes de fentanil usando três programas térmicos de GC separados¹⁷. Embora a separação de linha de base entre os isômeros tenha sido bem-sucedida, a aplicabilidade desse método a casos e fluxos de trabalho forenses relevantes é limitada.

A LC-MS ganhou popularidade em testes forenses, especialmente devido às limitações da GC-MS quando se trata de compostos não voláteis e sensíveis ao calor^18,19. A triagem de LC-MS utilizando quadrupolos triplos (QQQ) e instrumentação de armadilha de íons tem sido bem-sucedida na detecção de opioides sintéticos em baixas concentrações (<1 ng/mL)12,20,21,22,23,24. Normalmente, esses métodos de LC-MS são usados como métodos de confirmação secundários para complementar os resultados do imunoensaio e/ou GC-MS. Em 2017, Shoff et al. no laboratório de toxicologia do departamento de legistas do condado de Miami-Dade (MDME) desenvolveram um método de triagem abrangente para 44 compostos relacionados a opioides usando cromatografia líquida de ultra alta pressão (UHPLC) - armadilha de íons-MS^{n 13}. Semelhante aos métodos MRM direcionados, este método de armadilha de íons utilizou uma lista de precursores programada (SPL) contendo tempos de retenção, íons alvo precursores, bem como íons filhos primários para fragmentação espectral MS³ quando possível. O que separa este método de triagem dos métodos desenvolvidos em quadrupolos triplos e armadilhas de íons quadrupolo lineares são os detalhes adicionais fornecidos nos dados espectrais. O que esse método de triagem não pode fornecer é a análise quantitativa, que raramente é desenvolvida em instrumentação de armadilha de íons, bem como a identificação de incógnitas¹³. Os métodos LC-QQQ para opioides sintéticos podem rastrear e quantificar simultaneamente uma lista de alvos predefinida. O uso de transições de monitoramento de reações múltiplas (MRM) para a identificação e quantificação de compostos é uma técnica confiável de aquisição de dados e é a técnica mais comum utilizada na literatura para a detecção de opioides sintéticos^12,20. Os intervalos lineares relatados para a quantificação de uma série de opioides sintéticos variam de 0,01 a 100 ng/mL, com opioides sintéticos mais potentes, como o carfentanil, detectados na faixa sub-ng/mL¹ 1,24,25,26,27.

A separação de opioides sintéticos isoméricos tem sido abordada em métodos de LC-MS. Um desses métodos separou 174 análogos isoméricos de fentanil em um tempo de execução de 16 minutos usando uma coluna de bifenil²⁸. Além disso, flutuações nos parâmetros dependentes de LC, como eficiência da coluna, pH da fase móvel e mudanças de pressão, criam mudanças no tempo de retenção que devem ser contabilizadas em ensaios direcionados com monitoramento consistente e janelas de coleta maiores (>0,4 min), o que pode resultar em potencial sobreposição desses isômeros uma vez resolvidos. Técnicas cromatográficas adicionais para a separação de isômeros foram exploradas, incluindo o uso de cromatografia líquida bidimensional (2D-LC) ²⁹ ; E embora essa técnica tenha a capacidade de fornecer separação ortogonal de compostos, as desvantagens superam as vantagens, incluindo tempos de execução excessivos, custo, dificuldade no desenvolvimento de métodos e utilidade em comparação com separações alternativas³⁰.

A espectrometria de massa de alta resolução (HRMS) está se tornando cada vez mais confiável para a identificação de opioides sintéticos. Várias empresas de instrumentação comercializaram métodos direcionados desenvolvidos com o objetivo de identificar uma ampla gama de opioides sintéticos em matrizes biológicas complexas 19,28,31. Esses métodos, ao contrário dos métodos discutidos anteriormente, podem armazenar dados analíticos para análise retroativa. Assim, espécimes que foram previamente analisados com resultados indeterminados podem ser revisitados posteriormente para descoberta de compostos recém-identificados. O que separa o HRMS do QQQ é a identificação precisa em massa. Embora ambas as técnicas de MS possam quantificar com precisão em baixas concentrações, o HRMS provou ser mais eficaz para a triagem inicial e descoberta de compostos desconhecidos 32,33,34. O HRMS, especificamente com analisadores MS de tempo de voo (TOF), tem estado na vanguarda da descoberta do NPS, permitindo que os laboratórios de testes forenses forneçam dados sensíveis ao tempo sobre novos compostos para a aplicação da lei e para a comunidade científica para dimensionar a disseminação de alguns desses compostos, aumentando a conscientização e a educação³³. O uso de TOF para a detecção de drogas de abuso tornou-se extremamente abrangente, com métodos contendo mais de 600 compostos separados em um programa cromatográfico de 10 minutos. Estudos anteriores relataram as vantagens da espectroscopia de mobilidade iônica aprisionada (TIMS) acoplada à TOF para detecção e separação de opioides isoméricos³⁵.

Aproveitando a ortogonalidade entre cromatografia líquida, espectrometria de mobilidade iônica aprisionada e espectrometria de massas, o método apresentado fornece uma ampla caracterização de análogos de fentanil com base no tempo de retenção, padrão isotópico, mobilidade e padrão de fragmentação.

Protocolo

1. Preparação da amostra

1. Armazene o kit de triagem análoga de fentanil a -20 °C após o recebimento. Ressuspenda cada amostra até uma concentração final de 400 μg/mL pela adição de 500 μL de metanol puro de grau LC/MS.
2. Misture usando um misturador de placas ou vórtice a 400 rpm por 1 h ou vórtice em velocidade média por 15 min. Após a ressuspensão, conservar os frascos para injetáveis a -20 °C.
3. Diluir cada padrão até uma concentração final de 1 ng/ml utilizando metanol puro de qualidade LC/MS.
4. Agrupe os padrões em grupos, de modo que cada grupo não contenha nenhum padrão isomérico. Consulte a Tabela Suplementar 1 para obter a divisão dos 14 grupos de padrões de fentanil.

2. Preparação das fases móveis da HPLC

1. Prepare a fase móvel A (MPA) usando 5 mM / L de formiato de amônio (NH₄HCO₂) em H₂O com 0,05% de ácido fórmico (85%).
   1. Pesar 0,078 g de NH₄HCO₂, despejar em um balão volumétrico de 250 mL e encher com água até cerca de 2/3^rd. Agite para misturar bem.
   2. Depois de totalmente dissolvido, adicione 0,125 mL de ácido fórmico (85%). Encha com água até a linha de enchimento (250 mL) e misture.
2. Prepare a fase móvel B (MPB) usando ácido fórmico a 0,05% em uma mistura de acetonitrila com metanol 1:1.
   1. Despeje 125 mL de acetonitrila em um balão volumétrico e adicione metanol até atingir a linha de enchimento.
   2. Agite para misturar bem. Adicione 0,125 mL de ácido fórmico a 0,05% ao frasco e misture para homogeneizar.

3. Desenvolvimento de métodos de HPLC

1. Abra o software LC na tela inicial. Na tabela de exemplo, localizada no centro da janela, crie um novo protocolo.
   1. Anote a coluna do frasco com o local da amostra. Anote a coluna ID de exemplo usando o YYYYMMDD_NAME de formato (descritor representativo). Anote a coluna de volume com o volume de injeção desejado (15 μL).
2. Anote a coluna do caminho de dados com o local onde os dados serão salvos.
3. Entrada do método de HPLC
   1. Selecione Novo na barra na tabela de exemplo localizada no meio da tela. No método de separação, selecione a seta suspensa e clique em Novo método na janela pop-up.
   2. Uma nova janela aparecerá rotulada como método de separação, aqui edite o tempo de aquisição ou o método do sistema da estrutura de controle do instrumento (ICF).
   3. Clique duas vezes no botão Edit Method do sistema ICF para abrir o pop-up para editar o gradiente binário, como visto na Figura 1.
   4. Na guia gradiente binário, uma representação visual do gradiente está à esquerda e a divisão do gradiente está à direita, defina os carimbos de data/hora, a taxa de fluxo e as concentrações de MPA e MPB.
   5. Certifique-se de que o tempo de parada esteja definido para 18 min, a vazão para 0.400 mL/min e o limite de pressão min e max em 0 psi e 6000 psi.
   6. Defina as concentrações de carimbo de data/hora da seguinte forma:
      Em 0.00 min, defina a concentração B para 20.0.
      Em 1.50 min, defina a concentração B para 25.0.
      Aos 3.00 min, defina a concentração B para 27.0.
      Às 6.00 min, defina a concentração B para 27.0.
      Aos 6,50 min, defina a concentração B para 30,0.
      Às 7.00 min, defina a concentração B para 95.0.
      Às 16.00 min, defina a concentração B para 95.0.
      Às 16.50 min, defina a concentração B para 20.0.

4. Inicialização da HPLC

1. Na seção de coluna de HPLC, insira a coluna LC (coluna monolítica de HPLC C18 de 100 mm x 4,6 mm) e as proteções da coluna (coluna de proteção de 5 mm x 4,6 mm). Preste atenção à pressão mínima e máxima da coluna.
2. Execute um exemplo em branco (mesma solução tampão) para testar se há vazamentos e criar uma linha de base. Procure por vazamentos. Vazamentos podem ser observados por flutuações de pressão da coluna. Se houver vazamentos, determine de onde eles podem estar vindo e aperte as conexões.
3. Execute um exemplo em branco (mesma solução tampão) usando o programa LC desejado para pré-condicionar a coluna.

5. Desenvolvimento do método timsTOF MS / MS

1. Abra o aplicativo timsControl. No lado esquerdo da janela estão as configurações MS e TIMS.
   1. Em Configurações de MS, defina o início e o término da varredura para 50 m/z e 1800 m/z, respectivamente. Selecione o modo positivo para a polaridade do íon e selecione a fragmentação serial de acumulação paralela para o modo de varredura.
   2. Em Configurações TIMS, defina o Modo como personalizado, 1/K0 começa como 0.40 Vs/cm², 1/K0 termina como 1.85 Vs/cm², ramp tempo definido como 150.0 ms e média MS definida como 1.
2. Na seleção inferior de guias, em Origem, execute as seguintes alterações nas duas caixas de configuração.
   1. Na fonte, ajuste o deslocamento da placa final para 500 V, capilar para 4500 V, nebulizador para 3.0 bar, gás seco para 10.0 L/min e temperatura seca para 200 °C.
   2. Nas configurações da bomba de seringa, certifique-se de que a seringa seja Hamilton 1 mL, ativa habilitada e a taxa de fluxo definida para 80.0 μL/h.
3. Na guia Ajuste, execute as seguintes alterações nas guias de configuração para Geral, Processamento e TIMS.
   1. Na guia de configurações gerais, configure as seguintes seções: transferência, célula de colisão, quadrupolo, foco pré-TOF e detecção.
      1. Nas configurações de transferência, defina a deflexão 1 delta para 70.0 V, funil 1 RF para 341.0 Vpp, energia CID para 0.0 eV, funil 2 RF para 300.0 Vpp, RF multipolar para 300.0 Vpp.
      2. Nas configurações da célula de colisão, certifique-se de que a energia de colisão esteja definida como 6.0 eV e a RF de colisão como 1200.0 Vpp.
      3. Nas configurações quadrupolo, certifique-se de que a energia do íon esteja definida para 6.0 eV e a baixa massa para 250.00 m/z.
      4. Nas configurações de foco pré-TOF, defina o tempo de transferência para 75.0 μs e o armazenamento pré-pulso para 5.0 μs.
   2. Na guia de configurações de processamento, configure as seguintes seções: detecção de pico de espectro de massa e detecção de pico de mobilidade.
      1. Nas configurações de pico do espectro de massa, desmarque a soma das intensidades (área) e defina o limite absoluto para 667.
   3. Na guia TIMS, configure as seguintes seções: deslocamentos, controle de mudança de íons e parâmetros avançados.
      1. Na configuração de deslocamentos, defina Δt1 a -20.0 V, Δt2 a -100.0 V, Δt3 a 40.0 V, Δt4 a 80.0 V, Δt5 a 0.0 V, Δt6 a 120.0 e célula de colisão em 250.0 V.
      2. Nas configurações de controle de carga iônica, clique na caixa para ativar e definir a intensidade desejada para 5.00 M.
      3. Nos parâmetros avançados, ative o acúmulo de bloqueio para a faixa de mobilidade.
4. Na guia MS/MS, defina o modo de varredura para fragmentação serial de acumulação paralela e configure as seguintes seções: íons precursores, programação, exclusão ativa, configurações de energia de colisão, configurações de largura de isolamento e revisão TIMS.
   1. Em íons precursores, defina o número de rampas de fragmentação serial de acumulação paralela para 8, carregue no mínimo para 1 e carregue no máximo para 5.
   2. Em Configurações de agendamento, habilite as repetições precursoras. Em exclusão ativa, marque a caixa para ativar e definir a liberação para 0,40 min depois.
   3. Não ajuste as configurações de energia de colisão e as configurações de largura de isolamento. Clique na caixa de revisão TIMS para ativar.

6. Mobilidade e calibração de massa

1. Execute a calibração para os domínios m/z e mobilidade. Nas configurações de calibração m/z, selecione um dos perfis de mixagem de afinação pré-carregados na caixa de listagem de referência que aparece no menu suspenso.
2. Para calibrar, carregue a seringa para o TOF com uma solução de mistura de afinação. No lado direito da janela, use as configurações intituladas modo de calibração para os vários tipos de calibração a serem definidos para obter a pontuação mais alta.
3. Certifique-se de que a pontuação seja o mais próximo possível de 100%. Alterne entre linear, quadrádico e quadrático aprimorado para obter a melhor pontuação.
4. Calibre para mobilidade seguindo as etapas 6.1-6.3 usadas para calibrar m/z.
5. Depois de calibrado, salve o método MS selecionando a guia Método na barra superior. No menu suspenso, selecione Salvar como para gerar um novo arquivo de método MS.

7. Criação de aquisição independente de dados (dia) método de fragmentação serial de acumulação paralela

1. Uma vez que um conjunto de dados tenha sido coletado na fragmentação serial de acumulação paralela de aquisição dependente de dados (dda), execute os experimentos em dia. Abra o aplicativo de software de mobilidade iônica e carregue o método dda salvo na etapa 6.5.
2. Deixe todas as configurações iguais esperadas para a configuração MS, altere-a de fragmentação serial de acumulação paralela para fragmentação serial de acumulação paralela de diâmetro.
3. Na parte inferior do painel, selecione a guia MSMS e clique em Editor de Janelas para abrir o pop-up da janela de diâmetro mostrado na Figura 2.
4. Carregue o conjunto de dados dda salvo anteriormente (arquivo .m) usando o botão de análise aberto localizado na parte superior da janela pop-up.
5. Um mapa de calor aparece no canto inferior esquerdo exibindo janelas com um polígono de janelas correndo diagonalmente pelo gráfico. Clique e arraste para redimensionar o polígono para que ele caiba nos dados do mapa de calor (os cantos são selecionáveis clicando duas vezes nas linhas laterais, aparecerá um ponto que pode ser arrastado e redimensionado).
6. À direita das janelas estão as configurações da janela. Defina a largura da massa (50 é ir para) e defina a sobreposição horizontal, ambos em Da.
7. Defina o número de janelas de mobilidade por largura de massa e a sobreposição vertical.
8. Clique em Calcular Janelas no canto inferior direito do pop-up para ver as janelas exibidas com as novas configurações. Quando adequado, clique em Aplicar dia-PASEF Windows ao método. Isso fechará o pop-up, trazendo-o de volta à tela inicial.

8. Processamento de dados TOF de mobilidade iônica HPLC

1. Abra o software de análise de dados. No canto superior esquerdo, clique na guia Arquivo e selecione Abrir no menu suspenso. Na janela de novos arquivos, selecione os arquivos de sua escolha e clique em Abrir.
2. Verifique a calibração. Clique com o botão direito do mouse no nome do arquivo na caixa de análise e selecione Propriedades. Uma janela rotulada file name_analysis properties aparecerá. Selecione Status da calibração.
3. Na caixa suspensa, selecione Calibração do instrumento para o espectrômetro de massa. Confirme se o erro não é superior a 1 μg/mL. Selecione Calibração de Mobilidade Inicial e confirme se o erro não é maior que 1 μg/mL.
4. Preparar um cromatograma no software de análise de dados, conforme descrito a seguir.
   1. Clique com o botão direito do mouse em Cromatograma sob o nome do arquivo, selecione Editar cromatograma. Em tipo, clique na caixa suspensa e selecione Extraído
   2. Em filtro, selecione Todos os MS e, com o modo de verificação, selecione Todos. Isso é para ver os picos da molécula de interesse, em vez de apenas seus fragmentos.
   3. Abaixo disso, procure as duas opções de filtro para seleção de moléculas: massas ou fórmula destacadas em azul.
   4. Se estiver usando massas para extrair um íon, insira o m/z teórico da molécula de interesse. Para este caso, selecione (massa para resultado representativo) m/z.
   5. Se estiver usando fórmula para extrair um íon, insira a fórmula para a molécula, bem como as formas de íons de interesse para o cromatograma. Neste caso, selecione o íon protonado, [M+H]⁺.
   6. Defina a polaridade para o modo positivo.
5. Espectro de massa
   1. Clique com o botão direito do mouse na linha de base do pico do composto e arraste para a outra borda do pico. Isso criará um espectro de massa de fragmentos dentro desse tempo de retenção.
6. Geração de Mobilograma
   1. Clique com o botão direito do mouse na guia esquerda intitulada mobilograma e selecione Editar Mobilograma. Uma janela intitulada editar traços de mobilograma aparecerá. Siga as etapas 8.4.2-8.4.7 para editar o cromatograma.
   2. Na entrada de tempo de retenção, adicione o intervalo de tempo de retenção do pico de interesse.
   3. Depois que os parâmetros forem selecionados, clique em Adicionar seguido de Ok no canto superior direito da janela de edição de rastreamentos de momobilografia.
   4. Após um curto período de tempo, o software processará as seleções desejadas e produzirá um cromatograma. Repita as etapas 8.6.1 a 8.6.3 para todos os íons da mistura.
   5. Gerando os espectros compostos
      1. Na parte inferior da janela de visualização do espectro, selecione Profile MS e Fragment MS. Isso permitirá incluir íons de varredura completa e PASEF.
      2. Na visualização do espectro, clique com o botão direito do mouse e selecione Copiar espectros compostos. Com os dados de espectro que aparecem à direita, encontre mais informações sobre o composto, como poder de resolução de resolução, intensidade e relação sinal-ruído (S/N).
   6. Processamento de dados
      1. Para processar os dados, integre manualmente o cromatograma e os picos de mobilidade para fornecer informações importantes sobre a molécula de interesse.
      2. Clique com o botão direito do mouse em Localizar e selecione Integrar apenas cromatograma ou mobilograma. Clique com o botão esquerdo e arraste para destacar o pico desejado. As informações serão exibidas, incluindo tempo de retenção, área, S/R e mobilidade.

Resultados

O kit de triagem análoga de fentanil de 250 padrões análogos foi dividido em 14 grupos: 12 grupos de 17 análogos e 2 grupos de 16 análogos, para evitar interferências m/z. Cada análogo é ainda caracterizado por seu m/z, tempo de retenção (RT), mobilidade (K) e padrão de fragmentação MS/MS.

Exemplos de separações isoméricas são mostrados na Figura 3 e na Figura 4 para a fórmula química C₂₂H₂₈N₂O₂ e C₂₁H₂₈N₂OS, respectivamente.

O kit de triagem análoga de fentanil contém quatro isômeros com a fórmula química C₂₂H₂₈N₂O₂ (ver Figura 3). A inspeção da Figura 4 mostra o cromatograma de íons extraídos [M+H]⁺ , os mobilogramas, o padrão isotópico e o padrão de fragmentação MS/MS. O metoxiacetil fentanil e o carbamato de fentanil se separam bem nos domínios LC e mobilidade do para-metoxiacetil fentanil e do B-hidroxila fentanil. No entanto, uma separação clara entre o para-metoxiacetil fentanil e o B-hidroxil fentanil é alcançada por seus padrões de fragmentação.

O kit de triagem análoga de fentanil contém três isômeros com a fórmula química C₂₁H₂₈N₂OS. A inspeção da Figura 4 mostra o cromatograma de íons extraídos [M+H]⁺ , os mobilogramas, o padrão isotópico e o padrão de fragmentação MS/MS. O a-metil tiofentanil e o (±)-trans-3-metil tiofentanil se separam no domínio LC, mas não no domínio da mobilidade. Além disso, (±)-trans-3-metil tiofentanil e (±)-cis-3-metil tiofentanil se separam no domínio da mobilidade e não no domínio LC. Isso mostra a complementaridade da LC e a separação da mobilidade, melhorando a identificação das espécies isoméricas através da ortogonalidade dos domínios. A Figura 4D resume esse resultado fornecido por LC e mobilidade.

Figura 1: Rampa de gradiente no software. Gradientes de tempo de gradientes de caixa de diálogo do método do sistema ICF durante a separação, dependendo da porcentagem de concentração de B. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: configurações da janela dia-PASEF. Nos métodos dia-PASEF MS, as configurações de MS/MS são exclusivas. O gráfico à esquerda mostra os polígonos da janela ajustados a partir dos dados registrados no método dda-PASEF. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Cromatograma típico de íons extraídos, mobilograma extraído e projeção de MS amplificada para opioides isoméricos. (A) Estruturas de metoxiacetil fentanil, para-metoxiacetil fentanil, β-hidroxi fentanil, carbamato de fentanil e o respectivo (B) tempo de retenção típico, (C) mobilidade típica, (D) sinal isomérico, (E) fragmentos principais e (F) representação da fragmentação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Cromatogramas de íons extraídos típicos e mobilogramas extraídos para opioides isoméricos. (A) Estruturas de α-metil tiofentanil, (±)-trans-3-metil tiofentanil e (±)-cis-3-metil tiofentanil. Para os respectivos isômeros, (B) tempo de retenção típico, (C) mobilidade típica, (D) ortogonalidade entre o tempo de retenção e a mobilidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela suplementar 1: Grupos de mistura. Esta tabela descreve quais opioides estão em cada uma das 14 misturas criadas para este procedimento. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

A separação analítica de amostras biológicas contendo alto teor de isoméricos pode ser analiticamente desafiadora. Neste trabalho, o método descrito visa caracterizar 29 conjuntos de isômeros, para um total de 185 análogos de um kit padrão de 250 opioides. Durante a preparação do grupo de teste, é importante garantir que não haja dois análogos com m/z que não possam ser distinguidos experimentalmente. Os dados descritos aqui usam padrões que não são de uma matriz baseada em humanos, se esse método for usado em um experimento de campo; Ensaios adicionais usando a matriz de interesse são necessários para garantir a aplicabilidade do método. A matriz pode fazer com que os analitos ionizem de maneira diferente do que em um experimento livre de matriz, tornando imperativo determinar quais formas de íons prevalentes serão observadas. Na análise, a identificação é baseada nos padrões isotópicos das formas mais abundantes (por exemplo, [M+H]⁺¹ e [M+Na]⁺¹).

A escolha do programa LC é crítica nos casos em que os isômeros não estão separados no domínio da mobilidade. A diminuição da inclinação do gradiente pode aumentar a especificidade do método, aumentando a diferença entre os picos cromatográficos.

Durante a análise dos dados, é importante que os sinais não relevantes sejam ignorados ao determinar o tempo de retenção e a mobilidade. As vantagens do HRMS permitem janelas m/z estreitas (resolução de massa típica de ~50.000) com filtragem de mobilidade adicional, reduzindo assim o ruído químico.

O método descrito aqui fornece uma biblioteca de referência para a triagem de análogos de fentanil de uma amostra desconhecida. O padrão de fragmentação RT, K, isotópico e MS relatado é usado como qualificadores durante o processamento de dados e atribuição desconhecida. Quando comparado à análise tradicional de MRM LC-QQQ, enquanto LOD semelhante é alcançável 13,19,27, a vantagem única é rastrear opioides alternativos não incluídos no banco de dados gerado usando o kit FID. Cada novo opioide exigirá a análise usando um padrão sintético para sua validação final.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Formato de amônio para HPLC	Fluka	17843-50G
Eppendorf  Tubos de Microcentrífuga de Bloqueio Seguro	Fisher	05-402-25
ESI-L Mistura de Ajuste de Baixa Concentração	Agilent	G1969-85000
Kit de Triagem Analógica de Fentanil (FAS)	Cayman Chemical	9003237, 9003286, 9003380, 9003381	kit de 250 opioides sintéticos, 210 análogos de fentanil, divididos em um kit e versões de painel emergente 1-4
Ácido fórmico Optima LC/MS	Fisher	A117-50
Coluna de proteção de ônix (5 x 4,6 mm)	Phenomenex	CHO-7649	para colunas C18
Coluna monolítica de ônix C18 HPLC (100 x 4,6 mm)	Coluna Phenomenex	CHO-7643	fase reversa C18 LC
Grau Optima acetonitrila	Fisher	A996-4
Optima grau metanol	Fisher	A454-4
Optima grau água	Fisher	W7-4
Pipeta	Fisher	05-719-510	kit de 1-10 µ L, 10-100 µ L e 100-1000 µ L
Pontas de pipeta 10µ L	Fisher	94060100
Ponteiras de Pipeta 1000µ L	Fisher	94056710
Ponteiras de Pipeta 200µ L	Fisher	94060310
Misturador de placas	IKA	MS 3 D S1	IKA MS 3 digil
Proeminência LC-20 CE cromatógrafo líquido ultrarrápido	Shimadzu, Japão		equipado com DGU-20A5, LC-20AD, SIL-20AC, CTO-20A, SPD-M20A, CBM-20A, SPD-20A
timsTOF Pro	Bruker Daltonics Inc., Billerica, MA		timsTOF instrumento com PASEF