Ensaio de plugue de gel de matriz in vivo modificado para estudos de angiogênese

Resumo

O método aqui apresentado pode avaliar o efeito dos reagentes na angiogênese ou permeabilidade vascular in vivo sem coloração. O método utiliza injeção de dextran-FITC através da veia caudal para visualizar neovasos ou extravasamento vascular.

Resumo

Vários modelos têm sido desenvolvidos para investigar a angiogênese in vivo. No entanto, a maioria desses modelos é complexa e cara, requer equipamentos especializados ou é de difícil execução para posterior análise quantitativa. Apresentamos aqui um ensaio de plugue de gel de matriz modificado para avaliar a angiogênese in vivo. Nesse protocolo, as células vasculares foram misturadas com gel de matriz na presença ou ausência de reagentes pró-angiogênicos ou antiangiogênicos e, em seguida, injetadas por via subcutânea no dorso dos camundongos receptores. Após 7 dias, tampão fosfato salino contendo dextran-FITC é injetado através da veia caudal e circulado nos vasos por 30 min. Os plugues de gel de matriz são coletados e embebidos com gel de incorporação de tecido, em seguida, cortes de 12 μm são cortados para detecção de fluorescência sem coloração. Neste ensaio, dextran-FITC com alto peso molecular (~150.000 Da) pode ser usado para indicar vasos funcionais para detectar seu comprimento, enquanto dextran-FITC com baixo peso molecular (~4.400 Da) pode ser usado para indicar a permeabilidade de neo-vasos. Em conclusão, este protocolo pode fornecer um método confiável e conveniente para o estudo quantitativo da angiogênese in vivo.

Introdução

A angiogênese, processo de formação de neovasos a partir de vasos pré-existentes, desempenha papel crítico em muitos processos fisiológicos e patológicos, como desenvolvimento embrionário, cicatrização de feridas, aterosclerose, desenvolvimento tumoral, etc.1,2,3,4,5. Esse processo dinâmico envolve várias etapas, incluindo a degradação da matriz, proliferação de células vasculares, migração e auto-organização para formar estruturas tubulares e a estabilização dos neovasos⁶. A promoçã....

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Wenzhou Medical University (XMSQ2021-0057, 19 de julho de 2021). Todos os reagentes e consumíveis estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparo do meio de cultura

1. Meio de cultura 10x M199: Dissolver o pó M199 na concentração de 10x com 90 mL de água deionizada e adicionar 10 mL de soro fetal bovino (SFB), passando em seguida por um filtro de 0,22 μm. Conservar o meio a 4 °C até 2 meses.
2. Meio de cultura endotelial completo: Adicionar 50 mL de SFB, 5 mL....

Resultados

A Figura 1 é o fluxograma descrevendo como preparar a mistura de gel de matriz, células vasculares, meio de cultura e reagente. A mistura foi então injetada por via subcutânea no dorso de camundongos Nu/Nu e aquecida usando uma almofada de aquecimento para acelerar sua coagulação e, finalmente, formar plugue de gel.

A Figura 2A é o fluxograma para indicar vasos com dextrano marcado fluorescente. O dextran fluorescente marcado foi inje.......

Discussão

Apresentamos um método confiável e conveniente para a avaliação quantitativa da angiogênese in vivo sem coloração. Nesse protocolo, as células vasculares foram misturadas com gel de matriz na presença de reagentes pró-angiogênicos ou antiangiogênicos e, em seguida, injetadas por via subcutânea no dorso de camundongos Nu/Nu para formar plugue de gel (Figura 1). Após 7 dias da formação do plugue de gel, o dextran-FITC foi injetado por via intravenosa e circulado por 30 min. O plugue d.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Lâminas de microscópio de adesão	CITOTEST	188105
Sistema de anestesia	RWD	R640-S1
Contador de células	Invitrogen	AMQAX1000
Placa de cultura de células	Corning	430167
Cryoslicer	Thermo Fisher	CryoStar NX50
Dextrans-FITC-150kDa	WEIHUA BIO
Dextrans-FITC-4kDa	WEIHUA BIO	WH007N0705
de Incorporação	CITOTEST	80203-0007
Meio de Células Endoteliais	ScienCell	35809
Suplementos de Crescimento Endotelial	ScienCell	1025
Soro Bovino Fetal	Gibco	10100147C
Fibroblasto Fator de Crescimento 1	Microscópio de Fluorescência AtaGenix	9043p-082318-A01	FGF1
	Almofada	ECLIPSE Ni
Seringa de Insulina
Isoflurano	RWD	R510-22-10
Balance	Sartorius	BSA124S-CW
Matrigel	Corning	356234	Matrix gel
Médio 199 pó	Gibco	31100-035
Microtubos	Axygen	MCT-150-C
Temperatura de Corte Ótima (OCT) Composto	SUKURA	4583	Gel de inclusão de tecido
Palmitato Ácido	KunChuang	KC001
Penicilina-estreptomicina Líquido	Solarbio	P1400
Tampão de fosfato Salino	Solarbio	P1022
Instrumentos cirúrgicos	RWD	RWD
Instrumento de injeção de veia caudal	KEW BASIS	KW-XXY
Solução de tripsina-EDTA	Solarbio	T1320
Temperatura ultrabaixa Freezer	eppendorf	U410
Fator de Crescimento Endotelial Vascular	CHAMOT	CM058-5HP	VEGF

WH007N07 de Aquecimento Nikon Boruida 30-50-30 BD 300841 Laboratório