Artigo de método

Formação Óssea Integrada Através da Ossificação Endocondral In Vivo Usando Células-Tronco Mesenquimais

DOI:

10.3791/65573

⸱

14 de julho de 2023

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Craniofacial Embryology, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University, 2Department of Maxillofacial Surgery, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University, 3Department of Regenerative and Reconstructive Dental Medicine, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A terapia óssea via ossificação endocondral através da implantação de tecido cartilaginoso artificial produzido a partir de células-tronco mesenquimais tem o potencial de contornar os inconvenientes das terapias convencionais. Os hidrogéis de ácido hialurônico são eficazes na ampliação de enxertos de cartilagem uniformemente diferenciados, bem como na criação de osso integrado com vascularização entre enxertos fundidos in vivo.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A terapia convencional de regeneração óssea utilizando células-tronco mesenquimais (CTMs) é de difícil aplicação em defeitos ósseos maiores que o tamanho crítico por não possuir um mecanismo para induzir angiogênese. A implantação de tecido cartilaginoso artificial fabricado a partir de CTMs induz angiogênese e formação óssea in vivo via ossificação endocondral (ECO). Portanto, esta abordagem mediada pela ECO pode ser uma terapia promissora de regeneração óssea no futuro. Um aspecto importante da aplicação clínica desta abordagem mediada pela ECO é o estabelecimento de um protocolo para preparar cartilagem suficiente para ser implantada para reparar o defeito ósseo. Especialmente não é prático projetar uma única massa de cartilagem enxertada de um tamanho que esteja de acordo com a forma do defeito ósseo real. Portanto, a cartilagem a ser transplantada deve ter a propriedade de formar osso integralmente quando múltiplos pedaços são implantados. Os hidrogéis podem ser uma ferramenta atraente para a ampliação de enxertos projetados para ossificação endocondral para atender às necessidades clínicas. Embora muitos hidrogéis naturalmente derivados suportem a formação de cartilagem MSC in vitro e ECO in vivo, o material de arcabouço ideal para atender às necessidades de aplicações clínicas ainda não foi determinado. O ácido hialurônico (AH) é um componente crucial da matriz extracelular cartilaginosa e é um polissacarídeo biodegradável e biocompatível. Aqui, mostramos que os hidrogéis de AH têm excelentes propriedades para apoiar a diferenciação in vitro do tecido cartilaginoso à base de CTM e promover a formação óssea endocondral in vivo.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O osso autólogo ainda é o padrão-ouro para reparação de defeitos ósseos decorrentes de trauma, defeitos congênitos e ressecção cirúrgica. No entanto, o enxerto ósseo autógeno tem limitações significativas, incluindo dor do doador, risco de infecção e volume ósseo limitado que pode ser isolado dos pacientes 1,2,3,4. Inúmeros biomateriais têm sido desenvolvidos como substitutos ósseos, combinando polímeros naturais ou sintéticos com materiais mineralizados, como fosfato de cálcio ou hidroxiapatita 5,6. A formação óssea nesses materiais de engenharia é geralmente obtida usando o material mineralizado como material de priming para permitir que as células-tronco se diferenciem diretamente em osteoblastos através do processo de ossificação intramembrana (IMO)7. Esse processo carece do passo angiogênico, resultando em vascularização insuficiente in vivo do enxerto após o implante8,9,10 e, portanto, abordagens utilizando esse processo podem não ser ideais para o tratamento de grandes defeitos ósseos11.

Estratégias aplicadas para recapitular o processo de ossificação endocondral (ECO), um mecanismo inato na esquelética durante o desenvolvimento, têm demonstrado superar problemas significativos associados às abordagens tradicionais baseadas na IMO. Na ECO, os condrócitos do molde cartilaginoso liberam fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), que promove infiltração vascular e remodelamento do molde cartilaginoso emosso12. A abordagem ECO-mediada para osteogênese via remodelamento cartilaginoso e angiogênese, que também é ativada durante o reparo de fraturas, usa tecido cartilaginoso criado artificialmente derivado de CTMs como material de priming. Os condrócitos podem tolerar hipóxia em defeitos ósseos, induzir angiogênese e converter um enxerto de cartilagem livre de vasculares em tecido angiogênico. Numerosos estudos têm relatado que enxertos de cartilagem à base de CTM geram osso in vivo com a implementação de tal programa ECO13,14,15,16,17,18,19,20,21.

Um requisito essencial para a aplicação clínica desta abordagem mediada pela ECO é como preparar a quantidade desejada de enxerto de cartilagem em um ambiente clínico. Preparar cartilagem clínica de um tamanho que se adapte ao defeito ósseo real não é prático. Portanto, a cartilagem do enxerto deve formar osso integralmente quando múltiplos fragmentos são implantados22. Os hidrogéis podem ser uma ferramenta atraente para a ampliação de enxertos manipulados por tecidos para ossificação endocondral. Muitos hidrogéis de origem natural suportam a formação de cartilagem MSC in vitro e ECO in vivo 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32; no entanto, o material de suporte ideal para atender aos requisitos de aplicação clínica permaneceu indeterminado. O ácido hialurônico (AH) é um polissacarídeo biodegradável e biocompatível presente na matriz extracelular da cartilagem33. O AH interage com as CTMs via receptores de superfície, como o CD44, para auxiliar a diferenciação condrogênica 25,26,28,30,31,32,34. Além disso, os scaffolds de AH promovem diferenciação osteogênica mediada pela IMO de células-tronco da polpa dentária humana35, e scaffolds combinados com colágeno promovem osteogênese mediada por ECO36,37.

Aqui, apresentamos um método para o preparo de hidrogéis de AH utilizando CTMs humanas adultas derivadas da medula óssea e seu uso para condrogênese hipertrófica in vitro e posterior ossificação endocondral in vivo38. Comparamos as características do AH com as do colágeno, um material amplamente aplicado na engenharia do tecido ósseo com CTMs e um material útil para a ampliação de enxertos artificiais para ossificação endocondral17. Em um modelo de camundongo imunocomprometido, construções de AH e colágeno semeadas com CTMs humanas foram avaliadas quanto ao potencial ECO in vivo por implante subcutâneo. Os resultados mostram que os hidrogéis de AH são excelentes como arcabouço para CTMs criarem enxertos de cartilagem artificial que permitem a formação óssea através de ECO.

O protocolo é dividido em duas etapas. Primeiro, construções de CTMs humanas semeadas com hidrogel de hialuronano são preparadas e diferenciadas em cartilagem hipertrófica in vitro. Em seguida, os construtos diferenciados são implantados subcutaneamente em um modelo nude para induzir a ossificação endocondral in vivo (Figura 1).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo usa camundongos machos nus de 4 semanas de idade. Aloja quatro ratos em uma gaiola sob um ciclo claro/escuro de 12 h a 22−24 °C e 50%−70% de umidade relativa. Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes aprovadas pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Médica e Odontológica de Tóquio (ID de aprovação: A2019-204C, A2020-116A e A2021-121A).

1. Preparação de tampões e reagentes

  1. Preparar o meio de crescimento de células-tronco mesenquimais (meio de crescimento MSC) adicionando o kit de suplemento de meio de crescimento MSC ao meio basal MSC e armazená-lo a 4 °C.
  2. Preparar o meio Dulbecco's Modified Eagle Medium and Ham's F12 (DMEM/F-12) adicionando 10% de soro fetal bovino (FBS), 50 μg/mL de gentamicina, 200 μM L-alanil-L-glutamina e 1 ng/mL de fator de crescimento fibroblástico básico ao meio e armazená-lo a 4 °C.
  3. Preparar o meio condrogênico adicionando 1% de suplemento de ITS-G, 0,12% de albumina de soro bovino, 50 μg/mL de gentamicina, 0,35 mM L-prolina, 100 nM de dexametasona e 10 ng/mL de TGF-β3 ao DMEM imediatamente antes do uso.
  4. Preparar o meio hipertrófico adicionando 10 mM de β-glicerofosfato, 0,12% de albumina de soro bovino, 10 nM de dexametasona, 200 μM de ascorbato-2-fosfato, 50 nM de L-tiroxina, 50 μg/mL de gentamicina e 50 pg/mL de IL-1β ao DMEM imediatamente antes do uso.
  5. Revestir uma placa de cultura de 24 poços com 200 μL de parafina derretida pré-aquecida a 60 °C. Deixe repousar à temperatura ambiente até que a parafina esteja ajustada.

2. Expansão das CTMs humanas

NOTA: Antes de iniciar os experimentos, CTMs com alto potencial para condrogênese de CTM devem ser selecionadas em microcultura de massa, conforme descrito em17.

  1. De acordo com as instruções do fabricante, cultivar CTMs primárias derivadas da medula óssea humana (passagem 2) com meio de crescimento CTM em uma placa de 10 cm a uma densidade de 5 x 103 células/cm 2 a 37 °C em incubadora de ar umidificada a 5% CO2 e 95%.
  2. Troque o meio a cada 2-3 dias. Quando as células atingirem 80%-90% de confluência, aspirar o meio da placa de cultura celular usando uma bomba de vácuo, lavar com 5 mL de PBS e, em seguida, aspirar a solução com uma bomba de vácuo.
  3. Adicionar 1 mL de solução de tripsina a 0,05%/EDTA a 0,02% ao prato. Incubar o prato durante 5-10 min a 37 °C.
  4. Adicionar 1 mL de meio de cultura MSC para interromper a reação enzimática. Transfira a suspensão celular para um tubo de 50 mL.
  5. Combine a suspensão celular de outras placas no tubo de 50 mL e mantenha-a no gelo.
  6. Use o contador de células para contar as células misturando 10 μL da suspensão celular com 10 μL de coloração azul de tripano a 0,4%.
  7. Centrifugar a suspensão celular restante a 220 x g durante 3 minutos à temperatura ambiente. Retirar o sobrenadante e adicionar solução de criopreservação na concentração de 1,0 x 106 células por mL.
  8. Distribuir 1 ml da suspensão celular em cada criotubo e conservar a -80 °C durante 12 h antes de transferir para azoto líquido. As existências congeladas resultantes (passagem 3) são utilizadas para este protocolo.
  9. Para os experimentos, semear as CTMs estocadas em uma placa de 10 cm a uma densidade de 5 x 103 células/cm2. Cultivo de células até 80%-90% confluentes (passagem 4) em meio DMEM/F-12.

3. Preparação de hidrogéis encapsulados em MSC

  1. Tripsinizar as células e preparar a suspensão celular conforme descrito nos passos 2.3 - 2.6.
  2. Para fazer 10 construções (2,5 x 105 células por construto), aliquota a suspensão celular contendo 2,5 x 106 células em um microtubo de 1,5 mL.
  3. Centrifugar a suspensão a 220 x g por 3 min, remover o sobrenadante com uma bomba de vácuo e mantê-lo no gelo.
  4. Levar o ácido hialurônico modificado por tiol (AH), reticulante reativo a tiol, diacrilato de polietilenoglicol e garrafas de água desgaseificada à temperatura ambiente.
  5. Em condições estéreis, adicione 1,0 ml de água desgaseificada ao frasco contendo AH (ver instruções do fabricante) utilizando uma seringa com uma agulha.
  6. Vórtice ocasionalmente aquecendo a 37 °C até que a solução fique clara, em seguida, coloque no gelo. Leva menos de 30 minutos para que os sólidos se dissolvam completamente.
  7. Em condições estéreis, adicionar 0,5 mL de água desgaseificada ao frasco reticulante usando uma seringa com uma agulha. Dissolva invertendo várias vezes e coloque no gelo.
  8. Adicionar 120 μL da solução de AH dissolvido à pastilha de células alíquotas (2,5 x 106 células). Ressuspenda o pellet celular pipetando para frente e para trás.
  9. Adicionar 30 μL da solução de reticulante dissolvido ao tubo que contém o AH e as células (passo 3.8) e combinar batendo no tubo e, em seguida, girar brevemente para baixo. Combinar a solução de AH e a solução de reticulador numa proporção de 4:1.
  10. Lançar 15 μL da solução combinada contendo CTMs (2,5 x 105 células) sobre a placa de 24 poços revestida com parafina e deixá-la solidificar a 37 °C por 30 min (Figura 2). Devido à alta viscosidade, prepare pelo menos 10% a mais da mistura célula/hidrogel do que o necessário.
    NOTA: As características do hidrogel foram descritas anteriormente39.

4. Condições de diferenciação in vitro

  1. Adicionar 0,5 mL de meio de diferenciação condrogênica a uma construção de hidrogéis de AH com sementes de CTM. Troque o meio a cada 2-3 dias.
  2. Após 3 semanas, mudar para meio de diferenciação hipertrófica (0,5 mL por poço) e cultivar os construtos por mais 2 semanas.

5. Implantação in vivo de CTMs

  1. Após um total de 5 semanas de cultura in vitro, implantar-se os construtos por via subcutânea no dorso de camundongos nus, conforme descrito anteriormente38,40.
  2. Pesar camundongos e administrar um anestésico combinado preparado com 0,75 mg/kg de peso corporal (p.c.) medetomidina, 4,0 mg/kg de p.c. midazolam e 5,0 mg/kg de p.c. butorfanol por injeção intraperitoneal, conforme descrito38.
  3. Confirmar anestesia adequada por imobilidade aos estímulos cirúrgicos e monitorar a profundidade respiratória por movimentos torácicos lentos e regulares e suprimento adequado de oxigênio pela cor da mucosa rósea periodicamente durante a operação. Use pomada veterinária nos olhos para evitar o ressecamento durante a anestesia.
  4. Colocar o camundongo em um pano cirúrgico estéril em decúbito ventral, esterilizar o local da incisão com 50 ppm de água ácido hipoclorosa (pH 5,0; HAW), e coloque um pano cirúrgico perfurado sobre o rato.
    OBS: Esterilizar todos os materiais cirúrgicos em autoclave, gás óxido de etileno ou HAW. Os cirurgiões devem lavar os dedos e usar aventais e luvas cirúrgicas.
  5. Faça duas incisões de pele de 5 mm de comprimento com 2 cm de distância nas áreas do ombro e quadril ao longo da linha central da coluna usando uma tesoura.
  6. Insira uma espátula subcutânea através da incisão para criar uma bolsa subcutânea.
  7. Insira duas a três construções (~15 μL cada, passo 5.1) em cada bolso com pinças. Construções de AH implantadas na mesma loja são propensas à fusão com muita frequência. Para evitar a fusão, insira uma construção de AH em cada bolsa.
  8. Fechar as incisões com pontos de seda trançados 4-0. Injetar no camundongo um antagonista dos anestésicos preparados com atipamezol 0,75 mg/kg de p.c., conforme descrito38.
  9. Enquanto os camundongos se recuperam da anestesia, coloque os camundongos em gaiolas de recuperação estéreis contendo roupas de cama de chão estéreis sem garrafas de comida e água e monitore continuamente a temperatura corporal, o pulso e a respiração.
  10. Não deixe os ratos sozinhos até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Após a recuperação total, retorne os animais ao criadouro com os demais animais.
  11. Monitorar os animais a cada dois dias durante o período de cicatrização para quaisquer possíveis complicações. Eutanasiar os camundongos por inalação de dióxido de carbono com pouco sofrimento nas 4 e 8 semanas pós-implantação.
  12. Incisar a pele nos locais enxertados e remover as construções implantadas com pinças. Fixar os construtos em paraformaldeído a 4% por 16 h e submetê-los à análise.

6. Análise estatística

  1. Relate dados quantitativos como média ± desvio padrão (DP). Realizar análise estatística utilizando software comercial.
  2. Use o teste t de Student ou ANOVA one-way seguido do teste de comparações múltiplas de Tukey para determinar diferenças significativas entre os grupos. p<0,05 e p<0,01 indicam diferenças significativas entre os dois grupos.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hidrogéis de AH encapsulados em CTM foram cultivados em meio condrogênico suplementado com TGFβ3, um indutor da condrogênese41 (passo 4.1). Comparamos as propriedades do AH com as do colágeno, que tem se mostrado eficaz na criação de enxertos de cartilagem artificial à base de CTM para ossificação endocondral, como descrito anteriormente38. As CTMs indiferenciadas não foram incluídas como controles negativos neste estudo, pois foi demonstrado que as CTMs indiferenciadas nec...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O uso de materiais apropriados que promovam a transição da cartilagem hipertrófica para o osso é uma abordagem promissora para ampliar enxertos de cartilagem hipertrófica projetados baseados em CTM e tratar defeitos ósseos de tamanho clinicamente significativo. Aqui, mostramos que o AH é um excelente material de arcabouço para auxiliar na diferenciação do tecido cartilaginoso hipertrófico baseado em CTM in vitro e promover a formação óssea endocondral in vivo38. Além disso, i...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declararam que não existem interesses concorrentes.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado por um Grant-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) da Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (grant nos. JP19K10259 e 22K10032 ao MAI).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0.25w/v% Tripsina-1mmol/L EDTA.4Na SoluçãoFUJIFILM Wako Pure Chemical 209-16941
AntisedanNippon Zenyaku Kogyo
albumina de soro bovinoFUJIFILM Wako Pure Chemical 012-238817.5 w/v%
Contador de células automatizado Countess com lâminas de câmara de contagem de células e coloração azul de tripano 0.4%InvitrogenC10283
dexametasonaMerckD8893
DomitorNippon Zenyaku Kogyo
DormicumAstellas Pharma
Dulbecco's Modified Eagle MediumMerckD6429alta glicose
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 HamMerckD6421
Fetal bovineserum HycloneSH30396.03
Gentamicin sulfateFUJIFILM Wako Pure Chemical 1676045  10 mg/mL
Haccpper GeneratorTechnoMaxCH-400-5QB50 ppm de água com ácido hipocloroso
Células-tronco mesenquimais humanasLonzaPT-2501
HyStem Cell Culture Scaffold KitMerckHYS020
IL-1ßSuplemento PeproTechAF-200-01B
ITS-GFUJIFILM Wako Pure Chemical 090-06741× 100
L-Alanyl-L-GlutaminaFUJIFILM Wako Pure Chemical 016-21841200mmol/L (× 100)
L-prolinaNacalai Tesque29001-42
L-TiroxinaMerckT1775
MSCGM Meio de Crescimento de Células-Tronco Mesenquimais
BulletKit		LonzaPT-3001
parafinaFUJIFILM Wako Pure Chemical 165-13375
PBS / pH7.4 100mlMedicago09-2051-100
TGF-β 3 Pomada ProteintechHZ-1090
VetorphaleMeiji Seika Kaisha
VisiocareSAVAVET/SAVA Healthcare
β-glicerofosfatoFUJIFILM Wako Pure Chemical Telefone: 048-34332
ascorbato-2-fosfato Nacalai Tesque 13571-14 Bambanker GC Lymphotec CS-02-001 fator de crescimento fibroblástico básico Reprocell RCHEOT002 

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goldberg, V. M., Stevenson, S. Natural history of autografts and allografts. Clinical Orthopaedics and Related Research. (225), 7-16 (1987).
  2. Amini, A. R., Laurencin, C. T., Nukavarapu, S. P. Bone tissue engineering: recent advances and challenges. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 40 (5), 363-408 (2012).
  3. Vining, N. C., Warme, W. J., Mosca, V. S. Comparison of structural bone autografts and allografts in pediatric foot surgery. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 32 (7), 719-723 (2012).
  4. Roddy, E., DeBaun, M. R., Daoud-Gray, A., Yang, Y. P., Gardner, M. J. Treatment of critical-sized bone defects: clinical and tissue engineering perspectives. European Journal of Orthopaedic Surgery and Traumatology. 28 (3), 351-362 (2018).
  5. Rezwan, K., Chen, Q. Z., Blaker, J. J., Boccaccini, A. R. Biodegradable and bioactive porous polymer/inorganic composite scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 27 (18), 3413-3431 (2006).
  6. Swetha, M., et al. Biocomposites containing natural polymers and hydroxyapatite for bone tissue engineering. International Journal of Biological Macromolecules. 47 (1), 1-4 (2010).
  7. Meijer, G. J., de Bruijn, J. D., Koole, R., van Blitterswijk, C. A. Cell-based bone tissue engineering. PLOS Medicine. 4 (2), e9(2007).
  8. Tremblay, P. L., Hudon, V., Berthod, F., Germain, L., Auger, F. A. Inosculation of tissue-engineered capillaries with the host's vasculature in a reconstructed skin transplanted on mice. American Journal of Transplantation. 5 (5), 1002-1010 (2005).
  9. Ko, H. C., Milthorpe, B. K., McFarland, C. D. Engineering thick tissues--the vascularisation problem. European Cells and Materials. 14, 1-19 (2007).
  10. Santos, M. I., Reis, R. L. Vascularization in bone tissue engineering: physiology, current strategies, major hurdles and future challenges. Macromolecular Bioscience. 10 (1), 12-27 (2010).
  11. Almubarak, S., et al. Tissue engineering strategies for promoting vascularized bone regeneration. Bone. 83, 197-209 (2016).
  12. Kronenberg, H. M. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423 (6937), 332-336 (2003).
  13. Farrell, E., et al. Chondrogenic priming of human bone marrow stromal cells: a better route to bone repair. Tissue Engineering Part C: Methods. 15 (2), 285-295 (2009).
  14. Scotti, C., et al. Recapitulation of endochondral bone formation using human adult mesenchymal stem cells as a paradigm for developmental engineering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (16), 7251-7256 (2010).
  15. Janicki, P., Kasten, P., Kleinschmidt, K., Luginbuehl, R., Richter, W. Chondrogenic pre-induction of human mesenchymal stem cells on beta-TCP: enhanced bone quality by endochondral heterotopic bone formation. Acta Biomaterialia. 6 (8), 3292-3301 (2010).
  16. Farrell, E., et al. In-vivo generation of bone via endochondral ossification by in-vitro chondrogenic priming of adult human and rat mesenchymal stem cells. BMC Musculoskeletal Disorders. 12, 31(2011).
  17. Scotti, C., et al. Engineering of a functional bone organ through endochondral ossification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (10), 3997-4002 (2013).
  18. Harada, N., et al. Bone regeneration in a massive rat femur defect through endochondral ossification achieved with chondrogenically differentiated MSCs in a degradable scaffold. Biomaterials. 35 (27), 7800-7810 (2014).
  19. van der Stok, J., et al. Chondrogenically differentiated mesenchymal stromal cell pellets stimulate endochondral bone regeneration in critical-sized bone defects. European Cells and Materials. 27, 137-148 (2014).
  20. Sheehy, E. J., Vinardell, T., Toner, M. E., Buckley, C. T., Kelly, D. J. Altering the architecture of tissue engineered hypertrophic cartilaginous grafts facilitates vascularisation and accelerates mineralisation. PLoS One. 9 (3), e90716(2014).
  21. Sheehy, E. J., Mesallati, T., Vinardell, T., Kelly, D. J. Engineering cartilage or endochondral bone: a comparison of different naturally derived hydrogels. Acta Biomaterialia. 13, 245-253 (2015).
  22. Bahney, C. S., et al. Stem cell-derived endochondral cartilage stimulates bone healing by tissue transformation. Journal of Bone and Mineral Research. 29 (5), 1269-1282 (2014).
  23. Mauck, R. L., Yuan, X., Tuan, R. S. Chondrogenic differentiation and functional maturation of bovine mesenchymal stem cells in long-term agarose culture. Osteoarthritis Cartilage. 14 (2), 179-189 (2006).
  24. Dickhut, A., Gottwald, E., Steck, E., Heisel, C., Richter, W. Chondrogenesis of mesenchymal stem cells in gel-like biomaterials in vitro and in vivo. Frontiers in Bioscience. 13, 4517-4528 (2008).
  25. Chung, C., Burdick, J. A. Influence of three-dimensional hyaluronic acid microenvironments on mesenchymal stem cell chondrogenesis. Tissue Engineering Part A. 15 (2), 243-254 (2009).
  26. Erickson, I. E., et al. Macromer density influences mesenchymal stem cell chondrogenesis and maturation in photocrosslinked hyaluronic acid hydrogels. Osteoarthritis Cartilage. 17 (12), 1639-1648 (2009).
  27. Sheehy, E. J., Buckley, C. T., Kelly, D. J. Chondrocytes and bone marrow-derived mesenchymal stem cells undergoing chondrogenesis in agarose hydrogels of solid and channelled architectures respond differentially to dynamic culture conditions. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 5 (9), 747-758 (2011).
  28. Erickson, I. E., et al. High mesenchymal stem cell seeding densities in hyaluronic acid hydrogels produce engineered cartilage with native tissue properties. Acta Biomaterialia. 8 (8), 3027-3034 (2012).
  29. Ma, K., Titan, A. L., Stafford, M., Zheng, C., Levenston, M. E. Variations in chondrogenesis of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in fibrin/alginate blended hydrogels. Acta Biomaterialia. 8 (10), 3754-3764 (2012).
  30. Levett, P. A., et al. A biomimetic extracellular matrix for cartilage tissue engineering centered on photocurable gelatin, hyaluronic acid and chondroitin sulfate. Acta Biomaterialia. 10 (1), 214-223 (2014).
  31. Reppel, L., et al. Chondrogenic induction of mesenchymal stromal/stem cells from Wharton's jelly embedded in alginate hydrogel and without added growth factor: an alternative stem cell source for cartilage tissue engineering. Stem Cell Research & Therapy. 6, 260(2015).
  32. Amann, E., Wolff, P., Breel, E., van Griensven, M., Balmayor, E. R. Hyaluronic acid facilitates chondrogenesis and matrix deposition of human adipose derived mesenchymal stem cells and human chondrocytes co-cultures. Acta Biomaterialia. 52, 130-144 (2017).
  33. Hemshekhar, M., et al. Emerging roles of hyaluronic acid bioscaffolds in tissue engineering and regenerative medicine. International Journal of Biological Macromolecules. 86, 917-928 (2016).
  34. Pfeifer, C. G., et al. Higher Ratios of Hyaluronic Acid Enhance Chondrogenic Differentiation of Human MSCs in a Hyaluronic Acid-Gelatin Composite Scaffold. Materials (Basel). 9 (5), (2016).
  35. La Noce, M., et al. Hyaluronan-Based Gel Promotes Human Dental Pulp Stem Cells Bone Differentiation by Activating YAP/TAZ Pathway. Cells. 10 (11), (2021).
  36. Thompson, E. M., Matsiko, A., Kelly, D. J., Gleeson, J. P., O'Brien, F. J. An Endochondral Ossification-Based Approach to Bone Repair: Chondrogenically Primed Mesenchymal Stem Cell-Laden Scaffolds Support Greater Repair of Critical-Sized Cranial Defects Than Osteogenically Stimulated Constructs In Vivo. Tissue Engineering Part A. 22 (5-6), 556-567 (2016).
  37. Wang, H., et al. Cell-mediated injectable blend hydrogel-BCP ceramic scaffold for in situ condylar osteochondral repair. Acta Biomaterialia. 123, 364-378 (2021).
  38. Yamazaki, S., et al. Hyaluronic acid hydrogels support to generate integrated bone formation through endochondral ossification in vivo using mesenchymal stem cells. PLoS One. 18 (2), e0281345(2023).
  39. Zarembinski, T., Skardal, A. Hydrogels - Smart Materials for Biomedical Applications. , (2019).
  40. Vinardell, T., Sheehy, E. J., Buckley, C. T., Kelly, D. J. A comparison of the functionality and in vivo phenotypic stability of cartilaginous tissues engineered from different stem cell sources. Tissue Engineering Part A. 18 (11-12), 1161-1170 (2012).
  41. Mueller, M. B., et al. Hypertrophy in mesenchymal stem cell chondrogenesis: effect of TGF-beta isoforms and chondrogenic conditioning. Cells Tissues Organs. 192 (3), 158-166 (2010).
  42. Lertkiatmongkol, P., Liao, D., Mei, H., Hu, Y., Newman, P. J. Endothelial functions of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31). Current Opinion in Hematology. 23 (3), 253-259 (2016).
  43. Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. Photodegradable hydrogels for dynamic tuning of physical and chemical properties. Science. 324 (5923), 59-63 (2009).
  44. Chan, C. K., et al. Endochondral ossification is required for haematopoietic stem-cell niche formation. Nature. 457 (7228), 490-494 (2009).
  45. Murdoch, A. D., et al. Chondrogenic differentiation of human bone marrow stem cells in transwell cultures: generation of scaffold-free cartilage. Stem Cells. 25 (11), 2786-2796 (2007).
  46. Tortelli, F., Tasso, R., Loiacono, F., Cancedda, R. The development of tissue-engineered bone of different origin through endochondral and intramembranous ossification following the implantation of mesenchymal stem cells and osteoblasts in a murine model. Biomaterials. 31 (2), 242-249 (2010).
  47. Knuth, C. A., Witte-Bouma, J., Ridwan, Y., Wolvius, E. B., Farrell, E. Mesenchymal stem cell-mediated endochondral ossification utilising micropellets and brief chondrogenic priming. European Cells and Materials. 34, 142-161 (2017).
  48. Simmons, C. A., Alsberg, E., Hsiong, S., Kim, W. J., Mooney, D. J. Dual growth factor delivery and controlled scaffold degradation enhance in vivo bone formation by transplanted bone marrow stromal cells. Bone. 35 (2), 562-569 (2004).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Bone RegenerationArtificial CartilageHyaluronic Acid HydrogelsCartilage DifferentiationIn Vivo Bone FormationChondrogenic DifferentiationScaffold MaterialsAngiogenesis Induction

Artigos relacionados