Isolamento e Purificação de Vesículas Extracelulares Bacterianas de Fezes Humanas Utilizando Centrifugação por Gradiente de Densidade

Summary

Este estudo descreve um método para isolar e purificar vesículas extracelulares bacterianas (BEVs) enriquecidas de fezes humanas via centrifugação por gradiente de densidade (DGC), identifica as características físicas dos BEVs a partir da morfologia, tamanho de partícula e concentração, e discute as potenciais aplicações da abordagem DGC em pesquisa clínica e científica.

Abstract

As vesículas extracelulares bacterianas (BEVs) são nanovesículas derivadas de bactérias que desempenham um papel ativo na comunicação bactéria-bactéria e bactéria-hospedeiro, transferindo moléculas bioativas como proteínas, lipídios e ácidos nucléicos herdados das bactérias mãe. Os BEVs derivados da microbiota intestinal têm efeitos dentro do trato gastrointestinal e podem atingir órgãos distantes, resultando em implicações significativas para a fisiologia e patologia. Investigações teóricas que explorem os tipos, quantidades e papéis de BEVs derivados de fezes humanas são cruciais para entender a secreção e a função de BEVs da microbiota intestinal. Essas investigações também requerem um aprimoramento na estratégia atual de isolamento e purificação de BEVs.

Este estudo otimizou o processo de isolamento e purificação de BEVs estabelecendo dois modos de centrifugação por gradiente de densidade (DGC): Top-down e Bottom-up. A distribuição enriquecida dos BEVs foi determinada nas frações 6 a 8 (F6-F8). A eficácia da abordagem foi avaliada com base na morfologia das partículas, tamanho, concentração e teor de proteínas. As taxas de recuperação de partículas e proteínas foram calculadas, e a presença de marcadores específicos foi analisada para comparar a recuperação e pureza dos dois modos de DGC. Os resultados indicaram que o modo de centrifugação Top-down apresentou menores níveis de contaminação e alcançou uma taxa de recuperação e pureza semelhante à do modo Bottom-up. Um tempo de centrifugação de 7 h foi suficiente para atingir uma concentração de BEV fecal de 10⁸/mg.

Além das fezes, este método pode ser aplicado a outros tipos de fluidos corporais com modificação adequada de acordo com as diferenças de componentes e viscosidade. Em conclusão, este protocolo detalhado e confiável facilitaria o isolamento e purificação padronizados de BEVs e, assim, estabeleceria uma base para análises multi-ômicas subsequentes e experimentos funcionais.

Introduction

O intestino é amplamente reconhecido como o órgão que abriga as comunidades microbianas mais abundantes no corpo humano, com mais de 90% das bactérias envolvidas na colonização e multiplicação ^1,2. Extensas evidências têm demonstrado que a microbiota intestinal modula o microambiente intestinal e, simultaneamente, interage com disfunção em órgãos distantes, principalmente através de uma barreira intestinal prejudicada ^3,4. Evidências crescentes indicam uma correlação entre o desequilíbrio da microbiota intestinal e a progressão da doença inflamatória i....

Protocol

O Comitê de Ética do Hospital Nanfang, Southern Medical University, sancionou este estudo, que foi conduzido com o consentimento informado dos participantes. Todos os métodos aqui empregados seguiram as diretrizes operacionais padrão fornecidas pelas Normas Internacionais de Microbioma Humano (IHMS: http://www.microbiome-standards.org/). Todos os procedimentos subsequentes de manuseio de líquidos foram obrigados a serem realizados dentro de um gabinete de biossegurança ou uma bancada ultralimpa.

1. Coleta e aliquotação de amostras fecais

1. Distribua um amostrador de fezes, um saco selado e uma caixa gelada e forneça....

Results

Determinar a distribuição das frações enriquecidas com BEV
Para determinar a distribuição das frações enriquecidas com vesículas extracelulares bacterianas (BEVs), um controle em branco foi estabelecido para medir os valores de absorbância em OD 340 nm, e a densidade de cada fração foi calculada com base nas medidas e diretrizes de iodixanol (Passo 8.1). A Tabela 2 apresenta os resultados de densidade, demonstrando que as frações F4 a F9 exibiram densidades dentro da faixa tipicamente.......

Discussion

As vesículas extracelulares bacterianas (VEB) são nanopartículas de bicamada lipídica secretadas por bactérias, carregando uma riqueza de proteínas, lipídios, ácidos nucléicos e outras moléculas bioativas, contribuindo para mediar os efeitos funcionais das bactérias²⁰. Verificou-se que os BEVs derivados do intestino estão envolvidos no desenvolvimento de doenças, como doença inflamatória intestinal, doença de Crohn e câncer colorretal, além de afetar o metabolismo geral e mediar comprometimento da.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 % (m/v) de glutaraldeído (preparado a partir de solução de reserva a 2,5 % em água deionizada)	ACMEC	AP1126	Observação morfológica para BEVs usando MET na Etapa 8.3.3
1 % (p/v) de metilcelulose (preparada a partir do pó original em água deionizada)	Sigma-Aldrich	M7027	Observação morfológica para BEVs usando MET na Etapa 8.3.6
1,5 % (p/v) de acetato de uranilo (preparado a partir do pó original em água deionizada)	Polysciences	21447-25	Observação morfológica para BEVs usando TEM na Etapa 8.3.5
1000 μ L, 200 μ L, 10 μ L Pipeta	KIRGEN	KG1313, KG1212, KG1011	Transfira a solução
5% (p/v) de solução de albumina de soro bovino (preparada a partir do pó original em tampão TBST)	Fdbio science	FD0030	Usado em western blotting para bloqueio na Etapa 8.5.6
5 × carregando buffer	Fdbio science	FD006	Usado em western blotting e coloração azul brilhante de Coomassie na Etapa 8.5.1
Álcool 75% (v/v)	LIRCON	LIRCON-500 mL	Desinfecção
de superfície Placa de 96 poços	Rar	A8096	Meça os valores de absorbância
Anticorpo anti-Calnexina	Abcam	ab92573	Western blotting (Anticorpo Primário)
Anticorpo Anti-CD63	Abcam	ab134045	Western blotting (Anticorpo Primário)
Anticorpo Anti-CD9	Abcam	ab236630	Western blotting (Anticorpo Primário)
Anticorpo Anti-Flagelina	Sino Biológico	40067-MM06	Western blotting (Anticorpo Primário)
Anticorpo anti-integrina beta 1	Abcam	ab30394	Western blotting (Anticorpo primário)
Anticorpo anti-LPS	Thermo Fisher	MA1-83152	Western blotting (Anticorpo primário)
Anticorpo anti-LTA	Thermo Fisher	MA1-7402	Western blotting (Anticorpo Primário)
Anticorpo Anti-OmpA	CUSABIO	CSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/	Western blotting (Anticorpo Primário)
Anticorpo Anti-Syntenin	Abcam	ab133267	Western blotting (Anticorpo Primário)
Anticorpo Anti-TSG101	Abcam	ab125011	Western blotting (Anticorpo Primário)
Autoclave	ZEALWAY	GR110DP	Esterilização para suprimentos e meios usados no experimento
Balance	Mettler Toledo	AL104	Balance a amostra do tubo carregada com PBS
Ensaio de ácido bicinconônico	Fdbio science	FD2001	Meça o teor de proteína dos BEVs na Etapa 8.2
BioRender		BioRender https://app.biorender.com	Faça o fluxo de trabalho esquemático de isolamento e purificação de BEVs mostrado na Figura 1 Gabinete de
biossegurança	Haier	HR1200- II B2	Execute os procedimentos sobre o manuseio de amostras de fezes
Centrífuga 5810 R; Rotor F-34-6-38	Eppendorf	5805000092; 5804727002, adaptador: 5804774000	Pré-processamento para BEVs (Passo 3)
Aparelho de Quimioluminescência	BIO-OI	OI600SE-MF	Usado em western blotting para detecção de sinal no Passo 8.5.12
Citação 5	BioTek	F01	Detector de microplacas para medir os valores de absorbância (Passo 8.1) e fluorescência (Figura 6)
Lipoproteína de baixa densidade com AC12038 Dil-labled	ACMEC		Definição de distribuição de componentes interferentes
Equipamento de eletroforese	Bio-rad	1658033	Usado em western blotting para separação e transferência de proteínas nas etapas 8.5.2, 8.5.3, 8.5.5
Kit de quimioluminescência aprimorada HRP	Fdbio science	FD8020	Usado em western blotting para detecção de sinal na Etapa 8.5.12
Escherichia coli	American Type Culture Collection	ATCC8739	Isolate BEVs como controle positivo. Protocolo: Dissolva 25 g do pó LB em 1 L de água deionizada e autoclave. Transfira o 800 μ L de Escherichia coli preservada no meio. Cultive a 37 graus C no agitador da incubadora. Em seguida, centrifugue a 3.000 &vezes; g por 20 min a 4 > C, 12, 000 &vezes; g por 30 min a 4 > C, filtre o sobrenadante através de 0,22 μ membrana m, e realizar centrifugação de ultra-velocidade a 160.000 &vezes; g por 70 min a 4 °C. Pellet definido como BEVs brutos de Escherichia coli foi suspenso em 1,2 mL de PBS (Etapa 3, 4).
Tubos Falcon 50 mL	KIRGEN	KG2811	Pré-processamento para BEVs (Passo 3)
Tampão de Coloração de Proteína Feto	Absci	ab.001.50	Coloração azul brilhante de Coomassie no Passo 8.5.4
Papel de filtro	Biosharp	BS-TFP-070B	Observação morfológica para BEVs usando MET no Passo 8.3 (Blotting the solution)
Grades de cobre suportadas por Formvar/Carbono	Sigma-Aldrich	TEM-FCF200CU50	Observação morfológica para BEVs usando TEM na Etapa 8.3
HEPES em pó	Meilunbio	MB6078	Prepare tampões de iodixanol com diferentes concentrações para centrifugação de gradiente
de densidade HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H + L)	Fdbio science	FDM007	Western blotting (Anticorpo Secundário)
HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H + L)	Fdbio ciência	FDR007	Western blotting (Anticorpo Secundário)
Incubadora agitador	Qiangwen	DHZ-L	Cultive Escherichia coli
Kimwipes™ Toalhetes de Tarefa Delicada	Kimtech Science	34155	Limpe a parede interna do tubo de ultracentrífuga no Caldo Step 4.15
LB	Hopebio	HB0128	Cultive Escherichia coli
Freezer de baixa temperatura (-80 ° C)	Haier	DW-86L338J	Armazene as amostras
Metanol	Alalddin	M116118	Usado em western blotting para ativar a membrana de PVDF na Etapa 8.5.5
Microtubos 1,5 mL	KIRGEN	KG2211	Recuperar frações após centrifugação com gradiente
de densidade Microtubos 2 mL	KIRGEN	KG2911	Recuperar frações após centrifugação com gradiente de densidade
Micro tubos 5 mL	BBI	F610888-0001	Recupera frações após centrifugação com gradiente de densidade
Leitor de microplacas	Thermo Fisher	Multiskan MK3	Meça o teor de proteína dos BEVs na Etapa 8.2
Filtro Millipore 0.22 μ m	Merck millipore	SLGP033RB	Filtração esterilização; Material: polietersulfona, PES
NaCl	GHTECH	1.01307.040	Solução de centrifugação de gradiente de densidade
NaOH	GHTECH	1.01394.068	Solução de centrifugação de gradiente de densidade (ajuste de pH)
Optima™ XPN-100	Beckman Coulter	A94469	Ultracentrifugação para isolamento de BEVs na Etapa 4, 7
OptiPrep™	Serumwerk Bernburg AG	1893	Solução de estoque de centrifugação de gradiente de densidade
Orbital Shaker	Youning	CS-100	Dissolva as fezes na Etapa 2
Solução salina tamponada com fosfato	Procell	PB180327	Dissolva as fezes na Etapa 2
Pipetador	Eppendorf	3120000267, 3120000259	Transfira a solução
Pipeta de pasteur de plástico	ABCbio	ABC217003-4	Remova o sobrenadante no pré-processamento na Etapa 3.4
Membranas de difluoreto de polivinilideno (PVDF)	Millipore	ISEQ00010, IPVH00010	Usado em western blotting para transferência de proteínas na Etapa 8.5.5
Gel de poliacrilamida pré-fabricado, 4– 20% 15 Wells	ACE	F15420Gel	Usado em western blotting para separação de proteínas na Etapa 8.5.2, 8.5.3
Diluente de anticorpo primário	Fdbio science	FD0040	Usado em western blotting na Etapa 8.5.8
Escada de proteínas	Fdbio science	FD0672	Usado em western blotting e coloração azul brilhante de Coomassie na Etapa 8.5
Solução rápida de blotting de proteínas	UBIO	UW0500	Usado em western blotting para transferência de proteínas na Etapa 8.5.5
Rotor SW 32 Ti Rotor de Balde Oscilante	Beckman Coulter	369650	Ultracentrifugação para isolamento de BEVs na Etapa 4, 7
Seringa 20 mL, 50 mL	Jetway	ZSQ-20ML, YCXWJZSQ-50 mL	Buffers de transferência e removem sobrenadante no pré-processamento
de pó TBS	Ciência Fdbio	FD1021	Usado em western blotting na Etapa 8.5
Microscópio eletrônico de transmissão (TEM)	Hitachi	H-7650	Observação morfológica para BEVs na Etapa 8.3
Tween-20	Fdbio science	FD0020	Usado em western blotting na Etapa 8.5
Tubo de ultracentrífuga	Beckman	326823, 355642	Ultracentrifugação para isolamento de BEVs na Etapa 4, 7
Bancada ultra-limpa	AIRTECH	SW-CJ-2FD	Execute os procedimentos sobre o manuseio de líquidos
	Bluepard	CU600	Usado para medir o teor de proteína de BEVs na Etapa 8.2.5
ZetaView	Particle Metrix	S/N 21-734, Software ZetaView (versão 8.05.14 SP7)	Análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) para medir o tamanho das partículas e a concentração de BEVs na Etapa 8.4