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Artigo de método

Microdiálise Intradérmica: Uma Abordagem para Investigação de Novos Mecanismos de Disfunção Microvascular em Humanos

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DOI:

10.3791/65579

⸱

21 de julho de 2023

 ,  ,  , 
1Department of Kinesiology, The Pennsylvania State University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

A microdiálise intradérmica é uma técnica minimamente invasiva utilizada para investigar a função microvascular na saúde e na doença. Tanto os protocolos dose-resposta quanto os de aquecimento local podem ser utilizados para explorar mecanismos de vasodilatação e vasoconstrição na circulação cutânea.

Resumo

A vasculatura cutânea é um tecido acessível que pode ser utilizado para avaliar a função microvascular em humanos. A microdiálise intradérmica é uma técnica minimamente invasiva utilizada para investigar mecanismos da musculatura lisa vascular e função endotelial na circulação cutânea. Essa técnica permite a dissecção farmacológica da fisiopatologia da disfunção endotelial microvascular indexada pela diminuição da vasodilatação mediada pelo óxido nítrico, um indicador de risco para o desenvolvimento de doença cardiovascular. Nessa técnica, uma sonda de microdiálise é colocada na camada dérmica da pele, e uma unidade de aquecimento local com uma sonda de fluxometria Doppler a laser é colocada sobre a sonda para medir o fluxo de hemácias. A temperatura local da pele é pinçada ou estimulada com aplicação direta de calor, e agentes farmacológicos são perfundidos através da sonda para estimular ou inibir vias de sinalização intracelular a fim de induzir vasodilatação ou vasoconstrição ou interrogar mecanismos de interesse (cofatores, antioxidantes, etc.). A condutância vascular cutânea é quantificada, e mecanismos de disfunção endotelial em estados patológicos podem ser delineados.

Introdução

A doença cardiovascular (DCV) é a principal causa de morte nos Estados Unidos1. A hipertensão arterial sistêmica (HA) é um fator de risco independente para acidente vascular cerebral, doença coronariana e insuficiência cardíaca e estima-se que afete mais de ~50% da população dos Estados Unidos2. A HA pode se desenvolver como uma DCV independente (HA primária) ou como resultado de outra condição, como doença renal policística e/ou distúrbios endócrinos (HAS secundárias). A amplitude das etiologias da HA dificulta as investigações sobre os mecanismos subjacentes e danos aos órgãos-alvo observados com a HA. Diversas e novas abordagens de pesquisa sobre a fisiopatologia da lesão de órgão-alvo associada à HA são necessárias.

Um dos sinais patológicos mais precoces da DCV é a disfunção endotelial, caracterizada por vasodilatação mediada pelo óxido nítrico (NO) 3,4,5. A dilatação mediada por fluxo é uma abordagem comum usada para quantificar a disfunção endotelial associada à DCV, mas a disfunção endotelial em leitos microvasculares pode ser independente e precursora da das grandes artérias condutos6,7,8. Além disso, as arteríolas de resistência são mais diretamente atuadas pelo tecido local do que as artérias condutas e têm controle mais imediato sobre a entrega de sangue rico em oxigênio. A função microvascular é preditora de sobrevida livre de eventos cardiovasculares adversos 9,10,11. A microvasculatura cutânea é um leito vascular acessível que pode ser utilizado para examinar respostas fisiológicas e farmacológicas a estímulos vasoconstritores ou vasodilatadores. A microdiálise intradérmica é uma técnica minimamente invasiva, cujo objetivo é investigar os mecanismos da função da musculatura lisa vascular e endotelial na microvasculatura cutânea com dissecção farmacológica direcionada. Esse método contrasta com outras técnicas, como a hiperemia reativa pós-oclusiva, que não permite a dissecção farmacológica, e a iontoforese, que permite a administração farmacológica, mas é menos precisa em seu mecanismo de ação (revisada detalhadamente em outro artigo12).

A lógica por trás do desenvolvimento e uso dessa técnica é extensivamente revisada em outra publicação13. Esta abordagem foi originalmente desenvolvida para uso em pesquisa neurológica em roedores e, em seguida, foi primeiramente aplicada em humanos para investigar os mecanismos subjacentes à vasodilatação ativa de um ponto de vista termorregulatório. No final da década de 1990, esse método foi utilizado para examinar mecanismos neurais e endoteliais em relação ao aquecimento local da pele. Desde então, a técnica tem sido utilizada para investigar uma série de mecanismos de sinalização neurovascular na pele.

Usando essa técnica, nosso grupo e outros têm questionado os mecanismos de disfunção endotelial na microvasculatura de várias populações clínicas, incluindo, mas não se limitando a, dislipidemia, envelhecimento primário, diabetes, doença renal crônica, síndrome dos ovários policísticos, pré-eclâmpsia, transtorno depressivo maior 14,15,16,17,18,19 e hipertensão arterial 20,21,22,23,24. Por exemplo, um estudo anterior verificou que mulheres normotensas com história de pré-eclâmpsia, que apresentam risco aumentado para DCV, apresentaram redução da vasodilatação mediada pelo NO na circulação cutânea em comparação com mulheres com história de gravidez normotensa20. Em outro estudo, adultos com diagnóstico de hipertensão primária demonstraram aumento da sensibilidade à angiotensina II na microvasculatura em comparação com controles saudáveis21, e a farmacoterapia anti-hipertensiva crônica doadora de sulfidrila em pacientes com hipertensão primária demonstrou diminuir a pressão arterial e melhorar a vasodilatação mediada por sulfeto de hidrogênio e NO22. Wong e cols.23 encontraram vasodilatação prejudicada mediada por sensorios e NO em adultos pré-hipertensos, coincidindo com nosso achado de progressão da disfunção endotelial com o aumento dos estágios de HA, conforme categorizado pelas diretrizes de 2017 da American Heart Association e do American College of Cardiology24.

A técnica de microdiálise intradérmica permite investigações mecanicistas rigorosamente controladas da função microvascular em estados de saúde e doença. Portanto, este trabalho tem como objetivo descrever a técnica de microdiálise intradérmica aplicada por nosso grupo e outros. Detalhamos os procedimentos de estimulação farmacológica do endotélio com acetilcolina (ACh) para examinar a relação dose-resposta e a estimulação fisiológica da produção endógena de NO com um protocolo de estímulo de aquecimento local de 39 °C ou 42 °C. Apresentamos resultados representativos para cada abordagem e discutimos as implicações clínicas dos achados decorrentes dessa técnica.

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Protocolo

Todos os procedimentos são aprovados pelo Comitê de Revisão Institucional da Universidade Estadual da Pensilvânia antes do recrutamento dos participantes.

1. Configuração do equipamento

  1. Ligue a unidade de aquecimento local e o medidor de vazão laser Doppler.
    NOTA: Ambos devem ser calibrados antes da coleta de dados de acordo com as instruções do fabricante. O medidor de vazão laser Doppler deve ser conectado ao hardware de aquisição de dados com amostragem em 100 Hz (100 amostras/min) e registro contínuo em um software de aquisição de dados. Enquanto outros hardwares e softwares de aquisição de dados podem ser usados, para simplificar, as instruções restantes refletem os recursos de hardware e software do LabChart do PowerLab.
  2. Abra um arquivo de software LabChart.
    NOTA: Um arquivo de referência com a entrada de dados desejada e recursos de coleta contínua de dados deve ser feito com antecedência. Deve haver um painel para cada laser Doppler e aquecedor local que corresponda a cada local de microdiálise, e os painéis devem corresponder às entradas de canal apropriadas na unidade de hardware de aquisição de dados.

2. Colocação de fibras de microdiálise

  1. Identificar os grandes vasos sanguíneos visíveis da pele na face ventral do antebraço e indicá-los com um marcador permanente (utilizar um torniquete para visualizar os vasos, se necessário; identificar vasos na pele pigmentada escura pode exigir maior confiança na palpação).
  2. Esfregue a área que engloba as marcas e uma porção generosa da área circundante usando cotonetes betadina. Limpe a betadina com compressas com álcool. Cubra a área esterilizada da pele com um campo estéril e aplique gelo por ~5 min para anestesiar a área.
  3. Retire o gelo e insira uma agulha introdutora (23 G, 25 mm de comprimento), chanfrada virada para cima, na camada dérmica da pele a uma profundidade de 2-3 mm (dependendo da espessura individual da pele). Avançar a agulha, tomando o cuidado de permanecer na camada dérmica, e sair da pele a ~20 mm do ponto de inserção.
    NOTA: Para confirmar a profundidade adequada de colocação na pele, a forma da agulha deve ser visível e facilmente palpável, mas a cor da agulha deve ser ocultada. Se mais de uma sonda de microdiálise for necessária para o experimento, quaisquer duas agulhas introdutoras precisarão ser colocadas ≥2,5 cm de distância e posicionadas antes da inserção da sonda de microdiálise. As sondas não devem ser colocadas ao longo do mesmo vaso principal.
  4. Deixando a agulha no lugar, conecte a sonda (através da trava Luer) a uma seringa contendo solução de Ringer com lactato. Alimentar a extremidade oposta da sonda através da agulha introdutora até que a membrana semipermeável da sonda esteja próxima, mas ainda fora da abertura da agulha introdutora. Perfundir lentamente uma pequena quantidade de solução de Ringer através da fibra até que a solução seja visivelmente perfundida através dos poros da membrana para confirmar a integridade da membrana.
  5. Se estiver usando uma sonda de microdiálise da Harvard Bioscience e uma agulha introdutora, siga as etapas 2.5.1-2.5.2.
    1. Após a confirmação da função da sonda, alimente a sonda através da agulha introdutora até que a membrana esteja completamente contida na camada dérmica da pele dentro da agulha introdutora.
    2. Com o uso de um dedo, prenda a sonda no lugar proximal à agulha e retire a agulha na direção oposta à inserção. Colocar a porção externa da fibra na pele para evitar o deslocamento da membrana semipermeável durante o experimento.
  6. Se estiver usando uma sonda de microdiálise da Bioanalytical Systems e uma agulha introdutora, siga as etapas 2.6.1-2.6.2.
    1. Após a confirmação da função da sonda, segure o cubo da agulha introdutora e a porção distal da sonda de microdiálise em uma das mãos e, simultaneamente, retire a agulha oposta à direção de inserção, movendo a sonda de microdiálise para o lugar.
    2. Ajuste a sonda conforme necessário para garantir que a membrana semipermeável esteja completamente enterrada na pele. Colocar a fibra externa na pele para evitar o deslocamento da membrana semipermeável durante o experimento.

3. Hiperemia

  1. Enquanto aguarda que a resposta hiperêmica à inserção da agulha diminua (~60-90 min), coloque a seringa de uso único na bandeja do suporte da seringa nas bombas de microinfusão. Perfundir solução de Ringer com lactato, soro fisiológico ou solução veículo (a solução na qual o agente farmacológico experimental é dissolvido; 2 μL/min) durante a fase de hiperemia.
    NOTA: Enquanto as sondas de microdiálise não podem ser removidas durante esta fase de ~60-90 min, o participante pode ajustar sua posição corporal ou mover sua mão, ou a trava Luer da sonda pode ser removida da seringa e presa com fita adesiva ao braço do participante para permitir que ele fique em pé por um breve período. Uma vez instrumentadas com aquecedores locais e sondas de Doppler fluxometria a laser (LDF) e uma vez iniciada a coleta de dados, as sondas LDF não podem ser movidas.
  2. Quando a vermelhidão da pele, que é um indicador da resposta hiperêmica ao trauma da agulha, tiver diminuído, conecte a unidade de aquecimento local à pele que cobre a membrana semipermeável através do disco adesivo da sonda, garantindo que o centro do aquecedor se alinhe com o caminho da sonda de microdiálise.
  3. Coloque a sonda LDF na abertura no centro do aquecedor local para que o laser fique diretamente perpendicular à superfície da pele. Uma vez que as sondas de LDF são colocadas e seguras, clique em iniciar no software de aquisição de dados para registrar e exibir continuamente os valores de fluxo de hemácias (fluxo de hemácias; unidades de perfusão, UP). Se a hiperemia tiver diminuído completamente, o fluxo de hemácias será estável em ~5-20 UP (a pulsatilidade dos vasos abaixo da sonda LDF pode ser refletida por pequenas elevações na UP que coincidem com os batimentos cardíacos).
  4. Coloque um manguito automático de pressão arterial no braço de um sujeito que não tenha sido instrumentado.
  5. Ajuste os aquecedores locais a 33 °C para fixar a temperatura da pele dentro de uma faixa termoneutra25, eliminando assim quaisquer variações na influência dos estímulos térmicos. Para adicionar um comentário à gravação contínua no software de aquisição de dados para indicar eventos no experimento, clique na caixa de texto no canto superior direito da tela, digite um comentário, selecione quais canais devem receber o comentário e clique em adicionar.

4. Protocolo dose-resposta à acetilcolina

  1. Uma vez que o fluxo de hemácias tenha se estabilizado em resposta ao calor local de 33 °C, inicie a coleta de dados basais, distinguida no arquivo de software de aquisição de dados por um comentário iniciar a linha de base. Pelo menos um mínimo de 5-10 min de linha de base estável é necessário para a análise dos dados; reinicie a linha de base a qualquer momento durante este ponto da coleta de dados, se necessário, e marque isso no arquivo LabChart. No último minuto da linha de base, colete uma medida de pressão arterial e insira os valores em um comentário no arquivo LabChart.
  2. Ao final dos 5-10 min de coleta de dados basais, meça e registre a pressão arterial basal e insira a linha de base final do comentário no software de aquisição de dados.
  3. Desligue as bombas de microinfusão e troque as seringas cheias de solução de Ringer com lactato pela seringa preenchida com a menor concentração de ACh (10−10 M).
  4. Fixe as novas seringas no lugar e confirme a perfusão do fluido através da extremidade da sonda antes de ligar novamente as bombas de microinfusão. Digite o comentário start −10 na gravação do software de aquisição de dados.
  5. Cada concentração de ACh será perfundida por 5-10 min a 2 μL/min. No minuto final de perfusão, para cada concentração, medir e registrar a pressão arterial. Uma vez terminado o tempo de perfusão para uma determinada concentração, substitua a seringa pela próxima concentração mais alta (por exemplo, a solução de ACh de 10−10 M é trocada por uma solução de ACh de 10−9 M), conforme descrito nas etapas 4.2-4.4.
  6. Imediatamente após a perfusão da concentração final de ACh (10−1 M), substitua a seringa de ACh por uma contendo solução de Ringer e aumente a temperatura do aquecedor local para 43 °C. Uma vez estabilizado o fluxo de hemácias, substitua a solução de Ringer por nitroprussiato de sódio (28 mM) para produzir vasodilatação local máxima induzida pelo calor e induzida farmacologicamente. Medir e registrar a pressão arterial a cada ~3 min durante esta fase de vasodilatação máxima.
  7. Uma vez que um platô máximo de fluxo de hemácias tenha ocorrido (~5 min de PU estável), finalize o experimento. Selecione parar no canto inferior direito do software de aquisição de dados para encerrar a coleta contínua de dados.

5. Protocolo de aquecimento local

  1. Uma vez estabilizado o fluxo eritrocitário após a hiperemia, inicie a coleta de dados basais e indique isso no arquivo do software de aquisição de dados com um comentário. No último minuto da linha de base, colete uma medida da pressão arterial e insira os valores em um comentário no arquivo do software de aquisição de dados.
  2. Aumente os aquecedores locais para 39 °C ou 42 °C, dependendo das necessidades do protocolo (explicado na seção de discussão).
  3. Uma vez que o fluxo de hemácias tenha estabilizado em resposta à aplicação de calor local (~40-60 min de aquecimento), perfundir N G-nitro-l-arginina metil éster (L-NAME; 15 mM dissolvido em solução de Ringer; 2 μL/min; um inibidor da sintase NO) através da(s) sonda(s) de microdiálise.
  4. Uma vez que o fluxo de hemácias tenha se estabilizado em resposta ao L-NAME (~15-25 min de perfusão), aumente os aquecedores locais para 43 °C.
  5. Uma vez que o fluxo de hemácias tenha se estabilizado em resposta a 43 °C (um platô de ~2-5 min ocorre após ~20-45 min de aquecimento), perfundir nitroprussiato de sódio (28 mM dissolvido em solução de Ringer) através da(s) sonda(s) de microdiálise.
  6. Uma vez que um platô máximo de fluxo de hemácias tenha ocorrido (~5 min de PU estável), finalize o experimento. Selecione parar no canto inferior direito do software de aquisição de dados para encerrar a coleta de dados.

6. Remoção das sondas de microdiálise

  1. Após o término do experimento, use uma tesoura cirúrgica para cortar as sondas de microdiálise. Remova cuidadosamente as sondas de LDF dos aquecedores e remova os aquecedores da pele. Remova suavemente a fita que mantém as sondas no lugar sobre a pele.
  2. Identifique visualmente qual local de punção em cada lado da sonda formou o menor coágulo sanguíneo. Corte a porção da sonda perto do local com o coágulo menor, deixando ~1 dentro da sonda fora da pele sem cortes.
  3. Limpe a parte da pele ao redor dos locais de entrada e saída da sonda com um cotonete de álcool, bem como o ~1 de comprimento da sonda deixado no local menos coagulado.
  4. Deixe o álcool secar na pele. Em seguida, segure a porção da sonda que se estende do local da punção com o coágulo maior, oposto ao ~1 na porção na extremidade menos coagulada. Puxe lentamente a sonda em direção ao coágulo sanguíneo maior.
  5. Coloque gaze estéril sobre qualquer sangramento resultante da remoção da sonda e aplique pressão.

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Resultados

Protocolo dose-resposta à acetilcolina

A Figura 1A mostra um esquema detalhando o protocolo dose-resposta da ACh. A Figura 1B ilustra os traçados representativos dos valores de fluxo de hemácias (unidades de perfusão, UP; médias de 30 s) do protocolo padronizado de dose-resposta de ACh para um indivíduo ao longo do tempo. A Figura 1C ilustra um arquivo de dados brutos de um protocolo de d...

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Discussão

A técnica de microdiálise intradérmica é uma ferramenta versátil na pesquisa vascular humana. Os pesquisadores podem alterar o protocolo para diversificar ainda mais suas aplicações. Por exemplo, descrevemos um protocolo dose-resposta de ACh, mas outras investigações sobre os mecanismos de vasoconstrição ou tônus vasomotor, em vez de vasodilatação isolada, têm utilizado abordagens dose-resposta de noradrenalina ou nitroprussiato de sódio 26,27,28,29,30,31.

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse e nada a divulgar.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Seringas de 1 mLSeringas BD302100
AcetilcolinaEstados Unidos Farmacopeia1424511Dados piloto coletados em nosso laboratório indicam que a secagem da acetilcolina aumenta a variabilidade da resposta CVC; não seque, armazene em dessecador
Cotonetes de álcoolMckesson191089
Baby Bee Syringe DriveBioanalytical Systems, IncorporatedMD-1001Neste estudo, foi utilizado o suporte opcional de 3 seringas (número catálico MD-1002)
Sondas Lineares de Microdiálise CMA 30Aparelho HarvardCMA8010460
Monitor de Ponto ConnexWelchAllyn74CT-Bmonitor automatizado de pressão arterial
Hive Syringe Pump ControllerBioanalytical Systems,Incorporated MD-1020Controla até 4 Baby Bee Syringe Drives
LabChart 8AD Instruments**O hardware PowerLab e o software LabChart devem ser versões compatíveis
Solução de Lactato de RingerAvantor (VWR)76313-478
Medidor de fluxo sanguíneo Doppler a laserMoor InstrumentsMoorVMS-LDF
Kit de calibração da sonda Doppler a laserMoor InstrumentsCAL
Sonda Doppler aMoor InstrumentsLinear VP12
Bioanalytical Systems, Inc.MD-2000
NG-nitro-l-arginina éster metílicoSigma Aldrich483125-ML-NAME
Iodopovidona / betadineDynarex1202
PowerLab C Dispositivo de aquisição de dadosAD InstrumentsPLC01**
Interface do instrumento PowerLab CAD InstrumentsPLCI1**
Discos adesivos de sondaMoor Instrumentsconecta unidade de aquecimento local à pele
Controlador de aquecedor de peleMoor InstrumentsmoorVMS-HEAT 1.3
Sonda de aquecimento pequenaMoor InstrumentsVHP2
Cortinas estéreisAdriana89731
Gaze estérilDukal Corporation2085
Luvas cirúrgicas estéreisEsteem Número de catálogo Cardinal Health8856Nseguido pelas iniciais do tamanho da luva e, em seguida, a letra "B" (por exemplo, 8856NMB para médio)
Tesoura cirúrgicaCole-ParmerUX-06287-26
laser Sondas de Microdiálise

Referências

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Reimpressões e permissões

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Microdiálise Intradérmica: Uma Abordagem para Investigação de Novos Mecanismos de Disfunção Microvascular em Humanos
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