Nesse protocolo, um modelo de osteoartrite de joelho foi elaborado pelo método de Videman modificado, e os procedimentos operatórios e precauções da acupotomia são detalhados. A eficácia da acupotomia tem sido demonstrada testando-se as propriedades mecânicas do quadríceps femoral e tendíneo e as propriedades mecânicas e morfológicas da cartilagem.
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Artigo de método
Aplicação de Acupotomia em Modelo de Osteoartrite de Joelho em Coelhos
Neste artigo
Resumo
Resumo
A osteoartrite do joelho (OA) é uma das doenças mais frequentemente encontradas no departamento ortopédico, o que reduz seriamente a qualidade de vida das pessoas com OA de joelho. Dentre vários fatores patogênicos, o desequilíbrio biomecânico da articulação do joelho é uma das principais causas de OA. A acupotomologia acredita que restaurar o equilíbrio mecânico da articulação do joelho é a chave para o tratamento da OA de joelho. Estudos clínicos mostraram que a acupotomia pode efetivamente reduzir a dor e melhorar a mobilidade do joelho, reduzindo a adesão, a contratura dos tecidos moles e os pontos de concentração de estresse nos músculos e tendões ao redor da articulação do joelho.
Nesse protocolo, utilizamos o método de Videman modificado para estabelecer um modelo de OA por meio da imobilização do membro posterior esquerdo em posição reta. Delineamos detalhadamente o método de operação e os cuidados relacionados à acupotomia e avaliamos a eficácia da acupotomia em conjunto com a teoria da "Modulação de Músculos e Tendões no Tratamento de Distúrbios Ósseos" através da detecção das propriedades mecânicas do quadríceps femoral e tendão, bem como da mecânica e morfologia da cartilagem. Os resultados mostram que a acupotomia tem um efeito protetor sobre a cartilagem, ajustando as propriedades mecânicas dos tecidos moles ao redor da articulação do joelho, melhorando o ambiente de estresse da cartilagem e retardando a degeneração da cartilagem.
Introdução
A osteoartrite do joelho (OA) é a forma mais frequente de osteoartrite, frequentemente reconhecida como uma doença de toda a articulação caracterizada por degeneração da cartilagem articular, que se manifesta clinicamente como dor, edema e limitação dos movimentos das articulaçõesafetadas1. De acordo com estatísticas epidemiológicas recentes, o KOA afetou 654,1 milhões de indivíduos em todo o mundo com 40 anos de idade ou mais em 2020. A prevalência e a incidência de OA aumentam com a idade, são mais altas em adultos de meia-idade e idosos, e afetam mais mulheres do que homens2. É provável que a prevalência de OA aumente devido ao envelhecimento da população e à epidemia de obesidade em todo o mundo, representando uma ameaça crescente à saúde pública global. Idade, sexo, obesidade, trauma e outros fatores de risco complicados associados à OA afetam diretamente a instabilidade do joelho, tornando o desequilíbrio biomecânico nas articulações do joelho uma das principais causas de OA3.
Em condições fisiológicas normais, a articulação do joelho está em um estado de equilíbrio mecânico, garantindo que as cargas mecânicas na articulação sejam distribuídas uniformemente sobre a cartilagem. Qualquer desequilíbrio mecânico na articulação do joelho pode levar a um estresse anormal na cartilagem, resultando na degeneração da cartilagem e no aparecimento de OA4. O sistema músculo-tendão é o principal sistema dinâmico que mantém o equilíbrio mecânico da articulação do joelho. O movimento coordenado do sistema músculo-tendão extensor e flexor pode distribuir uniformemente a carga gerada pelo movimento na superfície da cartilagem, evitando o desequilíbrio metabólico das tensões da cartilagem local além de sua carga fisiológica que resulta em perda de cartilagem5. A diminuição da força muscular é a principal causa de distúrbio do movimento intramuscular e dano da cartilagem, que pode ocorrer antes da OA sintomática.
A OA também pode induzir inibição da musculatura artrógena (IAM), manifestando-se como fraqueza muscular e diminuição da força muscular ao redor do joelho6. Dentre esses músculos, o grupo quadríceps femoral funciona como o único extensor do joelho, uma estrutura importante na manutenção da estabilidade articular do joelho. Estudos têm demonstrado que a diminuição da área de secção transversa do quadríceps e da força muscular correlaciona-se significativa e positivamente com a progressão do OA7. O declínio da força do quadríceps afeta o padrão da marcha, a estabilidade do joelho, os padrões de movimento e muitas outras funções. Além disso, o declínio da força muscular prejudica a função tendínea, manifestando-se como diminuição da rigidez tendínea, módulo de elasticidade e outras propriedades biomecânicas8. No reparo de estiramentos a longo prazo, alterações como adesão e contratura podem ocorrer nos músculos e tendões da articulação do joelho, prejudicando suas propriedades mecânicas, causando instabilidade articular e, finalmente, formando um ciclo vicioso de alterações patológicas da OA. É, portanto, crucial para o tratamento de OA melhorar as propriedades mecânicas do sistema músculo-tendão e restaurar o equilíbrio mecânico articular.
Dentre as causas de OA de joelho, o desequilíbrio biomecânico é o principal fator indutor de dor no joelho, disfunção, lesões inflamatórias e degeneração da cartilagem9. Portanto, a chave para o tratamento de OA é restaurar o equilíbrio biomecânico da articulação do joelho. A acupotomologia acredita que a etiologia e a patogênese da OA são "desequilíbrio mecânico". Quando as características mecânicas dos tecidos moles ao redor do joelho mudam anormalmente, a articulação do joelho perde seu equilíbrio mecânico, e o ambiente de estresse mecânico anormal da articulação acelera a degeneração, causando estimulação inflamatória para agravar ainda mais as aderências de tecidos moles, contraturas e declínio adicional na estabilidade articular. Esse ciclo vicioso acaba se transformando em KOA. Ao afrouxar aderências e contraturas de tecidos moles, bem como reduzir a concentração de estresse nos músculos e tendões, a acupotomia em conjunto com a teoria da "Modulação de Músculos e Tendões para Tratamento de Distúrbios Ósseos" melhora a mecânica dos tecidos moles e "modula músculos e tendões", o que equilibra o estresse mecânico da articulação, aliviando efetivamente a degeneração da cartilagem e "tratando distúrbios ósseos"10. Em termos de seleção de modelos animais, com base no objetivo deste estudo, preparamos o modelo de OA pelo método de Videman modificado de imobilização da extensão do membro posterior esquerdo.
Este trabalho detalha o estabelecimento do modelo de OA utilizando o método Videman modificado de imobilização da extensão do membro posterior esquerdo e o método de operação e precauções da acupotomia. Demonstramos a eficácia da acupotomia testando as propriedades mecânicas do quadríceps femoral e tendão e detectando alterações no estresse e morfologia da cartilagem articular.
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Protocolo
Todos os experimentos com animais foram revisados e aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Medicina Chinesa de Pequim (nº. BUCM-4-2022010101-1097). Neste protocolo, 24 coelhos machos da raça Nova Zelândia, com 6 semanas de idade, foram alojados sob uma condição específica, a saber, 20-25 °C, 50-60% de umidade e um ciclo circadiano claro / 12 h escuro de 12 horas, com livre acesso a uma dieta regular de ração. Os coelhos foram anestesiados e sacrificados pela combinação de anestesia profunda e embolização aérea. A dor é uma das características patológicas típicas da OA e também é um dos principais indicadores usados para avaliar modelos animais de OA e métodos de intervenção, de modo que analgésicos não são usados durante a preparação do modelo.
1. O modelo de coelho KOA
- Anestesiar coelhos com pentobarbital sódico a 3% (30 mg/kg) por via intravenosa na margem da orelha. Para confirmar o nível adequado de anestesia, procure um reflexo corneano significativamente enfraquecido ou ausente e a ausência de dor ao pinçar a pele com pinça hemostática. Durante a anestesia, adicione 2-3 gotas de lubrificante aos olhos dos coelhos a cada 15 minutos para evitar que os olhos dos coelhos sequem.
- Após a anestesia, fixar cada coelho na posição supina, puxando o membro posterior esquerdo para uma posição totalmente estendida.
- Fixar o membro posterior esquerdo de cada coelho na posição estendida.
- Como primeira camada, use fita adesiva para cobrir a pele do coelho desde a virilha até a articulação do tornozelo.
- Como segunda camada, enrole uma fita de espuma dupla face de 36 mm de largura sobre a fita médica e, em seguida, enrole uma bandagem de polímero da virilha até a articulação do tornozelo. Certifique-se de que a articulação do joelho esteja 180° reta e a articulação do tornozelo esteja dorsiflexionada em 60°.
- Como terceira camada, imobilize as articulações com pequenas talas na frente e atrás das articulações do joelho e tornozelo, e envolva a malha de aço ao redor da camada mais externa para proteger contra mordidas. Expor os dedos dos coelhos para observar se a circulação sanguínea está normal.
- Imobilizar os animais por 6 semanas para estabelecer o modelo de KOA (Figura 1).
OBS: 1) Durante a preparação do modelo, inspecione os moldes a cada dois dias. Se algum molde estiver solto ou desprendido, anestesiar os coelhos e reimobilizar os membros posteriores esquerdos em posição estendida. 2) Coloque tapetes de proteção no fundo das gaiolas para evitar que os membros dos coelhos fiquem presos e causem ferimentos.
2. Intervenção acupotomia
OBS: Antes do início da intervenção acupotomia, anestesiar os coelhos com pentobarbital sódico a 3% (30 mg/kg) por injeção intravenosa na margem da orelha.
- Determine os pontos de tratamento.
- Raspe a pele da articulação do joelho do membro posterior esquerdo do coelho.
- Palpar a inserção do tendão do músculo femoral medial da articulação do joelho do coelho, inserção do tendão do reto femoral, inserção do tendão do bíceps femoral e bursa do pé de ganso. Marque indurações patológicas dos músculos locais com um marcador cutâneo estéril. Desinfetar a articulação do joelho três vezes com rodadas alternadas de iodóforo médico e álcool medicinal a 75%.
- Operação de acupotomia
- Manter a lâmina de acuxotomia paralela à direção do trajeto paralela ao tendão e ao eixo longitudinal do membro.
- Use o polegar da mão esquerda para pressionar a pele que entra no ponto marcador e mover-se lateralmente para que os vasos sanguíneos e nervos sejam separados no lado ventral do polegar.
- Com a alça de acupotomia na mão direita, pressione para baixo rapidamente com uma pequena força para que a lâmina de acupotomia passe instantaneamente pela pele. Avançar lentamente a lâmina de acuxotomia até as indurações musculares locais e fazer cortes longitudinais e balanços lateralmente.
- Após a operação de acupotomia estar completa, desinfete a articulação do joelho novamente e aplique um band-aid.
- Realizar esta operação uma vez por semana durante 4 semanas (Figura 2).
OBS: 1) Se não houver enduração ou tecido semelhante a um cordão tocado na inserção tendínea do vasto medial, vasto lateral, reto femoral, bíceps femoral ou bursa anserina, a agulha de acupotomia deve ser usada para liberar diretamente suas inserções tendíneas. 2) Durante a intervenção da acupotomia, não imobilizar os membros posteriores esquerdos dos coelhos do grupo acuxotomia e do grupo modelo em posição de extensão.
3. Módulo de elasticidade do quadríceps femoral
NOTA: 1) Este experimento utilizou o instrumento diagnóstico ultrassonográfico de onda de cisalhamento em tempo real (SWE) para medir o módulo de elasticidade do quadríceps femoral in vivo em cada grupo de coelhos. 2) O testador deve ser um ultrassonografista experiente em detecção por ultrassonografia. Durante a medição, a sonda de ultrassom deve ser suavemente colocada na superfície cutânea do quadríceps para evitar tensão muscular local. As medidas precisam ser feitas quando o animal está em um estado tranquilo, sem luta ou atividade. Se o animal estiver ativo, aguarde até que esteja calmo antes de realizar o teste.
- Raspar o pelo para expor a pele na região do quadríceps do membro posterior esquerdo.
- Utilizar ultrassonografia bidimensional convencional para localizar o músculo-abdome do quadríceps e determinar a região de interesse (ROI), ajustada para uma profundidade de 1-2 cm.
- Inicie o modo SWE para inspeção.
- Defina a área de interesse uniformemente para uma área circular com um diâmetro de 2 mm e a área de interesse para ~0,5-1 cm de profundidade da superfície da pele.
- Use o instrumento de diagnóstico ultra-sônico para gerar um impulso de força de radiação acústica para estimular o tecido muscular e obter elastografia tecidual.
- Aguarde 2-3 s para que a imagem se estabilize e, em seguida, congele a imagem. Ativar a função Q-BOX do instrumento para medir o módulo de Young do músculo quadríceps.
- Aguarde até que o sistema calcule automaticamente os valores máximo, mínimo e médio (unidade: KPa) do módulo de ROI de Young. Selecione três ROIs na mesma profundidade para três medições e tome o valor médio para análise estatística.
NOTA: O testador deve ser um ultrassonografista experiente em detecção de ultrassom. Durante a medição, a sonda de ultrassom deve ser suavemente colocada na superfície cutânea do quadríceps para evitar tensão muscular local. As medidas precisam ser feitas quando o animal está em um estado tranquilo, sem luta ou atividade. Se o animal estiver ativo, aguarde até que esteja calmo antes de realizar o teste.
4. Mensuração da força de contração do quadríceps femoral
OBS: Após a mensuração da força de contração do quadríceps femoral, os coelhos foram eutanasiados por embolia gasosa sob anestesia.
- Anestesiar os coelhos com pentobarbital sódico a 3% (30 mg/kg) por via intravenosa na margem da orelha. Para confirmar que o nível adequado de anestesia foi atingido, procure um reflexo corneano significativamente enfraquecido ou ausente e a ausência de dor ao pinçar a pele com pinça hemostática. Durante a anestesia, adicione 2-3 gotas de lubrificante aos olhos dos coelhos a cada 15 minutos para evitar que os olhos dos coelhos sequem.
- Expor os músculos quadríceps e fixar o transdutor de tensão.
- Corte a pele abaixo da patela, ao longo do eixo longitudinal do membro para cima até a base da coxa, e continue a cortar a pele para cima em 3-4 cm. Descasque cuidadosamente a pele e a fáscia e exponha o músculo. Cortar o ligamento patelar e separar cuidadosamente o quadríceps da junção ilíaca, mantendo o quadríceps em conexão com o ilíaco.
- Ligate as suturas cirúrgicas na junção tendínea entre a patela e o músculo quadríceps. Estique o músculo até o seu comprimento total em seu estado natural e, em seguida, fixe-o ao transdutor de tensão. Mantenha a linha de ligadura no músculo em linha reta com a linha de ligadura no transdutor de força.
- Fixe o transdutor de tensão no suporte. Conecte a linha de aquisição de sinal no transdutor de tensão ao processador do sistema de aquisição de biossinais.
- Medir o desempenho contrátil do músculo quadríceps.
- Inserir os eletrodos paralelamente ao abdome do quadríceps e evitar qualquer contato entre os eletrodos.
- Pressione o botão do osciloscópio. Ajuste a posição do transdutor de força no suporte para manter a linha de base em zero. Selecionar os parâmetros de estimulação do estimulador com largura de onda de 5 ms e atraso de 10 ms.
- Use um único estímulo primeiro e ajuste gradualmente a intensidade do estímulo de zero com um incremento de 0,1 V a cada vez. Observar as mudanças na curva de contração muscular e amplitude de contração até determinar a amplitude de contração única (Pt) máxima do quadríceps. Registre-o para estatísticas subsequentes.
- Use um estímulo cluster e use a amplitude do estímulo que induz a amplitude máxima de contração única como linha de base para estimular continuamente o músculo e aumentar gradualmente a frequência do estímulo. Observe as mudanças na curva de contração muscular até determinar a amplitude máxima de contração (Pt) do quadríceps. Registre-o para estatísticas subsequentes.
NOTA: 1) Após cada contração muscular, o músculo deve receber 30 s para relaxar com a solução tampão muscular sendo gotejada continuamente sobre o músculo. 2) Durante a operação, julgar o estado anestésico monitorando o reflexo palpebral, o ritmo respiratório, o relaxamento muscular e a resposta de pinçamento da pele dos coelhos.
5. O desempenho mecânico do tendão do quadríceps
- Pré-processamento: No dia do teste, meça o comprimento, a largura e a espessura do tendão do quadríceps com um paquímetro vernier e instale uma pinça antiderrapante especial na máquina de teste de fadiga. Repita a carga e descarga 15x para pré-processamento.
- Teste de relaxamento de tensão: Use o sensor que varia de 0 N a 100 N, estique-o a uma velocidade de 5 mm/min até atingir o comprimento necessário e, em seguida, comece a coletar dados. Defina o tempo de aquisição de dados do computador a partir de t (0), coletando dados a cada 0,1 s, com duração de 1.800 s. Após atingir o tempo definido, registre dados e curvas.
- Ensaio de tração: Utilizar o sensor que varia de 0 N a 100 N e esticá-lo a uma velocidade de 5 mm/min até a carga máxima até que o corpo de prova seja afastado. Após o ensaio, calcular o deslocamento máximo, a carga última e a rigidez do corpo de prova.
6. Pressão na superfície de contato articular e pressão por unidade de área da cartilagem
- Fixar os corpos de prova de fêmur e tíbia de ambos os lados em posição reta sobre o acessório e realizar um teste de pré-carga. Meça a faixa aproximada da articulação do joelho, corte o papel sensível à pressão no mesmo formato e sela-o com filme plástico.
- Coloque o papel sensível à pressão selado entre as articulações da tíbia e do fêmur e realize um teste de pressão na articulação do joelho com uma pressão de 5 mm/min e uma pressão máxima de 50 N. Mantenha a pressão por 2 min até atingir 50 N quando o papel sensível à pressão estiver de cor estável.
- Após 2 min, remova o papel sensível à pressão, fixe a superfície colorida em uma folha de papel tamanho A4 e adquira imagens com a escala reservada.
- Carregue a imagem no computador. Use o software referenciado para medição de área e medição multissegmento para figuras irregulares. Meça a pressão interna e externa das articulações do fêmur e da tíbia e registre os resultados.
7. Coloração Safranin O/Fast Green da cartilagem articular do joelho
- Após o término da intervenção acupotomia, retirar os tecidos do complexo ósseo cartilaginoso-subcondral e incorporá-los em parafina. Corte os blocos de cera de tecido preparados e prepare lâminas. Desparafinizar as lâminas de tecido preparadas com solução de desparafinação ambiental (I) e solução de desparafinação ambiental (II) por 15 min cada; em seguida, mergulhá-los sucessivamente em xileno e etanol anidro (1:1), etanol anidro (I), etanol 95%, etanol 85% e etanol 75%, 2-5 min cada passo; e, por fim, mergulhe-os em água destilada por 15 min.
- Realizar coloração.
- Manchar as lâminas com solução Fast Green por 1 min. Durante esse processo, retire as lâminas da solução e observe-as ao microscópio até que o tecido fique corado de verde escuro.
- Separação de cor: Enxágue o excesso de solução Fast Green com água ultrapura. Mergulhe as lâminas rapidamente em solução de ácido acético a 1% por 5 a 10 segundos. Novamente, enxágue a lâmina com água ultrapura.
- Manchar as lâminas em solução de Safranine O por 10-15 min até que a cartilagem esteja corada de vermelho.
- Desidrate e clareie o tecido, sele as lâminas de vidro e observe-as ao microscópio.
- Mergulhe as lâminas em etanol 75%, etanol 85%, etanol 95% e etanol 100% por 3 a 5 segundos sucessivamente.
- Mergulhe as lâminas em solução de desparafinação ambiental (I) e solução de desparafinação ambiental (II) por 10 min sucessivamente. Retire as lâminas e solte o meio resinoso neutro na parte frontal das lâminas, evitando o tecido. Coloque a borda do vidro de cobertura sobre a lâmina e, em seguida, coloque-a lentamente para cobrir o bálsamo neutro. Retire o ar e evite bolhas de ar. Limpe o xileno extra e o bálsamo neutro e deixe-o repousar durante a noite à temperatura ambiente.
- Observe as lâminas ao microscópio e adquira imagens. Para cada grupo, selecione seis amostras de cartilagem do joelho de coelho e selecione aleatoriamente quatro campos de visualização diferentes para cada amostra para avaliação. Pontuar a histologia da cartilagem de cada grupo de acordo com o método de Mankin (Tabela 1).
8. Análise estatística
- Dados expressos como média ± desvio padrão (
± s). - Realizar análise de variância (ANOVA) one-way e teste LSD para determinar a significância estatística das comparações entre múltiplos grupos.
- Considerar diferenças estatisticamente significantes quando P < 0,05.
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Resultados
Resultados experimentais das propriedades mecânicas do quadríceps femoral e tendão
Para avaliar o efeito da acupotomografia nas propriedades mecânicas do quadríceps femoral em coelhos com OA de joelhos, utilizamos imagens de ultrassom elástico por ondas de cisalhamento em tempo real e um transdutor de tensão muscular, respectivamente. Em comparação com o grupo controle, o módulo de Young do quadríceps femoral no grupo OA apresentou diminuição (P < 0,05). Em comparação com o grupo OA, o mód...
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Discussão
Um modelo animal adequado é um dos fatores-chave para atingir os objetivos experimentais e esclarecer uma questão científica específica. Este estudo foi baseado nas teorias de "Zongjin controlando ossos e articulações lubrificantes" e "desequilíbrio mecânico" em acupotomologia, com o objetivo de explicar a conotação científica por trás do tratamento de OA por meio da "modulação de músculos e tendões para tratar distúrbios ósseos" na terapia de acupotomia. Em outras palavras, a acupotomia melhora o ambiente mecânico anorm...
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (No.82074523,82104996).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Acupotomy | Beijing Zhuoyue Huayou Medical Devices Co., Ltd. | 0,4 x 40 milímetros | |
| conectam a fita ortopédica Suzhou da carcaça do molde | conectam a tecnologia médica Co., Ltd. | KCP06 | 15,0 cm x 360 cm |
| Fita de espuma dupla face | Deli Group Co.,Ltd. | NO.30416 | 36 milímetros x 5 jardas x 2,5 milímetros |
| solução de desparafinação ambiental | Tecnologia Co. de Wuhan Servicebio, Ltd. | G1128 | |
| Etanol absoluto | Pequim Hengkangda Medicine Co., Ltd. | ||
| Fornecedor | - Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | G1031 | |
| Fast grenn FCF | Sigma, America | 2353-45-9 | |
| Máquina de teste de fadiga | BOSE, America | Bose Electro Force 3300 | |
| Instrumento fisiológico de quatro canais | Chengdu Instrumeny Frctory | RM-6420 | |
| FPD-305E | Fuji, Japão | ||
| FPD-306E | Fuji, Japão | ||
| Solução de hematoxilina | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | G1005 | |
| Desinfetante de iodóforo médico | Shan Dong Lircon Medical Technology Co., Ltd. | ||
| Fita médica | Shandong Rongjian Sanitary Products Co., Ltd. | 200402 | de 1,5 x 500 cm |
| Chengdu Instrumeny Frctory | JH-2204005, 50 g | ||
| Prescale | Fuji, Japão | ||
| Instrumento de diagnóstico por ultrassom SWE em tempo real | SuperSonic Imagine SA, França | SuperSonic Imagine AixPlorer | |
| Rhamsan gum | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | ||
| Safranine O | Sigma, América | 477-73-6 | |
| Safranine O solução | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | G1015 | |
| Pacote Estatístico para as Ciências Sociais (SPSS) | IBM, América |
Referências
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Reimpressões e permissões
