Artigo de método

Rastreamento de lipídios de novo usando marcação de isótopos estáveis LC-TIMS-TOF MS/MS

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DOI:

10.3791/65590

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23 de agosto de 2024

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1Deparment of Chemistry and Biochemistry, Florida International University, 2Bruker Daltonics Inc., 3Institute of Parasitology, Biology Centre CAS, 4Department of Biological Sciences, Florida International University, 5Department of Parasitology, University of South Bohemia, 6Biomolecular Sciences Institute, Florida International University

Neste artigo

Resumo

Aqui é apresentado um método para triagem de estruturas lipídicas por meio da marcação de isótopos estáveis, usando seu tempo de retenção, mobilidade e fragmentação.

Resumo

Os lipídios são altamente diversos e pequenas mudanças nas estruturas e composição lipídicas podem ter efeitos profundos nas funções biológicas críticas. A marcação de isótopos estáveis (SIL) oferece várias vantagens para o estudo da distribuição, mobilização e metabolismo de lipídios, bem como para a síntese lipídica de novo . A implementação bem-sucedida da técnica SIL requer a remoção de interferências de moléculas endógenas. No presente trabalho, descrevemos um protocolo analítico de alto rendimento para a triagem de lipídios SIL de amostras biológicas; Serão mostrados exemplos de identificação de lipídios de novo durante o desenvolvimento do ovário do mosquito. O uso de cromatografia líquida complementar, espectrometria de mobilidade de íons aprisionados e espectrometria de massa permite a separação e atribuição de lipídios de uma única amostra em uma única varredura (<1 h). A abordagem descrita aproveita os desenvolvimentos recentes na aquisição dependente de dados e aquisição independente de dados, usando acumulação paralela na armadilha de mobilidade seguida de fragmentação sequencial e dissociação induzida por colisão. A medição do SIL no nível da cadeia de ácidos graxos revela mudanças na dinâmica lipídica durante o desenvolvimento do ovário dos mosquitos. As estruturas lipídicas de novo são atribuídas com confiança com base em seu tempo de retenção, mobilidade e padrão de fragmentação.

Introdução

Ao analisar dados lipídicos, a marcação de isótopos estáveis (SIL) é um método eficaz para avaliar as vias metabólicas em organismos vivos. Neste método, os átomos dentro de um analito são substituídos por isótopos estáveis contendo 13C ou 2H. Esses isótopos são posteriormente incorporados aos precursores, que são posteriormente incorporados aos ácidos graxos, rotulando as áreas em que residem. Com esses isótopos, é possível identificar a distribuição e o metabolismo dos lipídios, pois eles contrastarão com o fundo não rotulado1. As plataformas comuns de espectrometria de massa não são capazes de distinguir o sinal proveniente de moléculas endógenas2. O sucesso do SIL requer o uso de ferramentas analíticas de ultra-alta resolução. A cromatografia líquida acoplada à espectrometria de mobilidade iônica aprisionada de alta resolução - espectrometria de massa sequencial de fragmentação sequencial de acumulação sequencial - tempo de voo (LC-TIMS-PASEF-TOF-MS / MS) permite a separação de espécies marcadas e não marcadas2. A vantagem da análise LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS é que o sinal MS pode ser filtrado pelo tempo de retenção (RT) e mobilidade, reduzindo assim potenciais interferências de moléculas endógenas, bem como quantificação e separação de todas as espécies desejadas2. No TIMS, um íon é primeiro mantido estacionário contra uma fase gás-móvel e posteriormente liberado de acordo com sua mobilidade. Isso fornece alta resolução Mobilogramas são gráficos de massa a carregar versus tempo de deriva que podem ser usados para distinguir entre compostos com base em seu tempo de deriva e quantidade de sobreposição4.

Usando uma técnica PASEF adicional, a velocidade de sequenciamento é bastante aumentada sem sacrificar a sensibilidade5. A teoria PASEF envolve o acúmulo de íons seguido por sua liberação sequencial na ordem de sua mobilidade. Isso é feito acumulando íons em alinhamento paralelo à sua mobilidade. O acúmulo dessa maneira evita a perda de íons. Além disso, a seleção do íon precursor ocorre simultaneamente com o acúmulo e a liberação dos íons. Com este método, o PASEF seleciona vários precursores em série durante cada varredura TIMS, em vez dos precursores individuais por varredura típicos de um instrumento TIMS que não usa PASEF. Quando os íons precursores são acumulados e liberados simultaneamente em picos de 2 ms em uma varredura TIMS de aproximadamente 100 ms por quadro, o sinal é amplificado em mais de uma ordem de magnitude, aumentando assim a relação sinal-ruído3. A adição do PASEF ao TIMS aumenta a eficiência do MS/MS. Como o TIMS-PASEF é acoplado ao MS/MS, é possível uma fragmentação mais eficiente. Ao contrário da detecção convencional de MS/MS, o sinal precursor é comprimido a partir do TIMS-PASEF e os íons fragmentos são detectados simultaneamente ao tempo de eluição do TIMS e à posição de mobilidade iônica do precursor3.

Ao adquirir dados de um espectrômetro de massa, existem opções no modo de varredura desejado. A aquisição dependente de dados (DDA) seleciona íons precursores da varredura MS1 com base em suas abundâncias, antes de fragmentá-los e realizar a varredura MS2. Este modo de varredura fragmenta o maior número possível de precursores. A abordagem DDA é direcionada e os resultados dependerão da seleção de íons3. No entanto, o DDA-PASEF frequentemente apresenta problemas na reprodutibilidade entre as repetições. Embora a DDA seja uma ótima ferramenta em uma análise focada, misturas complexas têm maior dificuldade em sua aquisição de dados6. Isso ocorre porque apenas uma pequena quantidade de íons pode ser monitorada simultaneamente3. A aquisição independente de dados (DIA) é um método em que as janelas pré-selecionadas de m/z são fragmentadas independentemente de sua intensidade e todas são verificadas dentro do intervalo7. Com este modo de varredura, nuvens de íons inteiras são transmitidas do IMS para o espectrômetro de massa3. Em estudos proteômicos, isso resulta em maiores quantidades de proteínas sendo quantificadas em um período de tempo mais curto em comparação com o DDA. Além disso, o DIA perde menos valores de m/z em comparação com o DDA. Portanto, esta alternativa mostrou grandes melhorias na reprodutibilidade dos dados na relação sinal-ruído e melhor quantificação do que o DDA. No presente trabalho, nosso objetivo é implementar a DIA ao método relatado por Tose et al.2. Melhoramos a reprodutibilidade e a intensidade dos sinais, produzindo informações adicionais e mais conclusivas sobre a mobilização, distribuição e metabolismo de lipídios SIL em amostras biológicas aproveitando a aquisição de DDA e DIA.

Protocolo

1. Preparação da amostra

  1. Dissecção de insetos
    1. Dissecar os ovários do mosquito Aedes aegypti aos 7 dias de idade em solução salina tamponada com fosfato usando microagulhas.
    2. Colete oito ovários da solução salina tamponada com fosfato usando microagulhas e armazene em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL a -80 ° C.
    3. Colete ovários em réplicas biológicas.
  2. Extração de lipídios
    1. Adicione 10 μL de padrão interno (ISTD) nos oito ovários coletados na concentração de 1 ppm. O ISTD é uma mistura lipídica marcada com sete deutério de 1-pentadecanoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina-D7 (15:0-18:1 (D7) PC), lisofosfatidilcolina-D7 (18:1 (D7) Lyso PC), 1-pentadecanoil-2-octadecenoil-glicero-3-fosfoetanolamina-D7 (15:0-18:1 (D7) PE), 1-oleoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-D7 (18:1 (D7) Lyso PE), 1-pentadecanoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoinositol-D7 (15:0-18:1 (D7) PI), 1-pentadecanoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina-D7 ( 15:0-18:1 (D7) PS), 1,2-dipentadecanoil-3-octadecenoil-sn-glicerol (15:0-18:1-15:0 (D7) TAG), 1-pentadecanoil-2-octadeceoil)-sn-glicerol-D7 (15:0-18:1 (D7) DAG), 2-octadeceoil-sn-glicerol-D7 (18:1 MAG (D7)), oleato de colesterol-D7 (18:1 (D7) Chol Ester).
    2. Espere até secar à temperatura ambiente. Adicione 100 μL de butanol/metanol e 3 μL de hidroxitolueno butilado. Homogeneizar manualmente por 10 s com pilões de polipropileno de 1,5 mL.
    3. Lave o pilão com 200 μL de butanol/metanol e misture com a solução homogeneizada.
    4. Sonicar o tubo de microcentrífuga à temperatura ambiente e potência média durante 30 min.
    5. Tubos de centrífuga a 1600 x g por 10 min a 20 °C. Transfira o sobrenadante para o frasco do amostrador automático com 300 μL de inserções de vidro silanizado.

2. Configuração do instrumento

  1. Preparando a fase móvel
    1. Prepare a fase móvel com uma composição de 30:40:30 (fase móvel A) e 10:5:85 (fase móvel B) usando acetonitrila, água e isopropanol como respectiva proporção. Em ambas as fases móveis, adicione 10 mmol / L de formiato de amônio em água e 0,1% de ácido fórmico para criar uma condição tampão.
    2. Pesar 3,15 g de formiato de amónio em 10 ml de água. Adicione 500 μL desta solução em 12,5 mL de água. Em seguida, colocar num balão volumétrico de 250 ml e encher com isopropanol até cerca de 2/3 do balão. Misture girando.
    3. Adicione 250 μL de ácido fórmico (85%), encha com 25 mL de acetonitrila e isopropanol à linha de enchimento de 250 mL e misture.
  2. No sistema MS, no lado esquerdo da tela nas configurações do MS, determine a faixa de massa selecionando 50 como o mínimo e 1850 como a configuração de varredura máxima.
    1. Selecione Polaridade como modo de íon positivo. Selecione o modo de varredura como DIA-PASEF. Para fazer isso, selecione Ajustar e abrir o método de análise de um método DDA anterior com os seguintes parâmetros LC.
      1. Para separação de gradiente:
        Injeção de amostra: 0% B, tempo de espera 1 min.
        Aumente para 55% B, segure até 6,4 min.
        Aumente para 65% B, segure até 24 min.
        Aumente para 88% B, mantenha firme até 40,8 min.
        Aumente para 95% B, segure até 48,1 min.
        Diminua para 35% B, mantenha até 56 min.
        Diminua para 0% B, mantenha firme até 60 min.
      2. Para condições de HPLC:
        Volume de injeção: 5 μL
        Taxa de solvente: 0,25 mL / min
        Tempo total de execução: 60 min, em que 5 min são para pré-condicionar a coluna.
      3. Preparar o cromatógrafo líquido inserindo a coluna no cromatógrafo líquido. Execute um espaço em branco para limpar a coluna e testar se há vazamentos. Isso pode ser visto no instrumento que não mantém pressão ou fluxo.
  3. Para criar um novo método, execute as etapas descritas abaixo (Figura 1 e Figura 2).
    1. Abra o software e clique em Conectar todos os instrumentos. Se a conexão for bem-sucedida, o sistema LC emitirá um bipe e a tela de controle listará HyStar na caixa Status sem nenhuma mensagem de erro.
    2. Clique na guia Aquisição . No Navegador de Tabela de Exemplo, localize o menu suspenso de tags e selecione um método anterior.
    3. Duplique a tabela de amostra mais recente. Clique em Salvar como... e salve a nova lista de amostras com o formato: YYYYMMDD_LIP_C30_(XXXX) onde (XXXX) é um descritor curto da análise.
    4. Clique com o botão direito do mouse no método de separação e clique em Editar método. Clique em Editar método do módulo.
    5. Clique em Download. Se for bem-sucedido, o download bem-sucedido aparecerá. Feche a tela sem salvar o método.
    6. Em Configurações de MS, vá para Configurações de TIMS, selecione o início de 1/k0 em 0,70 e o final de 1/k0 em 1,85. Defina o tempo de rampa para 150 ms. Com isso, o ciclo de trabalho e a taxa de rampa são ajustados automaticamente.
    7. Na janela inferior, selecione a guia Origem . Selecione o tipo de fonte como ESI e defina o deslocamento da placa final para 800 V e o capilar para 4500 V. Verifique a caixa do nebulizador e ajuste a pressão para 4.0 bar. Ajuste o gás seco para 4.0 L/min e a temperatura seca para 250 °C.
    8. À direita da guia de origem, selecione a guia Tune. Clique na guia Sub Geral e, sob o título de transferência, verifique os seguintes parâmetros:
      Deflexão 1 delta: 70 V
      Funil 1 RF: 250 vpp
      isCID energia: 0 eV
      Funil 2 RF: 250 vpp
      RF multipolar: 500 vpp.
      1. Sob o cabeçalho da célula de colisão, verifique os seguintes parâmetros:
        Energia de colisão: 6,0 eV
        Colisão RF: 1200 vpp.
      2. Sob o título quadrupolo, certifique-se dos seguintes parâmetros:
        Energia iônica: 6 eV
        Baixa massa: 250 m/z.
      3. Na guia pré-TOF de foco, certifique-se dos seguintes parâmetros:
        Tempo de transferência: 45 μs
        Armazenamento pré-pulso: 5,0 μs.
    9. Clique na guia Subprocessamento de Processamento . Sob detecção de pico de espectro de massa, certifique-se dos seguintes parâmetros:
      Limiar absoluto: 667
      Limiar absoluto (por 100 ms AccuTime): 445.
      1. Sob detecção de pico de mobilidade, certifique-se dos seguintes parâmetros:
        Limiar absoluto: 30,00.
    10. Clique na subguia TIMS . Na guia deslocamentos, garanta os seguintes parâmetros:
      Δt1: -20 V
      Δt2: -150 V
      Δt3: 70 V
      Δt4: 150 V
      Δt5: 0 V
      Δt6: 150 V
      Célula de colisão: 300 V.
    11. À direita da guia de ajuste, clique na guia MS/MS . Na guia de íons precursores, certifique-se dos seguintes parâmetros:
      Número de rampas PASEF: 8
      Carga mínima: 1
      Carga máxima:1.
      1. Na guia de agendamento, clique em Avançado e verifique os seguintes parâmetros:
        Intensidades: 0,1500, 5000, 10000
        Repetição: 1, 10, 5, 1
        Limiar de intensidade: 1500.
      2. Na guia de exclusão ativa, verifique os seguintes parâmetros:
        Marca de seleção de exclusão ativa
        Solte após: 0,4 min.
      3. Nas configurações de energia de colisão, garanta os seguintes parâmetros:
        K0 (V-s/cm3): 0,70, 1,60
        Energia de colisão (eV): 20,00, 35,00.
      4. Nas configurações de largura de isolamento, verifique os seguintes parâmetros:
        Massa (m/z): 622, 1222
        Largura (m/z): 1,00 2,50.
    12. Configuração do DIA-PASEF: Selecione DIA-PASEF no modo de varredura de configurações do MS à esquerda. Na guia MS/MS, selecione Editor de janelas. Aqui, assegure-se dos seguintes parâmetros (Figura 3):
      Configurações da janela: Largura da massa: 50 Da; Sobreposição de massa: 0,0 Da; Calcular a partir do polígono: passos de massa; Número de janelas de mobilidade: 1.

3. Calibração

  1. Calibração do instrumento (Figura 4)
    1. Na subguia Calibração , clique em m/z, selecione Tuning Mix na caixa suspensa e clique em Calibrar no canto inferior direito.
    2. Continue clicando em Calibrar até que uma pontuação de 100% seja alcançada.
    3. Agora selecione a guia Mobilidade e siga as mesmas etapas acima até que a pontuação de calibração de 100% seja atingida.
  2. Curva de calibração
    1. Mistura de padrão interno de espiga lipídica com 10 μL de mistura de padrão interno deuterado.
      Use sete pontos de calibração de 0,1-500 ng/mL de mistura padrão com 10 μL da mistura de padrão interno deuterado.
    2. Anote manualmente as cadeias de ácidos graxos com base nos padrões PASEF MS / MS já descritos em2.
  3. Eficiência de rotulagem SIL
    1. Calcule a razão entre a área do SIL contendo isótopos e a área do isótopo não SIL
    2. Calcule o padrão teórico determinando a probabilidade de encontrar um átomo rotulado em qualquer local.
    3. Calcule o enriquecimento de SIL ajustando os perfis de isótopos experimentais com o padrão teórico simulado no software de análise de dados.
  4. Iniciando a corrida
    1. Ative o forno de coluna clicando no botão Termômetro . Ative as bombas clicando no botão Válvula .
    2. Defina o método MS para o método salvo anteriormente. Verifique se o volume de injeção é de 5 μL e se a linha 1 terá como alvo o frasco 20:1.
    3. Certifique-se de que o frasco 20:1 tem 50% de IPA/ACN. Salve a lista de amostras.
    4. Inicie a sequência e verifique se uma injeção bem-sucedida foi feita (confirmada por uma mensagem exibida no sistema informando injetado).
    5. Copie a linha 1 e cole abaixo para gerar uma nova linha. Preencha a linha 2 com amostras, dependendo do experimento atual. Certifique-se de que a posição correta no amostrador automático seja usada.
    6. Se a fase móvel for recente, realize primeiro o teste de forma de pico injetando os padrões de mistura lipídica do fabricante. Compare com resultados anteriores. 2 Os padrões são uma mistura lipídica de 1-pentadecanoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolalina (15:0-18:1 PC), lisofosfatidilcolina (18:1 Lyso PC), 1-pentadecanoil-2-octadecenoil-glicero-3-fosfoetanolamina (15:0-18:1 PE), 1-oleoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (18:1 Lyso PE), 1-pentadecanoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoinositol (15:0-18:1 PI), 1-pentadecanoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina (15:0-18:1 PS), 1,2- dipentadecanoil-3-octadecenoil-sn-glicerol (15:0-18:1-15:0 TAG), 1-pentadecanoil-2-octadecenoil)-sn-glicerol (15:0-18:1 DAG), 2-octadeceoil-sn-glicerol (18:1 MAG), oleato de colesterol (18:1 Chol Ester).
    7. Certifique-se de que as novas linhas tenham o método de separação correto e não o método de pré-condicionamento usado na linha 1. Certifique-se de que o método MS esteja correto (método do dia atual).
    8. Verifique se o método de processamento correto está carregado e se a opção Executar Processo Automatizado está ativada.
    9. Salve a lista de amostras para garantir que as amostras sejam analisadas após o término da execução atual.

4. Análise dos dados

  1. Software de análise de dados abertos (Figura 5). No canto superior esquerdo, clique no botão Arquivo e selecione Abrir...
  2. Selecione os arquivos de sua escolha. Clique com o botão direito do mouse no nome do arquivo e selecione Propriedades.
    1. Selecione Status de calibração (Figura 6). Na caixa suspensa, selecione Calibração inicial para o espectrômetro de massa. Certifique-se de que todos os erros sejam inferiores a 1 ppm.
    2. Em seguida, selecione Calibração de mobilidade inicial e confirme se o erro é inferior a 1 ppm.
    3. Clique com o botão direito do mouse em Cromatograma e selecione Editar Cromatograma (Figura 6C). Em Tipo, clique na caixa suspensa e selecione Extraído Em filtro, selecione Todos os MS e, com o modo de verificação, selecione Todos. Isso é para ver os picos da molécula de interesse, em vez de apenas seus fragmentos.
      1. Abaixo disso, existem duas opções de filtro para seleção de moléculas: Massas ou Fórmula. Se Massas for selecionado, pode-se escolher o m/z teórico das moléculas de interesse. Para este caso, selecione 829,7985 m/z. Se Fórmula for selecionada, pode-se escolher a fórmula para a molécula, bem como as formas iônicas de interesse para o cromatograma. Neste caso, selecione amônio [M+NH4]. Isso se deve ao tampão de amônio na fase móvel que favorecerá a ionização nessa forma de íon (Figura 7).
      2. Para largura, selecione ±1. Para polaridade, certifique-se de manter o modo positivo. Em Mobilidade , selecione 1,455-1,465. Isso é feito para filtrar quaisquer moléculas que não se enquadrem nesses valores e isolar a molécula de interesse.
  3. Depois que os parâmetros forem selecionados, clique em Adicionar > OK no canto superior direito. Após um curto período de tempo, o software processará as seleções e produzirá um cromatograma.
  4. Clique com o botão direito do mouse na linha de base no início do pico de interesse e arraste enquanto segura até o final do pico. Essa integração manual fornecerá um espectro de massa ao vivo de fragmentos dentro desse tempo de retenção.
  5. Mobilograma
    1. Clique com o botão direito do mouse à esquerda da tela em Mobilograma e selecione Editar Mobilograma (Figura 8). Uma janela chamada Editar Traços de Mobilograma aparecerá. Siga os mesmos passos C.e.i.1 a C.e.i.5 (Figura 9).
    2. Em Tempo de retenção , insira o tempo de retenção do pico de interesse. Neste caso, 37,45-37,55 min.
    3. Depois que os parâmetros forem selecionados, clique em Adicionar > OK no canto superior direito. Após um curto período de tempo, o software processará as seleções e produzirá um cromatograma.
  6. Para íons extraídos, repita as etapas 4.2.3.1-4.3.2.2 até formar uma lista de íons.
  7. Na parte inferior da janela MS, selecione Profile MS e Fragment MS. Isso permitirá uma visão do espectro de íons da varredura completa e PASEF.
    1. Na visualização do espectro, clique com o botão direito do mouse e selecione Copiar espectros compostos. Com os dados do espectro que aparecem à direita, pode-se encontrar mais informações sobre o composto, como resolução, poder de resolução, intensidade e relação sinal-ruído (S/N; Figura 10).
  8. Processamento
    1. Para processar os dados, integre manualmente o cromatograma e os picos de mobilidade para fornecer informações valiosas sobre a molécula de interesse (Figura 10).
    2. Clique com o botão direito do mouse em Localizar e selecione Integrar somente cromatograma ou mobilograma (Figura 11). Clique com o botão esquerdo e destaque o pico desejado. Essas informações incluem tempo de retenção, área, S/R e mobilidade.

Resultados

A marcação de isótopos estáveis facilita a visualização de triglicerídeos em estudos de dinâmica lipídica de ovários de mosquitos fêmeas. No domínio da mobilidade 2D, o triglicerídeo 48:1 é exibido em uma região com um tempo de retenção específico em relação à mobilidade 1/K0. A intensidade do triglicerídeo pode ser visualizada por uma linha azul mais escura. Outras manchas representam triglicerídeos adicionais encontrados no ovário. Os tempos de retenção e mobilidades variam devido às diferenças de massas e estruturas, aparecendo em diferentes áreas do gráfico. Essas diferenças são fundamentais para distinguir entre triglicerídeos em uma amostra (Figura 12A, B). A projeção do espectro de massa amplificada da região exibe um íon triglicerídeo 48:1 acoplado a um íon amônio a 822 m/z. Outros triglicerídeos, como 50:2 e 52:3, também são visualizados, mas em regiões m/z mais altas devido às diferenças de estrutura, tamanho e fragmentação (Figura 12C,D). Neste exemplo, estávamos interessados em analisar os isótopos marcados com deutério. A região para TG 48: 1 foi ampliada para visualizar os íons marcados isotopicamente. À medida que a quantidade de deutério no íon aumenta, a intensidade do pico diminui. Isso acontece porque há ocorrências mais baixas dos íons marcados com alto deutério. A relação m/z aumenta ligeiramente a cada adição de deutério devido ao aumento da massa. Essas intensidades determinarão ainda mais a quantidade de cada isótopo presente na amostra.

Ao avaliar as intensidades dos fragmentos no espectro de massas, deve-se comparar os isótopos não marcados com aqueles marcados com 2H (Figura 12E). Em azul está a intensidade não rotulada com as linhas pretas tracejadas como intensidades teóricas. Em vermelho, os resultados marcados com isótopos são observados. Eles exibem intensidades maiores do que as intensidades não rotuladas e teóricas. O enriquecimento das espécies com marcação isotópica produz uma intensidade maior do que as espécies teóricas não marcadas. As maiores intensidades permitem visualizar os triglicerídeos devido às discrepâncias distritais. A fragmentação também desempenha um papel fundamental na identificação de lipídios, pois o PASEF proporcionará maior fragmentação em comparação com o MS/MS de varredura completa. Isso ocorre porque os ácidos graxos nas cadeias lipídicas podem se fragmentar em diferentes padrões, portanto, as linhas nos espectros mostram a intensidade dos fragmentos com base no processo de fragmentação do triglicerídeo (Figura 12F). Isso fornece informações estruturais sobre o ácido graxo e ajuda a estabelecer qual isômero de uma espécie está presente. Ao analisar os dados do método DIA, o número de fragmentos aumentará, resultando em uma melhor varredura de MS/MS e identificação superior do que em um método DDA típico.

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Figura 1: Tela inicial típica do software. A tela inicial permite a criação do método e a inicialização do instrumento. (A) Tela do software contendo as configurações de controle TIMS e MS/MS. Na parte inferior da tela está a guia de origem para editar esses controles no instrumento. (B) Tela do software com a guia de melodia aberta. (C) Aqui, pode-se preparar o instrumento para a melodia geral. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Tela do software com a guia de sintonia aberta. Aqui pode-se editar os parâmetros de ajuste de processamento. (A) Tela do software com a guia de sintonia aberta. Aqui pode-se editar os parâmetros de melodia para a parte TIMS do instrumento. (B) Tela do software com a guia MS/MS selecionada na parte inferior da tela. (C) Aqui pode-se editar parâmetros para o espectrômetro de massa em tandem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Tela para selecionar larguras de janela DIA-PASEF. Aqui pode-se editar as cores para abundância, bem como editar o tamanho das janelas para aquisição de dados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Calibração do espectrômetro de massa por relação massa/carga (m/z). A lista de referências é selecionada para a calibração. (A) No canto inferior direito, o botão Calibrar é clicado até que um valor aceitável apareça. Calibração do espectrômetro de mobilidade iônica por mobilidade. A lista de referências é selecionada para a calibração. (B) No canto inferior direito, o botão Calibrar é clicado até que um valor aceitável apareça. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Tela inicial típica do software de análise de dados. Para abrir um arquivo, o botão Arquivo superior esquerdo é clicado para que a caixa suspensa com opções apareça. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 6: Software de análise de dados. A tela do software confirma uma calibração bem-sucedida com (A) como selecionar os resultados da calibração e (B) selecionar a categoria de calibração. (C) Seleção de um cromatograma para análise e (D) seleção de um cromatograma de íons extraído. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 7: Tela pop-up. Pop-up para selecionar e extrair o cromatograma de íons por (A) filtro de massa e (B) filtro de fórmula. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 8: Software de análise de dados. A tela do software onde, à esquerda, um mobilograma é selecionado para análise. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 9: Tela pop-up para mobilograma. Pop-up para selecionar um mobilograma de íons extraído por (A) filtro de massa e (B) filtro de fórmula. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 10: Tela de análise de dados. (A) A tela do software; destacado à esquerda, pode-se formar uma lista de íons extraída. (B) Tela de análise de dados onde na parte inferior é preparado um espectro composto dos íons extraídos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 11: Tela de análise de dados. A tela do software demonstrando os resultados de uma integração manual de espectros compostos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 12: Resultado do LC-TIMS MS. (A) O LC-TIMS MS 4 dias após a alimentação com dieta de sacarose marcada com 2H e os ovários do inseto podem ser vistos no domínio da mobilidade 2D. (B) Projeções típicas de MS para o sinal correspondente a TG 48:1, TG 50:2 e TG 52:3 a partir de amostra marcada. (C) Região MS amplificada 822 - 827 m / z denotando perfil de TGs rotulado. (D) Preste atenção especial aos picos de MS em vermelho são amplificados o perfil isotópico. (E-F) O perfil de isótopos marcados com 2H é destacado a vermelho; abaixo do perfil de isótopos não marcados são destacados em azul. Os perfis teóricos de isótopos são indicados como linhas tracejadas (13C em preto; algarismoH em verde). Uma estrutura potencial para triglicerídeos 48:3 também é exibida no canto superior direito. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Ao avaliar o uso deste protocolo, é essencial garantir que os parâmetros DIA-PASEF e MS/MS sejam aplicáveis aos triglicerídeos em questão. Especificamente, as janelas de mobilidade e a largura da janela devem seguir o padrão dos triglicerídeos. Isso pode ser determinado com uma execução anterior usando o método DDA. Ao rastrear os triglicerídeos no padrão interno, as janelas para a configuração do DIA devem cobrir todas as moléculas de interesse pré-identificadas. As janelas devem ser todas de tamanhos iguais e os intervalos estão dentro de m / z e 1 / k0 dos compostos desejados (Figura 7). Com um dimensionamento incorreto das janelas, os íons a serem fragmentados serão ignorados e os espectros de rendimento terão menor reprodutibilidade. Essencialmente, sem a otimização adequada de um intervalo de janela em lipidômica, os resultados do DIA não melhorarão os dados de DDA. As janelas devem representar uma forma passo a passo para o processo de aquisição de dados. Se não for esse o caso, os parâmetros da janela DIA-PASEF configurada devem ser alterados para serem representativos do perfil lipídico completo. Sem esta etapa, os ácidos graxos críticos serão omitidos dos dados adquiridos.

As limitações instrumentais incluem principalmente aquelas que vêm com os métodos LC-MS. Isso inclui limitações de multiplexação na largura de pico. Portanto, deve haver uma otimização na eluição de pico para uma quantificação adequada, promovendo seletividade durante a aquisição dos dados. Normalmente, isso ocorre com precursores selecionados, como com DDA. No entanto, com a DIA, nenhum precursor é selecionado, arriscando, portanto, limitações na seletividade instrumental8. Embora os métodos DIA forneçam maior fragmentação, ainda existem limitações presentes. A limitação mais proeminente é a redução na seletividade do precursor. As janelas para um método DIA são 5 a 10 vezes mais largas do que um método DDA típico. Consequentemente, ao mesmo tempo em que permite uma maior fragmentação, pode reduzir o ciclo de trabalho e a aquisição em série. Isso pode ser observado em espectrômetros de massa que usam um quadrupolo escalonado. Como não há seleção de precursores e quais íons devem ser fragmentados, as janelas de isolamento estático são alternadas sequencialmente para cobrir a janela m / z. Como a janela é muito maior do que um método típico de DDA, deve-se usar faixas mais amplas para tentar ganhar sensibilidade9. O problema na aquisição em série, portanto, reduz a sensibilidade. Uma segunda limitação envolve a geração de bibliotecas. É demorado e requer grandes quantidades de amostras para formular. Embora bibliotecas externas possam ser usadas, os padrões de fragmentação podem diferir entre as condições experimentais e a instrumentação10.

Ao analisar os dados lipídicos usando a marcação isotópica estável, é necessário minimizar a interferência de outras moléculas encontradas no organismo. Isso é feito usando ferramentas de análise de alta resolução, como o LC-TIMS-TOF-MS/MS2. Atualmente, o uso dessas ferramentas de alta resolução para separar os isótopos marcados do ruído de fundo ainda é muito novo em comparação com os métodos tradicionais. As considerações instrumentais tradicionais implementam a separação por cromatografia gasosa seguida de ionização química ou eletrônica. Isso permite a derivação química com brometo de pentafluorobenzila ou a fragmentação da ionização de elétrons. É mais recentemente onde LC-MS é empregado em estudos isotópicos. O uso de espectrômetros de massa de alta resolução permite alta precisão de massa e a capacidade de conduzir vários traçadores estudados usando vários rótulos isotópicos em vez de um único isótopo. Sem a alta resolução do instrumento, seria impossível diferenciar entre diferentes graus de rotulagem, como 13C2 e 13C. Isso permite aumentar as informações de uma única execução em comparação com a instrumentação tradicional com resolução mais baixa10.

Embora o DIA tenha melhor reprodutibilidade do que o DDA, outros métodos emergentes de aquisição de dados podem ser comparados. As estratégias híbridas de DIA-DDA, como o p-SMART, são capazes de combinar os pontos fortes de cada método para manter uma ótima detecção e quantificação, mantendo o alto nível de análises qualitativas direcionadas. Nesse método, o uso de um íon de produto correspondente pode aumentar a sensibilidade e a seletividade do DIA, pois estreitará as janelas do DIA em comparação com uma abordagem ampla não direcionada8. Em lipidômica, a estrutura de um triglicerídeo pode variar com a estrutura isomérica. O PASEF permite a visualização de vários padrões de fragmentação, melhorando a identificação das espécies2. Com o uso do DIA-PASEF, o aumento da fragmentação fornece informações sobre isômeros, tantos fragmentos de forma semelhante a outros, que normalmente não podem ser resolvidos devido às limitações do método DDA. Essas informações fornecem evidências sobre quais ácidos graxos estão presentes nos ovários do mosquito. Este método pode ser aplicado a outros estudos de lipídios de novo em diversos organismos.

Divulgações

Matthew Willetts e Melvin A. Park são funcionários da Bruker Daltonics Inc, fabricante do instrumento comercial timsTOF. Os autores declaram não haver interesse financeiro conflitante.

Agradecimentos

Os autores gostam de reconhecer as contribuições do Dr. Cesar Ramirez durante o desenvolvimento inicial do método. Esta pesquisa foi financiada pelas bolsas NIAID R21AI167849 para FGN, projeto 22-21244S da Czech Science Foundation, República Tcheca para MN.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Accucore C30 columThermo Fisher Scientific27826-252130
Bruker Compass Análise de DadosBruker Daltonics Inc2363525870Versão 5.2
d-Glucose-13C6Sigma-Aldrich 
tubos eppendorfFisher Scientific14-282-300
EquiSplash LipidomixAvanti Polar Lipids330731-1EA
frascos de vidroThermo Fisher Scientific11-417-236
água pesada (2H2O)Sigma-Aldrich 1.13366
pilões de polipropilenoFisher ScientificBAF199230001
Prominence LC-20 CE ultrarrápido cromatógrafoShimadzuL20234651907
inserções de vidro silanizadoThermo Fisher Scientific03-251-826
Sucrose-13C12Sigma-Aldrich 
timsTOFBruker Daltonics Inc1.84443E+11
Padrão de Calibração de Mistura de AfinaçãoAgilent Technologies36
389374 líquido 605417

Referências

  1. Stokvis, E., Rosing, H., Beijnen, J. H. Stable isotopically labeled internal standards in quantitative bioanalysis using liquid chromatography/mass spectrometry: Necessity or not. Rapid Commun Mass Spectrom. 19 (3), 401-407 (2005).
  2. Tose, L. V., et al. Coupling stable isotope labeling and liquid chromatography-trapped ion mobility spectrometry-time-of-flight-tandem mass spectrometry for de novo mosquito ovarian lipid studies. Anal Chem. 94 (16), 6139-6145 (2022).
  3. Meier, F., Park, M. A., Mann, M. Trapped ion mobility spectrometry and parallel accumulation-serial fragmentation in proteomics. Mol Cell Proteomics. 20, 100138(2021).
  4. Basit, A., Pontis, S., Piomelli, D., Armirotti, A. Ion mobility mass spectrometry enhances low-abundance species detection in untargeted lipidomics. Metabolomics. 12 (3), 50(2016).
  5. Meier, F., et al. Online parallel accumulation-serial fragmentation (PASEF) with a novel trapped ion mobility mass spectrometer. Mol Cell Proteomics. 17 (12), 2534-2545 (2018).
  6. Koopmans, F., Ho, J. T. C., Smit, A. B., Li, K. W. Comparative analyses of data independent acquisition mass spectrometric approaches: DIA, WiSIM-DIA, and untargeted DIA. Proteomics. 18 (1), 1700304(2018).
  7. Fernández-Costa, C., et al. Impact of the identification strategy on the reproducibility of the DDA and DIA results. J Proteome Res. 19 (8), 3153-3161 (2020).
  8. Prakash, A., et al. Hybrid data acquisition and processing strategies with increased throughput and selectivity: PSMART analysis for global qualitative and quantitative analysis. J Proteome Res. 13 (12), 5415-5430 (2014).
  9. Tsou, C. C., et al. DIA-umpire: Comprehensive computational framework for data-independent acquisition proteomics. Nat Methods. 12 (3), 258-264 (2015).
  10. Triebl, A., Wenk, M. R. Analytical considerations of stable isotope labelling in lipidomics. Biomolecules. 8 (4), 151(2018).

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