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Artigo de método

Produção e Otimização de LTE, um Sistema de Expressão de Proteína Livre de Células Derivadas de Leishmania tarentolae para Produção de Proteína Recombinante

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DOI:

10.3791/65592

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8 de novembro de 2024

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1CSIRO-QUT Synthetic Biology Alliance, Queensland University of Technology, 2ARC Centre of Excellence in Synthetic Biology, Queensland University of Technology, 3Centre for Agriculture and the Bioeconomy, Queensland University of Technology, 4School of Biology and Environmental Science, Queensland University of Technology, 5Centre for Genomics and Personalised Health, Queensland University of Technology

Neste artigo

Resumo

O Extrato Translacional de Leishmania (LTE) é um sistema de expressão de proteínas livres de células eucarióticas derivado do parasita unicelular, Leishmania tarentolae. Esse protocolo otimizado torna o LTE simples e econômico de fabricar. É adequado para várias aplicações focadas na expressão multiparalela e no estudo de proteínas eucarióticas complexas e suas interações.

Resumo

Este protocolo descreve a produção e otimização de um Sistema de Expressão de Proteína Livre de Células (CFPS) eucariótico derivado do flagelado unicelular Leishmania tarentolae, conhecido como Extrato Translacional de Leishmania ou LTE. Embora este organismo tenha evoluído originalmente como um parasita de lagartixas, ele pode ser cultivado de forma fácil e barata em frascos ou biorreatores. Ao contrário da Leishmania major, não é patogênica para os seres humanos e não requer precauções laboratoriais especiais. Outra vantagem de usar Leishmania para CFPS é que a adição de um único oligonucleotídeo antisense à CFPS, visando uma sequência líder de splice conservada na extremidade 5' de todos os RNAs codificadores de proteínas, pode suprimir a expressão de proteínas endógenas. Fornecemos procedimentos para interrupção celular e processamento de lisados, que foram simplificados e aprimorados em comparação com as versões anteriores. Esses procedimentos começam com culturas de frascos simples. Além disso, explicamos como introduzir informações genéticas usando vetores contendo locais de iniciação de tradução independentes da espécie (SITS) e como realizar otimização direta de lote e controle de qualidade para garantir a qualidade consistente da expressão da proteína.

Introdução

Na década de 1960, os sistemas de expressão de proteínas livres de células desempenharam um papel fundamental na descoberta do código genético1. No entanto, os sistemas de expressão de proteínas livres de células procarióticas, principalmente baseados em E. coli, atualmente dominam as aplicações laboratoriais e comerciais. Embora os sistemas baseados em E. coli ofereçam vantagens como custo-benefício, escalabilidade e altos rendimentos de expressão, eles enfrentam desafios ao produzir proteínas de múltiplos domínios em suas formas ativas e facilitar a montagem de complexos proteicos 2,3. Nos dias atuais, as formas comumente usadas de Síntese de Proteína Livre de Células Eucarióticas (CFPS) incluem extrato de gérmen de trigo (WGE), lisado de reticulócitos de coelho (RRL) e lisado de células de insetos (ICL) 4 , 5 , 6 . Este trabalho apresenta um sistema alternativo livre de células eucarióticas que é simples e escalável, baseado no parasita flagelado unicelular Leishmania tarentolae.

Leishmania tarentolae pode ser cultivada facilmente em frascos usando meios econômicos e também pode ser ampliada em biorreatores para atingir maior densidade celular. A presença de mRNAs endógenos no lisado celular, que de outra forma poderiam competir com as mensagens introduzidas, pode ser neutralizada usando oligonucleotídeos antisense direcionadosà sequência 7 do líder de splice de mRNA de Leishmania conservada. Ao contrário de seu parente próximo Leishmania major, que causa doenças humanas, L. tarentolae infecta a lagartixa-mourisca (Tarentolae mauritanica), tornando-a adequada para cultivo em ambientes de laboratório PC2 sem a necessidade de precauções especiais. Já foi usado anteriormente como um organismo transgênico para expressão de proteínas in vivo8.

Para facilitar o priming do molde em sistemas livres de células, sequências universais foram projetadas com base em estruturas poliméricas de RNA que aumentam a iniciação translacional9. Essas sequências de tradução independentes da espécie (SITS) são aplicáveis a sistemas livres de células procarióticas e eucarióticas e são adequadas para introduzir informações genéticas no LTE. Embora este protocolo não forneça uma explicação detalhada da construção do vetor para a expressão de proteínas livres de células LTE, a otimização e o controle de qualidade requerem vetores adequados contendo fusões de fluoróforos das proteínas desejadas de interesse a jusante do local STITS. Para esse fim, vetores LTE apropriados foram depositados no repositório de genes Addgene, como o vetor pCellFree_G03, que codifica uma fusão de eGFP N-terminal para a proteína de interesse desejada usando locais de clonagem Gateway.

O LTE provou seu valor em uma ampla gama de aplicações que requerem expressão de proteínas, incluindo a análise da automontagem de proteínas10,16, produção de proteínas de membrana integral humana17, pesquisa sobre candidatos a medicamentos antivirais18, desenvolvimento de enzimas biotecnologicamente úteis19, prototipagem de biossensores de proteínas20,21 e o estudo de produtos biológicos de ancilostomídeos22. O LTE também tem sido fundamental no mapeamento de redes de interação proteína-proteína nos campos da virologia e estruturas celulares21,32. O LTE foi avaliado para ter um desempenho semelhante a outros sistemas livres de células eucarióticas na expressão de proteínas de comprimento total, monodispersas e não agregadas33, ao mesmo tempo em que oferece uma produção mais econômica e escalável.

Este protocolo fornece técnicas para cultivar e interromper o organismo hospedeiro, preparar lisado e suplementar uma solução de alimentação (FS) para expressão de proteína de transcrição/tradução acoplada. Além disso, inclui um protocolo para otimizar os lotes de produção. Na versão inicial do sistema livre de células de Leishmania, foi observada variação indesejada de lote para lote nos níveis de expressão, na fração de proteínas de comprimento total e na presença de agregados proteicos, levando ao descarte de lotes34. Melhorias subsequentes no protocolo foram feitas para resolver esse problema25. O protocolo atual se baseia nessas melhorias, permitindo que lotes individuais sejam otimizados para pico de expressão e tamanho da proteína. Ele consegue isso controlando de perto a carga do disruptor celular (medida como densidade óptica a 600 nm; OD600nm) e normalizando a saída de lisado resultante usando absorbância a 280 nm (Abs280nm). Além disso, incorpora um método para suplementar parcialmente o lisado com rNTP e magnésio durante a fabricação, com subsequente otimização desses componentes da solução de alimentação durante as expressões de teste. Embora essa otimização seja apresentada como uma opção no protocolo, ela é fortemente recomendada pelos autores.

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Protocolo

Este protocolo inclui receitas de mídia detalhadas e etapas que envolvem cultura, centrifugação, medição da fluorescência GFP usando um leitor de placas multimodo, medição de cultura OD600nm e avaliação de lisado Abs280nm. Também abrange a configuração e a imagem de géis de proteína SDS-PAGE. Os materiais necessários ou sugeridos para este protocolo estão listados na planilha de materiais. É importante observar que os recursos laboratoriais típicos, como componentes de mídia, centrífugas, tubos, espectrofotômetros e configurações de eletroforese em gel, provavelmente podem ser usados de forma intercambiável, a menos que especificado de outra forma. A Figura 1 fornece um resumo do processo de fabricação LTE.

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Figura 1: Visão geral do protocolo de fabricação LTE. Este desenho animado fornece um resumo conciso do protocolo de fabricação LTE. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Crescimento de culturas de Leishmania tarentolae

  1. Prepare pelo menos 3 L de meio de crescimento TBGG (bactotriptona 12 g/L, extrato de levedura 24 g/L, glicerol 8 mL/L, glicose 1 g/L, KH2PO4 2,3 g/L, K2HPO4 2,5 g/L, consulte a Tabela de Materiais). Esterilize a mídia usando um filtro de 0.22 μm sob vácuo ou uma configuração semelhante.
  2. Armazene o meio em temperatura ambiente (TR), com as adições finais (Hemin, antibióticos) adicionadas imediatamente antes da inoculação com L. tarentolae. Hemina (0,25% v / v em 50% de trietanolamina) é adicionada a 0,2% v / v, Penicilina (10.000 unidades / mL) mais estreptomicina (10.000 μg / mL) mistura a 0,5% v / v.
    NOTA: O ponto de partida deste protocolo é uma cultura mantida de 2 x 10 mL de L. tarentolae do tipo selvagem. As culturas de manutenção são cultivadas a 27 °C em frascos padrão de 50 mL de cultura de tecidos com baixa agitação (75 rpm). Essas culturas de 10 mL podem ser mantidas indefinidamente com diluições de ~ 1/20 em estéril (TBGG + hemina, penicilina, estreptomicina) a cada 2-3 dias. Recomenda-se um gabinete de biossegurança padrão em um laboratório PC2; no entanto, as contaminações bacterianas tendem a ser evitadas pelos antibióticos adicionados, enquanto as contaminações fúngicas são geralmente superadas por L. tarentolae.
  3. Ao longo de dois dias, expanda as culturas de manutenção de L. tarentolae para 200 mL (dia 1) e depois 2 L (dia 2) por meio de diluições de 1:10 com um volume crescente de TBGG + hemina / antibióticos a cada dia. Efectuar ambas as diluições em balões de vidro de 5 L defletores esterilizados em autoclave (cheios até um máximo de 1 L). A segunda diluição deve ocorrer no período da tarde, entre 15h e 18h, com a intenção de iniciar a produção de lisado no dia seguinte, entre 8h e 11h.
    NOTA: Este protocolo usa o volume inicial mínimo para produção LTE (culturas de 2 x 1 L). Também é possível expandir a cultura até 10 L para a produção de LTE incorporando uma etapa de expansão adicional (por exemplo, Dia 1: 100 mL; Dia 2: 1 L; Dia 3: 10 L). Embora este protocolo use frascos defletores (ver Tabela de Materiais) para cultivar L. tarentolae, opcionalmente, biorreatores convencionais projetados para crescimento bacteriano com impulsores de Rushton podem ser usados, desde que a taxa de agitação seja mantida abaixo de 100 rpm. A melhor aeração e controle de pH em biorreatores geralmente estendem o crescimento da fase logarítmica das culturas de L. tarentolae , permitindo uma maior OD decolheita de 600 nm de 10 a ser usada na etapa 1.4.
  4. Registar a DIÂMETRO DE600 nm da cultura em triplicado através de uma diluição de 1:10 em TBGG directamente na cubeta do espectrofotómetro. Uma faixa inicial adequada para fazer lisado é OD600nm = 4,0-8,0.
  5. Forneça tempo de incubação adicional se OD600nm < 4.0. Uma cultura com OD600nm > 8 é utilizável e resultará em um maior volume de lisado de expressão livre de células, mas com qualidade inferior devido ao início da fase de crescimento logarítmico tardio. Coloque os frascos de cultura no gelo, aguardando as etapas subsequentes.
    NOTA: A medição precisa do OD decultura final de 600 nm é crítica, pois é usada para calcular o volume final das células concentradas antes da interrupção. Este cálculo substitui um método de pesagem de pellets usado em versões anteriores da fabricação de LTE para calibrar a concentração da célula antes da interrupção34, a fim de simplificar o protocolo. Certifique-se de diluir em TBGG para medição de OD600nm , caso contrário, o choque osmótico altera a forma da célula, causando erro de medição. Pipete misture a diluição 1:10 para medição OD600nm (diretamente na cubeta) segundos antes de fazer a leitura espectrofotométrica, pois as células de L. tarentolae se acomodam rapidamente com uma aparência turva distinta. Se o volume final da cultura de expressão for considerado aproximado, recomenda-se também a pesagem dos frascos na colheita (com tara de balão vazio adequada) para obter um volume melhor estimado (a 1 g = 1 ml). O OD máximo de600 nm possível do crescimento de L. tarentolae em frascos defletores é de 15-20, embora isso seja inadequado para a fabricação de lisado devido ao alcance da fase estacionária.

2. Concentração de culturas de L. tarentolae

  1. As células de Leishmania devem ser lavadas e concentradas aproximadamente 60 vezes antes da interrupção. Calcule o volume alvo para a concentração celular com base em OD600nm = 300 para o concentrado final. A equação é V = volume de colheita (mL) x (DO de colheita600nm/300). Por exemplo, usando uma cultura de 2 L com uma colheita OD600 = 5, o volume alvo é de 33 mL.
    NOTA: O alvo OD600nm de 300 pode ser modificado; a produção anterior de LTE usou valores na faixa de 150-350. Concentrações mais altas de células que entram em ruptura tendem a produzir reações finais de expressão livre de células com maior rendimento de proteínas, mas com uma tendência aumentada de agregação de proteínas vulneráveis. OD600nm = 300 representa um alvo padrão adequado para produção LTE.
  2. Transferir as culturas colhidas para frascos de centrifugação adequados e centrifugá-los a 2500 x g durante 10 min a 4 °C. Decantar cuidadosamente o sobrenadante para os resíduos de cultura.
    NOTA: É importante minimizar a perda de células no sobrenadante descartado, pois isso afeta o cálculo da carga de interrupção. Em protocolos de produção LTE anteriores, a concentração de células de L. tarentolae para ruptura foi calibrada girando o concentrado de células em um tubo de microcentrífuga de teste e medindo o peso do pellet versus o peso total34. Em vez disso, este protocolo simplificado usa uma meta teórica de OD600nm para o concentrado, com base na OD de colheita medida de600nm, e pressupõe baixa perda de células durante a concentração e lavagem das células.
  3. Lave o pellet celular em tampão SEB (45 mM HEPES-KOH pH 7,6, 250 mM de sacarose, 100 mM de KOAc, 3 mM de Mg(OAc)2, mantido em gelo) três vezes, cada vez centrifugando a 2500 x g por 10 min a 4 °C. Para a primeira lavagem, ressuspenda cada 1 L de cultura peletizada em 100 mL de tampão SEB e, em seguida, combine-os em um único frasco de centrífuga. Para a segunda lavagem, use também 100 mL de SEB para cada 1 L da cultura original.
    NOTA: Para a ressuspensão final do pellet, adicione o tampão SEB a 50% do volume final de ressuspensão alvo (etapa 2.1). Isso permite que o concentrado agrupado seja cuidadosamente reabastecido exatamente até o volume alvo final na etapa 2.4. Cada ressuspensão deve ser o mais suave possível para evitar a lise prematura de L. tarentolae, por exemplo, girando suavemente o SEB adicionado ao redor do pellet decantado ou pipetando o SEB sobre o pellet aderido à parede do tubo da centrífuga. Pode ser mais conveniente transferir sobrenadantes para tubos de centrífuga menores para a etapa final.
  4. Despeje o concentrado ressuspenso em um cilindro volumétrico de vidro lavado adequado, complete o volume até o volume alvo (etapa 2.1) usando SEB frio adicional e misture suavemente.

3. Lise do concentrado de L. tarentolae

  1. Transferir o concentrado de células para o dispositivo de cavitação de azoto (ver Tabela de Materiais) pré-arrefecido a 4 °C, pressurizá-lo a 70 bar de azoto e incubar durante 45 minutos em gelo.
    NOTA: Embora os disruptores de cavitação de nitrogênio não sejam itens comuns de laboratório, eles são recomendados para a produção de LTE. Métodos alternativos, como congelamento e descongelamento celular e disruptores do tipo prensa francesa, foram tentados; no entanto, a atividade de expressão da proteína foi de <50% em comparação com o uso do método de cavitação de nitrogênio. O dispositivo de cavitação de nitrogênio deve ser cuidadosamente limpo antes do uso e entre as corridas, semelhante a todos os recipientes reutilizados que entram em contato com o lisado celular a partir desta etapa (como o frasco receptor). Um regime de limpeza adequado envolve a lavagem com detergentes de laboratório seguida de enxágue completo com água deionizada.
  2. Abra a ventilação do dispositivo de cavitação de nitrogênio e expulse o lisado resultante para um recipiente adequadamente robusto, como um frasco receptor de vácuo no gelo. Incline o frasco receptor para garantir que todo o lisado resultante assente e possa ser pipetado em um novo tubo de centrífuga ou em um recipiente semelhante.
    CUIDADO: Os disruptores de cavitação de nitrogênio dependem da transição abrupta do concentrado de células de 70 bar de nitrogênio para a pressão ambiente, obtida por meio de um forte fluxo de líquido primeiro e depois de nitrogênio através da válvula de saída do dispositivo. A ventilação deve ser feita com equipamento de proteção individual (EPI) apropriado em uma capa de segurança química. Existe o risco de quebrar o recipiente de destino e perder o lisado, e é por isso que usamos um receptor de vácuo robusto em vez de um frasco genérico. Se a válvula de saída do dispositivo for um tubo, evite colocar o tubo diretamente dentro do receptor para evitar o acúmulo excessivo de pressão no ponto de ventilação.

4. Centrifugação do lisado celular

  1. Transfira o lisado para tubos de centrífuga com força g adequada e centrifugue a 10.000 x g por 15 min a 4 °C. Remova o sobrenadante para tubos de centrífuga novos e semelhantes.
  2. Centrifugue o lisado a 30.000 x g durante 15 min a 4 °C e, em seguida, retire o sobrenadante final para um novo tubo de centrifugação ou um recipiente semelhante colocado sobre gelo. Estime o volume total.

5. Filtração em gel do lisado celular

NOTA: A filtração em gel é usada para remover a sacarose incluída no tampão SEB. Embora a sacarose auxilie na estabilização da maquinaria celular durante a ruptura celular, ela diminui o rendimento se retida nas reações de expressão de proteínas.

  1. Configure um número suficiente de colunas de filtragem de gel alimentadas por gravidade PD-10 (consulte a Tabela de Materiais) em um formato de rack que permita que elas gotejem em uma bandeja de coleta ou em um recipiente semelhante abaixo, garantindo que possam filtrar todo o volume de lisado a 2,5 mL por coluna. Pré-equilibre as colunas passando 10 mL de tampão EB a 4 ° C (45 mM HEPES-KOH pH 7,6, 100 mM KOAc, 3 mM Mg (OAc) 2) através delas de antemão.
    NOTA: Todas as etapas a partir deste ponto se beneficiam de serem conduzidas em uma câmara fria a 4 °C. No entanto, também é adequado manter todos os lisados e reagentes em uma bandeja de gelo de bancada. Uma exceção é a etapa de filtração do gel, na qual os autores colocam um rack de colunas dentro de uma geladeira a 4 ° C durante o rebuffering. Nas versões originais deste protocolo, novas colunas de filtração de gel foram 'bloqueadas' inicialmente tamponando o lisado e descartando a primeira saída. Embora tal não seja considerado necessário, as colunas devem ser lavadas com tampão EB e armazenadas a 4 °C entre os lotes de lisados. O primeiro lisado de saída pode ter menor atividade de expressão de proteína do que as saídas subsequentes devido a alguma retenção de fundo dos componentes do lisado na nova coluna.
  2. Adicione 2,5 mL de lisado a cada coluna e espere até que passe para a coluna. Adicione mais 0,5 mL de EB para depositar o lisado na coluna enquanto descarta o eluato.
  3. Eluir o lisado filtrado por gel adicionando mais 2,5 mL de EB a cada coluna, coletando a saída colocando uma bandeja nova e limpa ou outro recipiente sob as colunas.

6. Suplementação de lisado celular

  1. Use o espectrofotômetro nanodrop (consulte a Tabela de Materiais) para medir Abs280 nm do lisado filtrado por gel. Se exceder 60, dilua-o até atingir Abs280nm = 60 usando tampão EB adicional de 4 °C.
    NOTA: Embora o controle da entrada de densidade celular na interrupção usando OD600nm determine aproximadamente a força de saída do lisado, normalizar o Abs280nm após a interrupção e o processamento do lisado melhora ainda mais a consistência do lote do desempenho do lisado. O Lysate Abs280nm pode ser ajustado para cima e para baixo, com consequências para o rendimento e agregação da expressão da proteína (consulte a seção Discussão). Se o lisado não suplementado indicar um Abs280nm < 60, pode ser necessário incluir mais biomassa de Leishmania na etapa de interrupção, ou seja, aumentar a carga do disruptor celular para OD600nm > 300 na etapa 2.1.
  2. Adicione 5x Solução de Alimentação (5x FS, Tabela 1) ao lisado na proporção de 2:5 e misture bem o vórtice. Alicote em recipientes adequados (por exemplo, tubos de microcentrífugas de 1,5 mL) e congele-o em nitrogênio líquido. Se alguém estiver seguindo as etapas opcionais 7.1-7.3 para otimização de expressão LTE abaixo, use o rNTP.Mg reduzido 5x FS da Tabela 1 em vez do padrão 5x FS. Incluir alíquotas de 5 x 100 μL para congelação para utilização nas experiências de optimização.
    NOTA: O congelamento com o padrão 5x FS em uma proporção de 2:5 cria LTE suplementado pronto para expressão, usado na expressão de 7 μL/10 μL (portanto, o 5x FS torna-se 1x FS na reação final). No entanto, os autores recomendam seguir as etapas opcionais adicionais em que 0,6x a quantidade padrão de rNTPs e magnésio é fornecida no 5x FS. Isso é seguido por uma etapa de otimização em que uma combinação equimolar dos dois (conhecida como rNTP.Mg) é adicionada para completar as reações de teste para um valor otimizado. O 5x FS parcial também contém um oligonucleotídeo que desliga a expressão endógena de mRNA (consulte a seção Introdução). A sequência do oligonucleotídeo é CAATAAAGTACAGAAACTGATACTTATATAGCGTT.

7. CQ e otimização do LTE final suplementado

NOTA: As etapas mínimas necessárias para determinar a adição apropriada de rNTP.Mg ao rNTP reduzido e lisado suplementado com magnésio envolvem a expressão de eGFP ou um fluoróforo semelhante (por exemplo, sfGFP) sem um parceiro de fusão. Concentrações crescentes de rNTP.Mg são adicionadas às reações para determinar o ponto em que o nível de expressão (medido como eGFP RFU por meio de um leitor de placas multimodo) é otimizado. As terminações prematuras do eGFP, que não são fluorescentes, tornam-se evidentes pela diminuição do eGFP RFU em concentrações de rNTP.Mg muito altas. No entanto, o mau funcionamento do LTE por produto curto ocorre com mais frequência em proteínas expressas maiores (>50 kDa). Portanto, é possível realizar essa otimização usando um modelo maior do que o eGFP, especialmente se um estiver disponível em um vetor de expressão adequado, fornecendo uma fusão de fluoróforo que se deseja produzir por LTE para uma aplicação ou estudo específico (consulte a seção Resultados representativos).

  1. Descongele uma alíquota de 100 μL e estabeleça seis reações de expressão de 10 μL, cada uma composta de 7 μL de lisado parcialmente suplementado da etapa 6.2, 1 μL de solução de recarga conforme a Tabela 2 e 2 μL de água ultrapura contendo molde de controle de DNA suficiente para atingir uma concentração final de 50 ng / μL na reação.
  2. Incubar as reações durante 2 h a 25 °C e monitorizar o aumento da fluorescência GFP utilizando um leitor de placas multimodo.
    NOTA: Os valores de configuração adequados para GFP são excitação a 485 nm (largura de banda 5 nm), emissão a 516 nm (largura de banda 5 nm), com um intervalo de leitura de 1 min por 2 h.
  3. Classifique os valores finais da expressão para determinar a concentração de rNTP.Mg correspondente à RFU eGFP mais alta. Se os dados cinéticos estiverem disponíveis, um excesso de rNTP.Mg também será indicado por um aumento bifásico na RFU eGFP durante o período de expressão de 2 h (consulte a seção Resultados representativos).
  4. Uma vez determinada a concentração otimizada de rNTP.Mg de complementação, adicione-a a todas as outras expressões proteicas usando o lote de LTE que foi parcialmente suplementado nas etapas anteriores.
    NOTA: Se a alíquota na etapa 6.2 for feita cuidadosamente com volumes fixos, a recarga pode ser adicionada retrospectivamente a cada alíquota sem descongelar, por exemplo, com as alíquotas colocadas em gelo seco. Essas alíquotas agora são totalmente complementadas, pois a rNTP.Mg recarga correta será misturada em cada uma quando forem descongeladas e misturadas para uso.

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Resultados

O objetivo da expressão de proteínas livres de células é produzir proteínas de comprimento total em uma forma ativa dobrada adequada para uma ampla gama de aplicações. O LTE (extrato de Leishmania tarentolae ) já foi comparado a outros sistemas de expressão livre de células procarióticas e eucarióticas, demonstrando uma alta capacidade de evitar truncamento e agregação quando operando de maneira ideal, particularmente em comparação com a expressão livre de células baseada em E. coli 33...

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Discussão

Os protocolos para criação de LTE foram publicados na última década7 e passaram por atualizações periódicas25,34. No entanto, os recém-chegados à técnica geralmente encontram uma curva de aprendizado íngreme, resultando em atrasos na obtenção de expressão de proteínas de alta qualidade e alto rendimento. Desafios semelhantes foram relatados por outros grupos de pesquisa que trabalham com LTE

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Divulgações

Não estão presentes interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Os autores desejam reconhecer os muitos membros do laboratório Alexandrov que contribuíram para o desenvolvimento dos sistemas LTE nos últimos 10 anos, em particular Sergey Mureev, que foi pioneiro no sistema e desenvolveu o local de entrada do ribossomo SITS. A Figura 1 foi criada por Biorender.com e reproduzida sob licença.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
PD-10 SuperDex 25 ColunasCytiva17085101Colunas de filtração em gel
Disruptor celular de cavitação de nitrogênioParr Industries4635 ou 4639Disruptor de células
Hemin derivado de bovinoSigma-AldrichH5533Aditivo de cultura
Penicilina/Estreptomicina 10000U/mlThermo-Fisher15140122Mistura
de antibióticosOptiplate 384Perkin-Elmer6007290Placa multipoços para expressões de 10ul
Síntesede oligonucleotídeo  Oligo com sequência CAATAAAGTACAGAAACTGATAC
TTATATAGCGTT
Creatina FosfoquinaseSigma-Aldrich9001-15-4Enzima
Tecan SparkTecanou similar Leitor de placas multimodo
Chemidoc MP ImagerBioradou gel SDS-PAGE similar Imager
4-12% Géis Bis-Tris Géis
Invitrogen NW04125 SDS-PAGEBiofotômetroEppendorfou similar Espectrofotômetro de Cubeta
Nanodrop OneThermofisherEspectrofotômetro Nanodrop
Centrífuga Avanti JXN-26 CentrífugaBeckman Coulterou similar, com rotores/tubos classificados 10K e 50K g
Microcentrífuga 5424REppendorfou microcentrífuga similar, com tubos de microcentrífuga de 1,5ml
Incubadora de frascos Inova S44iEppendorfou agitador de incubadora de frascos similar adequado para frascos
5L FrascosFrascos de vidro defletores para crescimento de cultura
BactotriptonaBD211705Meio de
crescimento Extrato de leveduraMerckVM930053Meio de crescimento
GlicerolQualquer grau analítico
GlicoseQualquer grau analítico
KH2PO4Qualquer grau analítico
K2HPO4Qualquer grau analítico
UltraPure águaInvitrogen10977-015Ou saída de qualquer dispensador de água do tipo MilliQ
IDT de de cultura de vidro de 5L

Referências

  1. Nirenberg, M. W., Matthaei, J. H. The dependence of cell-free protein synthesis in E.coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides. Proc Natl Acad Sci USA. 47 (10), 1588-1602 (1961).
  2. Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
  3. Kelwick, R., Webb, A. J., MacDonald, J. T., Freemont, P. S. Development of a Bacillus subtilis cell-free transcription-translation system for prototyping regulatory elements. Metab Eng. 38, 370-381 (2016).
  4. Ezure, T., et al. Cell-free protein synthesis system prepared from insect cells by freeze-thawing. Biotechnol Prog. 22 (6), 1570-1577 (2006).
  5. Harbers, M. Wheat germ systems for cell-free protein expression. FEBS Letters. 588 (17), 2762-2773 (2014).
  6. Kobs, G. Selecting the cell-free protein expression system that meets your experimental goals. Promega Corporation. 21, 6-9 (2008).
  7. Kovtun, O., et al. Leishmania cell-free protein expression system. Methods. 55 (1), 58-64 (2011).
  8. Basile, G., Peticca, M. Recombinant protein expression in Leishmania tarentolae. Mol Biotechnol. 43 (3), 273-278 (2009).
  9. Mureev, S., Kovtun, O., Nguyen, U. T., Alexandrov, K. Species-independent translational leaders facilitate cell-free expression. Nat Biotechnol. 27 (8), 747-752 (2009).
  10. Gambin, Y., et al. Single-molecule fluorescence reveals the oligomerization and folding steps driving the prion-like behavior of ASC. J Mol Biol. 430 (4), 491-508 (2018).
  11. Sierecki, E., et al. Rapid mapping of interactions between human SNX-BAR proteins measured in vitro by AlphaScreen and single-molecule spectroscopy. Mol Cell Proteomics. 13 (9), 2233-2245 (2014).
  12. Sierecki, E., et al. Nanomolar oligomerization and selective co-aggregation of alpha-synuclein pathogenic mutants revealed by single-molecule fluorescence. Sci Rep. 6, 37630(2016).
  13. Leitao, A., Bhumkar, A., Hunter, D. J. B., Gambin, Y., Sierecki, E. Unveiling a selective mechanism for the inhibition of alpha-synuclein aggregation by beta-synuclein. Int J Mol Sci. 19 (2), 334(2018).
  14. Gambin, Y., et al. Single-molecule analysis reveals self assembly and nanoscale segregation of two distinct cavin subcomplexes on caveolae. Elife. 3, e01434(2013).
  15. Ve, T., et al. Structural basis of TIR-domain-assembly formation in MAL- and MyD88-dependent TLR4 signaling. Nat Struct Mol Biol. 24 (9), 743-751 (2017).
  16. Guo, Z., et al. Subunit organisation of in vitro reconstituted HOPS and CORVET multisubunit membrane tethering complexes. PLoS One. 8 (12), e81534(2013).
  17. Ruehrer, S., Michel, H. Exploiting Leishmania tarentolae cell-free extracts for the synthesis of human solute carriers. Mol Membr Biol. 30 (4), 288-302 (2013).
  18. Varasteh Moradi, S., et al. Mapping Interactions among cell-free expressed Zika virus proteins. J Proteome Res. 19 (4), 1522-1532 (2020).
  19. Gagoski, D., et al. Cell-free pipeline for discovery of thermotolerant xylanases and endo-1,4-beta-glucanases. J Biotechnol. 259, 191-198 (2017).
  20. Ergun Ayva, C., et al. Exploring performance parameters of artificial allosteric protein switches. J Mol Biol. 434 (17), 167678(2022).
  21. Lau, D., et al. Fluorescence biosensor for real-time interaction dynamics of host proteins with HIV-1 capsid tubes. ACS Appl Mater Interfaces. 11 (38), 34586-34594 (2019).
  22. Ryan, S. M., et al. Novel antiinflammatory biologics shaped by parasite-host coevolution. Proc Natl Acad Sci USA. 119 (36), e2202795119(2022).
  23. McMahon, K. A., et al. Identification of intracellular cavin target proteins reveals cavin-PP1alpha interactions regulate apoptosis. Nat Commun. 10 (1), 3279(2019).
  24. Sierecki, E., et al. A cell-free approach to accelerate the study of protein-protein interactions in vitro. Interface Focus. 3 (5), 20230018(2013).
  25. Johnston, W. A., Moradi, S. V., Alexandrov, K. Adaption of the Leishmania cell-free expression system to high-throughput analysis of protein interactions. Methods Mol Biol. 2025, 403-421 (2019).
  26. Jung, W., et al. Cell-free formation and interactome analysis of caveolae. J Cell Biol. 217 (6), 2141-2165 (2018).
  27. Fontaine, F. R., et al. Functional domain analysis of SOX18 transcription factor using a single-chain variable fragment-based approach. MAbs. 10 (4), 596-606 (2018).
  28. Overman, J., et al. Pharmacological targeting of the transcription factor SOX18 delays breast cancer in mice. Elife. 6, e21221(2017).
  29. Kubala, M. H., et al. Mammalian farnesyltransferase alpha subunit regulates vacuolar protein sorting-associated protein 4A (Vps4A)--dependent intracellular trafficking through recycling endosomes. Biochem Biophys Res Commun. 468 (4), 580-586 (2015).
  30. Han, S. P., et al. Cortactin scaffolds Arp2/3 and WAVE2 at the epithelial zonula adherens. J Biol Chem. 289 (11), 7764-7775 (2014).
  31. Das Gupta, K., et al. Class IIa histone deacetylases drive toll-like receptor-inducible glycolysis and macrophage inflammatory responses via pyruvate kinase M2. Cell Rep. 30 (8), 2712-2728.e8 (2020).
  32. Leitão, A. D. G., et al. Selectivity of protein interactions along the aggregation pathway of α-synuclein. BioRxiv. , (2021).
  33. Gagoski, D., et al. Performance benchmarking of four cell-free protein expression systems. Biotechnol Bioeng. 113 (2), 292-300 (2016).
  34. Johnston, W. A., Alexandrov, K. Production of eukaryotic cell-free lysate from Leishmania tarentolae. Methods Mol Biol. 1118, 1-15 (2014).
  35. Hunter, D. J. B., Bhumkar, A., Giles, N., Sierecki, E., Gambin, Y. Unexpected instabilities explain batch-to-batch variability in cell-free protein expression systems. Biotechnol Bioeng. 115 (8), 1904-1914 (2018).

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