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Summary

Aqui, apresentamos um método robusto de perfusão in situ do fígado de camundongos para estudar a regulação aguda e direta do metabolismo hepático sem perturbar a arquitetura hepática, mas na ausência de fatores extra-hepáticos.

Abstract

O fígado tem inúmeras funções, incluindo o metabolismo de nutrientes. Em contraste com outros modelos in vitro e in vivo de pesquisa hepática, o fígado perfundido isolado permite o estudo da biologia e metabolismo hepático em todo o fígado com uma arquitetura hepática intacta, separada da influência de fatores extra-hepáticos. As perfusões hepáticas foram originalmente desenvolvidas para ratos, mas o método também foi adaptado para camundongos. Descrevemos aqui um protocolo de perfusão in situ do fígado de camundongos. O fígado é perfundido anterógrado através da veia porta com tampão de bicarbonato de Krebs-Henseleit oxigenado, e o débito é coletado da veia cava inferior supra-hepática com pinçamento da veia cava inferior infra-hepática para fechar o circuito. Usando este método, os efeitos hepáticos diretos de um composto de teste podem ser avaliados com uma resolução temporal detalhada. A função e a viabilidade hepática são estáveis por pelo menos 3 h, permitindo a inclusão de controles internos no mesmo experimento. As possibilidades experimentais utilizando este modelo são inúmeras e podem inferir conhecimentos sobre a fisiologia hepática e doenças hepáticas.

Introduction

O fígado é um órgão essencial no metabolismo. Ele desempenha um papel fundamental no controle do equilíbrio energético de todo o corpo, regulando o metabolismo de glicose, lipídios e aminoácidos. O aumento das doenças hepáticas em todo o mundo está emergindo como um grande fardo global para a saúde, e mais conhecimento é necessário sobre a fisiopatologia e suas consequências para as funções hepáticas.

Vários modelos in vitro têm sido desenvolvidos para pesquisas no fígado para complementar os estudos in vivo. Hepatócitos primários isolados e cultivados de roedores e humanos são amplamente utilizados. Células não-parenquimatosas podem ser separadas de hepatócitos usando centrifugação diferencial e gradiente, e o co-cultivo de diferentes tipos celulares é útil para o estudo de crosstalk^{intercelular1}. Embora hepatócitos humanos primários sejam considerados o padrão-ouro para testar a toxicidade de drogas, vários estudos têm demonstrado que os hepatócitos se desdiferenciam rapidamente em cultura de tecidos, resultando em perda das funções hepáticas ^2,3,4. A cultura de hepatócitos em um sistema esferoide 3D melhora a desdiferenciação, é mais estável e parece mimetizar o fígado in vivo em maior grau do que os sistemas tradicionais de cultura 2D⁵. Os cortes hepáticos cortados com precisão são outro modelo in vitro bem estabelecido que mantém intacta a arquitetura tecidual e contém as células não parenquimatosas presentes no fígado⁶. Modelos in vitro mais avançados incluem fígado-em-um-chip⁷ e organoides hepáticos⁸. No entanto, com todas essas abordagens, há uma perda da integridade estrutural e da dinâmica do fluxo, incluindo o fluxo vetorial da veia porta-hepática, o que provavelmente impacta a generalizabilidade.

O fígado de rato perfundido isolado foi descrito pela primeira vez por Claude Bernard em 1855⁹, e ainda é usado em vários campos científicos para estudos de biologia hepática, toxicologia e fisiopatologia. As vantagens do fígado perfundido em relação aos modelos in vitro citados incluem a manutenção da arquitetura hepática, o fluxo vascular, a polaridade e zonação dos hepatócitos e as interações entre hepatócitos e células não parenquimatosas. Comparado a estudos in vivo, o fígado perfundido permite o estudo do metabolismo hepático de forma isolada evitando fatores extra-hepáticos transportados pelo sangue e com controle completo sobre as condições experimentais. Várias modificações têm sido feitas para melhorar o modelo de perfusão hepática de ratos ao longo dos anos^10,11,12,13. Embora camundongos tenham sido usados para estudos de fígado perfundido isolado, menos literatura está disponível. Apresentamos aqui um método de perfusão in situ do fígado de camundongos por canulação da veia porta e da veia cava supra-hepática inferior para estudar as respostas metabólicas agudas e diretas a substratos metabólicos e hormônios medidos no efluente venoso hepático do fígado de camundongos em tempo real.

Protocol

Todos os experimentos com animais foram realizados com permissão da Inspetoria Dinamarquesa de Experimentação Animal, Ministério do Meio Ambiente e Alimentação da Dinamarca (licença 2018-15-0201-01397), e do comitê de ética local de acordo com a diretiva da UE 2010/63/UE, os Institutos Nacionais de Saúde (publicação nº 85-3) e seguindo as diretrizes da legislação dinamarquesa que rege a experimentação animal (1987). Trata-se de um procedimento terminal, cuja causa de morte é exsanguinação e perfuração do diafragma sob anestesia profunda. 1. Animais de experimentação Obter camundongos da linhagem desejada, idade e sexo. Este estudo utilizou camundongos machos C57BL/6JRj com idade entre 11 e 16 semanas. Abrigar até 5 camundongos machos ou 8 fêmeas por gaiola com acesso ad libitum à ração e água e manter um ciclo claro-escuro de 12 h/12 h com luzes acesas das 6h às 18h. 2. Preparações pré-operatórias Faça tampão de perfusão hepática.Tampão de Krebs-Henseleit. Misturar e dissolver 118 mmol/L de NaCl, 4,7 mmol/L de KCl, 1,2 mmol/L de MgSO 4 e 1,2 mmol/L de KH 2 PO4 em dH 2 O. Dissolva 1,25 mmol/L de CaCl2num copo separado e adicione o tampão. Dissolver 25 mmol/L NaHCO3 e adicionar lentamente ao tampão enquanto agita. Guarde o buffer a 4 graus. O buffer é estável por pelo menos 1 mês.NOTA: Pode ocorrer precipitação se CaCl2 e NaHCO3 não forem dissolvidos individualmente antes de serem adicionados. Filtrar o tampão de perfusão através de um filtro de 2 μm e ajustar o pH para 7,5 usando HCl.OBS: Esta etapa deve ser realizada no dia do experimento, pois o pH aumenta com o tempo, mesmo quando armazenado em frascos fechados. Preparar compostos de teste em uma concentração maior do que a concentração final desejada (por exemplo, concentração de 20x quando infundido a uma taxa de 0,175 mL/min através de uma bomba lateral) em tampão de perfusão Krebs-Henseleit filtrado e ajustado ao pH. Se for caso disso, diluir os compostos de ensaio em tampão de perfusão Krebs-Henseleit com 1% de BSA adicionado como transportador (para evitar a adesão a tubos e vidros, essenciais para todos os péptides), filtrados através de um filtro de tamanho adequado. 3. Operação e perfusão OBS: A Figura 1 ilustra o arranjo perfusional utilizado neste estudo. Gaseie o tampão de perfusão (95% O 2, 5% CO2) por pelo menos 30 min para fornecer oxigênio suficiente ao fígado e manter o pH correto desde o início da operação (o sistema tampão de bicarbonato atingirá um pH de 7,4 sob gaseificação contínua, ver Figura Suplementar 1). Anestesiar camundongos administrando cetamina (90 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) por injeção intraperitoneal. Coloque o rato em decúbito dorsal sobre uma mesa de operação aquecida e confirme a ausência de reflexos em resposta ao pinçamento do dedo do pé. Borrife com etanol 70% para evitar que o cabelo grude na tesoura. Fixar o mouse na superfície quente ajuda a aumentar a estabilidade para os procedimentos a seguir. Faça uma incisão com tesoura na base do abdômen e corte para cima até a caixa torácica de ambos os lados para expor a cavidade abdominal. Mova os intestinos para a direita usando um cotonete, expondo a veia porta. Coloque duas ligaduras sob a veia porta usando pinça curva e prepare um nó solto para cada ligadura. Insira um cateter de 0,7 mm na veia porta. Quando perfurada, retire a agulha do cateter e guie-o pela veia até que a ponta do cateter esteja próxima ao fígado, conforme ilustrado na Figura 2. O sangue flui para o cateter. Aperte as ligaduras. Se o cateter não estiver cheio de sangue, preencha-o com tampão de perfusão para evitar a introdução de uma bolha de ar. Conectar o tubo de perfusão e iniciar a perfusão do fígado com tampão de bicarbonato Krebs-Henseleit a 37 °C ligando a bomba de roletes a uma taxa de fluxo de perfusão de 0,8 mL/min. O fígado fica pálido em segundos. Corte a caixa torácica e o diafragma com uma tesoura. Neste momento, o animal é sacrificado. Coloque uma ligadura sob a veia cava inferior supra-hepática usando pinça de ponta fina. Coloque uma caneta, gaze enrolada ou outro item descartável sob a parte de trás do mouse para tornar a veia mais acessível. Insira um cateter na veia cava inferior supra-hepática através do átrio direito do coração. Quando perfurado, remova a agulha do cateter e guie o cateter através da veia até que a ponta do cateter esteja próxima ao fígado. O tampão de sangue e perfusão se esgota imediatamente. Apertar a ligadura e fixar um tubo para a coleta do efluente de perfusão. Fixe todos os tubos com fita impermeável (fita adesiva ou similar). Utilizar um adaptador de pinça de vaso para colocar uma pinça de vaso através da veia cava infra-hepática imediatamente acima da veia renal direita para evitar a mistura (Figura 2). Aumentar o fluxo de perfusão para 3,5 mL/min e iniciar um temporizador. Inicie a gravação de pressão. A perfusão bem-sucedida geralmente resulta em uma pressão de ~10 mm/Hg. Cubra o fígado com um pano estéril umedecido com soro fisiológico e adicione soro fisiológico durante o experimento para evitar que ele seque. Coletar o efluente de perfusão por 1 min e medir o volume. O volume deve ser de aproximadamente 3,5 mL/min. A mistura de sangue não é esperada nesta fase, e o coração não bombeia mais. Aguarde um período de equilíbrio de 30 min antes de iniciar o experimento. Figura 1: Ilustração do setup da perfusão. (A)A mesa cirúrgica é elevada sobre um suporte de tripé e aquecida a 37 °C. O tampão de perfusão é gaseificado (95% O 2, 5% CO2), bombeado através de uma bomba de rolos peristálticos e aquecido no trocador de calor com uma armadilha de bolhas integrada. O sistema também é composto por um manômetro e uma bomba de fuso para ajuste da pressão de perfusão. A pressão de perfusão é continuamente registrada e visualizada através de um transdutor em um PC, um programa de registro de pressão. (B) A caixa vermelha capta as conexões das torneiras de três vias. A primeira torneira de três vias é aberta para a infusão de um composto de teste através de uma bomba de seringa, e a segunda é fechada. O terceiro está aberto para medições contínuas de pressão. A quarta torneira pode ser usada para coletar amostras de entrada, por exemplo, análise de gás em todo o fígado perfundido. Os conectores podem ser modificados conforme necessário para experimentos específicos que exigem mais ou menos linhas de infusão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Fotos da cavidade abdominal de camundongos antes e durante a perfusão hepática. (A) O ponto verde indica a localização da ponta do cateter da veia porta. É importante que a ponta do cateter seja posicionada logo abaixo do ponto de ramificação da veia porta para as veias porta hepáticas esquerda e direita, mas acima do ramo pancreatoduodenal para evitar vazamento. O ponto amarelo indica a localização correta da pinça do vaso na veia cava inferior infra-hepática entre a veia renal direita e o fígado para evitar o refluxo de sangue para o fígado perfundido. (B, C) Fígado de camundongo perfundido com os dois cateteres inseridos na veia porta (B) e veia cava inferior supra-hepática (C) e pinça do vaso na veia cava inferior infra-hepática (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 4. Experiência Iniciar o experimento coletando as primeiras amostras basais usando um coletor de fração no final do período de equilíbrio. Coletar amostras no intervalo de tempo desejado e colocá-las no gelo imediatamente. Verifique o coletor de bolhas regularmente e encha novamente com tampão de perfusão quando estiver perto de vazio. Coletar uma amostra do tampão através de uma torneira de três vias imediatamente antes de entrar no órgão e do cateter coletor inserido na veia cava inferior (depois de ter sido perfundido através do fígado). Medir as amostras com um analisador de gases sanguíneos para confirmar que o órgão está metabolicamente ativo (indicado por um aumento na pressão parcial de CO2 e uma diminuição no pH). Repetir as etapas 4.3-4.4 no final do experimento para avaliar a viabilidade ao longo do experimento (Figura 2 Suplementar).NOTA: A diminuição da pressão parcial de oxigênio não fornece uma medida confiável da respiração por causa das perdas de oxigênio da tubulação, do órgão etc. Após 15 minutos de perfusão basal, inicie a primeira estimulação através da infusão de uma substância de ensaio através de uma torneira de três vias à taxa de fluxo desejada utilizando uma bomba de seringa (por exemplo, concentração de 20x da substância em estudo quando infundida a uma taxa de 0,175 ml/min através de uma bomba lateral). Em alternativa, mude o tampão de base para um novo tampão (oxigenado e aquecido) contendo o composto de ensaio na concentração final. Pare a estimulação e colete amostras basais por 20-30 minutos antes de iniciar a segunda estimulação. Ao final do experimento, infundir um controle positivo apropriado por 5-10 min. Após o experimento, excique o fígado perfundido e pese-o para normalizar a saída para o peso do fígado. Congelar o fígado em nitrogênio líquido para medição potencial do conteúdo de proteína para normalizar a saída para o conteúdo de proteína. 5. Medições bioquímicas Quantificar a concentração da molécula de interesse usando ensaios apropriados para medições em tampão de perfusão (ensaios colorimétricos ou ELISA internos ou comercialmente disponíveis). O tampão é compatível com a maioria das técnicas baseadas em ômica, como metabolômica e proteômica.OBS: Neste estudo, a ureia foi medida com base em ensaio colorimétrico previamente descrito14. Glicose e ácidos graxos não-esterificados foram quantificados usando kits comercialmente disponíveis. 6. Análise dos dados Apresente os dados em gráficos XY mostrando a saída secretora ao longo do tempo.NOTA: É uma das virtudes do sistema de perfusão in vitro que é possível expressar dados como a saída real (concentração × vazão, por exemplo, μmol/min) em vez da concentração medida na saída (mmol/L) como em estudos in vivo . Considere normalizar a saída para o peso do fígado ao comparar diferentes modelos de camundongos ou para o conteúdo de proteína total (medido por BCA) ao comparar camundongos controle com modelos de camundongos com obesidade ou doenças hepáticas onde um aumento no peso do fígado pode ser devido ao aumento do conteúdo de gordura. Apresentar dados resumidos como pontos individuais por animal representando a saída média ou total durante a linha de base e durante um período de estimulação (tipicamente 15-30 min) ou saída incremental usando a linha de base anterior para cada período de estimulação, dependendo do desenho do estudo. Analise os dados usando teste t pareado (dois grupos) ou ANOVA unidirecional com estímulos repetidos (mais de dois grupos) com um teste post-hoc apropriado para testes múltiplos.

Representative Results

Uma linha de base estável é necessária para determinar se um estímulo ou substrato leva à liberação da molécula de interesse. A Figura 3A mostra um exemplo de experimento bem-sucedido. A produção de ureia no fígado perfundido é medida em intervalos de 2 min e mostrada como média ± EPM. Os períodos basais que precedem cada um dos dois períodos de estimulação são estáveis. A produção média de ureia durante os dois períodos de estimulaç?…

Discussion

O fígado isolado de camundongos perfundidos é uma forte ferramenta de pesquisa para estudos da dinâmica e mecanismos moleculares do metabolismo hepático. A possibilidade de coleta minuto-a-minuto de amostras fornece uma avaliação detalhada do efeito direto de um composto teste no fígado. Comparado a estudos in vivo, o fígado perfundido permite estudar o metabolismo hepático de forma isolada evitando fatores extra-hepáticos transportados pelo sangue e com controle completo sobre as condições experimen…